Traitement par lumière infrarouge non thermique des lésions d’ischémie/reperfusion et analyse ultérieure de la différenciation des macrophages

Nous décrivons la réduction des lésions de reperfusion par irradiation à 670 nm dans un modèle murin d’ischémie et de reperfusion par mise en place d’un garrot. Cette irradiation de 670 nm a réduit la réponse inflammatoire, diminué le nombre de macrophages pro-inflammatoires et augmenté les macrophages protecteurs.

Les lésions tissulaires et la nécrose dues aux processus inflammatoires sont une conséquence des lésions d’ischémie et de reperfusion (IRI). Dans le muscle squelettique, l’ischémie réduit la capacité énergétique aérobie des cellules musculaires, entraînant des altérations biochimiques défavorables et une inflammation. Le but de cette étude est de montrer que l’exposition à la lumière proche infrarouge (NIR) pendant une période d’ischémie réduit l’IRI en diminuant la nécrose et l’inflammation en plus de diminuer les macrophages pro-inflammatoires M1 et d’augmenter les macrophages protecteurs M2. Les souris C57/Bl6 ont subi une ischémie unilatérale des membres postérieurs induite par un garrot pendant 3 heures, suivie d’une reperfusion pendant 15 ou 30 minutes. Les souris ont été réparties au hasard en 3 groupes. Le groupe 1 a subi une IRI avec une reperfusion de 30 minutes. Le groupe 2 a subi une IRI avec une reperfusion de 15 minutes. Chaque groupe était composé de 50 % de souris sans NIR et de souris traitées à 50 % avec une exposition de 50 mW/cm² pendant 5 min/1 h après la fermeture du garrot. Le groupe 3 était constitué d’animaux fictifs anesthésiés pendant 3 heures, en omettant l’IRI.

Une imagerie laser Doppler a été réalisée sur toutes les souris pour confirmer l’ischémie et la reperfusion. Les données de débit ont été exprimées en rapport entre le membre ischémique et le contrôle controlatéral. Les souris ont été euthanasiées après reperfusion, et les quadriceps et le gastrocnémien ont été récoltés. Une immunoprécipitation et un western blot des marqueurs macrophages CD68 (M1) et CD206 (M2) ont été réalisés et normalisés à l’expression de CD14. L’expression des marqueurs inflammatoires CXCL1 et CXCL5 a été significativement réduite par le NIR dans le groupe IRA. Une diminution significative de CD68 et une augmentation de l’expression de CD206 ont été observées chez les animaux recevant l’IR et le NIR. La nécrose tissulaire a été diminuée par le NIR dans le groupe IRI, comme le montre la coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC). Les résultats démontrent que l’exposition au NIR réduisait l’IRI et améliorait la survie des tissus. Le NIR a réduit l’inflammation, diminué les macrophages M1 pro-inflammatoires et augmenté les macrophages M2 protecteurs. L’exposition au proche infrarouge réduit l’inflammation et améliore la régénération, ce qui entraîne une protection des tissus après une ischémie.

La lésion d’ischémie et de reperfusion (IRI) est un défi clinique observé à la suite de lésions vasculaires et de l’utilisation prolongée de garrots chirurgicaux. Des études antérieures ont montré que 60 à 90 minutes est le seuil supérieur pour le temps d’ischémie chaud, au-delà duquel des lésions tissulaires irréversibles peuvent survenir. Plus que tout autre facteur, les limites du temps d’ischémie chaude limitent le succès et le sauvetage de la réimplantation des membres dysvasculaires ^1,2.

Dans le muscle squelettique, l’ischémie réduit la capacité aérobie des cellules, entraînant une inflammation aiguë et des altérations biochimiques défavorables. Ces effets sont aggravés par la reperfusion, qui stimule le recrutement des neutrophiles et la production de radicaux libres, endommageant davantage le muscle squelettique. Cela peut se produire à partir d’une occlusion vasculaire, qu’il s’agisse du résultat d’une blessure ou de l’utilisation intentionnelle d’un garrot pour prévenir une hémorragie. Certains des médiateurs clés de ce processus sont la myéloperoxydase (MPO), une enzyme exprimée par les neutrophiles qui fait partie intégrante de la fonction respiratoire et de la production de radicaux libres³, et les chimiokines telles que CXCL1 et CXCL5 qui servent à recruter des neutrophiles sur les sites d’inflammation aiguë⁴.

L’artère fémorale n’a pas été disséquée pour imiter un garrot ouvert en cas d’urgence. Cette approche est également basée sur la reproductibilité de la création d’une ischémie et d’une reperfusion ainsi que sur une zone exempte de sang constante. Des recherches antérieures ont démontré que l’exposition à la lumière infrarouge non thermique (NIR) d’une longueur d’onde de 670 nm peut augmenter la collatéralisation vasculaire dans un membre postérieur ischémique de souris exposé au NIR pendant des jours, atténuant ainsi les effets de l’IRI⁵. De plus, des recherches antérieures ont démontré que la lumière NIR peut induire la polarisation des macrophages en phénotypes⁶ pro-inflammatoires (M1) ou pro-cicatrisants (M2).

Tout traitement capable de minimiser les lésions tissulaires et la mort cellulaire après l’hypoxie et la reperfusion serait bénéfique pour augmenter le succès du sauvetage des membres après des lésions vasculaires. Par conséquent, l’objectif global est d’améliorer l’IRI en introduisant un traitement à la lumière de 670 nm comme une option viable à d’autres modalités de traitement. Cet article est basé sur l’hypothèse que l’exposition à la lumière NIR pendant une période d’ischémie diminue l’inflammation et la nécrose tissulaire en diminuant la sécrétion de protéines chimioattractantes et l’afflux de cellules inflammatoires en induisant les macrophages à prendre un phénotype M2.

Cette étude a été réalisée dans le strict respect des recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (Protocole : AUA#1517). Toutes les recherches impliquant des souris ont été menées conformément à la politique du PHS.

1. Placement du garrot

REMARQUE : Un garrot a été placé pour induire une ischémie et obtenir un champ chirurgical exempt de sang.

1. Anesthésier une souris C57/Bl6 avec de l’isoflurane dans la chambre d’induction à une concentration de 3 à 5 %.
2. Retirez la souris de la chambre d’induction lorsqu’elle ne répond pas aux pincements des orteils. Placez la souris dans un cône nasal pour une anesthésie continue à 1,5-2 % sur un coussin chauffant avec un tapis non réfléchissant sous un imageur laser Doppler (LDI).
3. Placez le garrot autour de la patte arrière gauche (Figure 1).
   REMARQUE : Ne fermez pas encore le garrot. Mesurez d’abord le débit sanguin (voir rubrique 2).

2. Mesure du débit sanguin par LDI

REMARQUE : Le débit sanguin a été mesuré pour confirmer une occlusion et une reperfusion correctes comme décrit précédemment⁷.

1. Placez la souris anesthésiée sous l’ILD (26 cm) sur un coussin chauffant avec une surface non réfléchissante en position couchée, les pattes tendues et les pattes vers le haut.
2. Capturez des images en plaçant la souris dans la zone de capture du laser (16,1 cm x 16,1 cm).
   1. Réglez le laser à une vitesse de balayage de 4 ms/pixel. Capturez des images avec le logiciel propriétaire en appuyant sur le bouton d’enregistrement . Prenez des images avant, pendant l’occlusion et pendant la reperfusion en cliquant sur le bouton d’enregistrement .
      REMARQUE : Les images sont des images cartographiques liées au flux ; le rouge est une bonne circulation sanguine ; Le bleu n’est pas une circulation sanguine. Confirmez sur l’image que le membre postérieur occlus est bleu. De même, vérifiez l’image pour confirmer que le membre postérieur précédemment occlus est rouge lors de la reperfusion. Il est impératif d’avoir un tapis non réfléchissant pour l’ILD ; Sinon, la réflexion affectera les images.
3. Analysez les images avec le logiciel fourni en définissant une région d’intérêt. Établir un rapport entre les jambes ischémiques et les jambes témoins.

3. Protocole d’ischémie et de reperfusion

1. Fermez le garrot autour de la patte postérieure de la souris anesthésiée pendant 3 h.
   REMARQUE : Le serrage du garrot crée une ischémie, interrompant la circulation sanguine.
2. Ouvrir le garrot après 3 h d’occlusion ; Ouvrez et perfuser la patte postérieure pendant 15 ou 30 min.

4. Prélèvement de tissus

1. Augmentez l’anesthésie à 5 % d’isoflurane pour anesthésier en profondeur les souris. Effectuez un pneumothorax en ouvrant la cavité thoracique avec des ciseaux tranchants pour assurer la mort. Récoltez les gastrocnémiens et les muscles quadriceps ^8,9,10.
2. Congelez rapidement les tissus collectés dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C pour une analyse plus approfondie.

5. Application du RIN

REMARQUE : Le NIR est appliqué pour réduire l’inflammation et réduire les lésions de reperfusion.

1. Appliquer 670 nm NIR à une intensité de 100 mW pendant 5 min une fois par heure pendant l’occlusion.
2. Ciblez le membre postérieur avec la source lumineuse à fibre optique à une distance de 2,5 cm entre le membre postérieur et la lumière. N’exposez pas la jambe controlatérale au proche infrarouge (voir la figure 1 pour la configuration).
3. Faites briller la lumière NIR pendant 5 minutes par heure pendant toute la durée de la période ischémique.
4. Instrumentez le groupe fictif de la même manière. Ne fermez pas le garrot et n’appliquez pas de NIR sur la patte arrière.
   REMARQUE : La lumière NIR a un dissipateur thermique. La température n’augmente pas dans les 5 minutes suivant l’exposition à la lumière¹¹.

6. Nécrose TTC

REMARQUE : La nécrose tissulaire est évaluée pour visualiser la réduction de la nécrose dans le tissu musculaire.

1. Colorer les muscles quadriceps frais avec un TTC à 37 °C pendant 20 à 30 min dans un tampon phosphate de 1 % dans 0,1 M ajusté à pH 7,4.
2. Observez des tissus vivants rouges et colorés en fonction de la présence d’un précipité de formazan.
   REMARQUE : La coloration rouge est basée sur la réduction de la TTC par les enzymes déshydrogénases dans les tissus sains. Le tissu nécrotique n’est pas coloré¹⁰.
3. Capturez des images de coupes colorées par TTC pour analyse et mesurez la région nécrotique en définissant une région d’intérêt.

7. Analyse occidentale de la chlorotyrosine

1. Soumettre les souris au protocole d’ischémie/reperfusion (section 3).
2. Prélever les tissus (rubrique 4) et isoler les protéines comme décrit précédemment¹². Déterminer la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford¹³.
3. Utilisez le lysat de protéines totales pour effectuer l’électrophorèse et le transfert pour la 3-chlorotyrosine comme décrit précédemment¹².
4. Effectuer un western blot sur les lysats des gastrocnémies.
   1. Ajouter aux échantillons un tampon d’échantillon Laemmli contenant 5 % de mercaptoéthanol pour obtenir une concentration de 25 μg de protéines totales dans 40 μL.
   2. Analysez les échantillons sur un gel prolongé de tris-glycine à 4-15 % (voir le tableau des matériaux) à 50 mV pendant 5 min. Augmentez la tension à 100 mV pendant 1 h jusqu’à ce que la face avant du colorant soit épuisée.
5. Incuber le gel dans 1 tampon de transfert (25 mM de Tris, 190 mM de glycine, 20 % de méthanol ; ajuster le pH à 8,3 si nécessaire) pendant 10 min.
6. Assemblez le sandwich de transfert (éponge, filtre, gel, membrane cellulosique, filtre, éponge). Placez un bloc réfrigérant réutilisable dans l’appareil de transfert. Transfert de 30 min dans la chambre froide à 100 mA.
   REMARQUE : Assurez-vous qu’aucune bulle n’est piégée dans le sandwich de transfert, que le blot est sur la cathode et le gel sur l’anode.
7. Rincez le tampon et bloquez-le dans un tampon de blocage (voir le tableau des matériaux) avec 0,05 % de Tween pendant 30 min à température ambiante. Lavez le transfert avec une solution saline tamponnée au Tris (TBS) contenant 5 % de Tween trois fois pendant 5 minutes chacune avant d’ajouter l’anticorps primaire.
8. Incuber pendant la nuit avec les anticorps polyclonaux primaires contre la 3-chlorotyrosine. Diluer les anticorps dans le tampon de blocage avec 0,05 % de Tween (1:1 000).
9. Utilisez des IgG anti-souris conjuguées à la peroxydase de raifort (HRP) et des IgG anti-chèvres HRP (dilution 1:10 000) comme anticorps secondaires.
10. Visualisez les bandes d’identité dans les transferts à l’aide d’un réactif de chimiluminescence améliorée (ECL) et d’un système d’imagerie.
    1. Mélanger les composants selon le protocole du fabricant et les incuber avec le blot pendant 3 min pour lier les réactifs ECL aux bandes d’intérêt.
    2. Imagez le transfert à l’aide d’un système d’imagerie (voir le Tableau des matériaux). Utilisez un logiciel d’imagerie tel qu’ImageJ pour mesurer la masse volumique et normaliser les valeurs de densité des bandes d’intérêt par rapport à celles des bandes de contrôle.

8. ELISA pour CXCL1 et CXCL5

1. Isolez les protéines totales des muscles gastrocnémiens comme décrit précédemment¹².
2. Évaluer le degré d’inflammation par ELISA pour CXCL1 et CXCL5 comme décrit précédemment¹⁴ et conformément aux instructions du fabricant.

9. Immunoprécipitation suivie d’une analyse occidentale

1. Soumettre les souris au protocole d’ischémie/reperfusion (rubrique 3).
2. Prélever les tissus (section 4) et isoler les protéines comme décrit précédemment¹². Déterminer la concentration en protéines à l’aide du test Bradford¹³.
3. Pour concentrer la fraction macrophage du lysat protéique total, effectuez une immunoprécipitation pour CD14 comme décrit précédemment¹⁵.
4. Utilisez l’immunoprécipité CD14 pour effectuer l’électrophorèse et le transfert pour CD206 et CD68 comme décrit précédemment¹².
5. Effectuer un western blot sur les lysats des gastrocnémies comme décrit dans la rubrique 7.
6. Incuber les immunoprécipités pendant la nuit avec les anticorps polyclonaux primaires dirigés contre CD206 ou CD68. Diluer les anticorps au 1:200 dans le TBS.
7. Utilisez des IgG anti-souris d’âne conjuguées à la HRP et des IgG anti-chèvre HRP (dilution 1:10 000) comme anticorps secondaires.
8. Appliquez le réactif ECL sur le transfert après avoir mélangé les composants selon le protocole du fabricant et incubez pendant 3 min pour visualiser les bandes d’intérêt. Imagez la tache à l’aide d’un système d’imagerie.

10. Analyse statistique

1. Effectuer une analyse statistique des données à l’intérieur et entre les groupes avec analyse de variance (ANOVA) pour les mesures répétées suivies de la modification de Bonferroni du test t de Student, p ≤ 0,05.
2. Exprimer les données sous forme de moyenne ± d’erreur type de la moyenne (SEM) ou de moyenne ± d’écart-type (SD).

Les mesures de débit ont confirmé l’ischémie et la reperfusion
Le placement de la lumière NIR et le protocole expérimental sont illustrés à la figure 1. Un modèle murin d’ischémie des membres postérieurs a été développé et utilisé pour évaluer l’effet de l’exposition au NIR sur l’IRI du muscle squelettique. Comme prévu, l’imagerie par flux laser Doppler (figure 2A) a vérifié que...

Cet article décrit l’une des premières études à se concentrer sur la réduction des lésions de reperfusion par le traitement par lumière NIR en modifiant la réponse inflammatoire dans les membres postérieurs. Les lésions de reperfusion d’ischémie et le traitement par la lumière NIR ne sont pas tout à fait nouveaux. D’autres études se sont concentrées sur la reperfusion de l’ischémie par la lumière NIR. Le traitement par la lumière NIR a été utilisé avec succè...

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Nous remercions le Département de chirurgie orthopédique d’avoir financé cette étude. Nous remercions également Brian Lindemer et Grant Broeckel pour leur soutien technique.