JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.
Method Article
수지상 세포(DC)는 리슈마니아 감염에 대한 선천성 면역의 필수 구성 요소입니다. DC와 리슈마니아 사이의 복잡한 상호 작용의 기저에 있는 메커니즘은 잘 이해되지 않은 상태로 남아 있습니다. 여기에서는 리슈마니아 감염이 이동 관련 및 공동 자극 분자 발현과 같은 인간 DC의 면역생물학적 기능에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 방법을 설명합니다.
리슈마니아증은 의무적인 세포 내 원생동물인 리슈마 니아의 감염과 관련된 임상 증상의 집합체로 구성됩니다. 리슈마니아 기생충의 생활사는 두 개의 교대 생애 단계(amastigotes 및 promastigotes)로 구성되며, 이 기간 동안 기생충은 각각 절지동물 매개체 또는 척추동물 숙주 내에 거주합니다. 특히 리슈마니아 기생충과 면역 체계의 여러 세포 사이의 복잡한 상호 작용이 감염 결과에 큰 영향을 미칩니다. 중요한 것은 대식세포가 리슈마니아 복제의 주요 숙주 틈새 시장으로 알려져 있지만, 기생충은 호중구 및 수지상 세포(DC)와 같은 다른 선천성 면역 세포에 의해서도 식세포화된다는 것입니다.
DC는 선천성 면역 및 적응 면역 가지를 연결하는 데 중요한 역할을 하여 광범위한 병원체에 대한 면역 반응을 조율합니다. 리슈마니아 와 DC가 상호 작용하는 메커니즘은 불분명하며 병원체 포획, DC 성숙 및 활성화의 역학, 배액 림프절(dLN)로의 DC 이동, T 세포에 대한 항원 제시 등의 측면을 포함합니다. 많은 연구에서 DC가 리슈마니아에 대한 면역 반응을 조절하는 데 이중 역할을 한다는 개념을 뒷받침하고 있지만, 리슈마니아 에 대한 감수성 또는 저항에 대한 이러한 세포의 참여는 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 감염 후, DC는 공동 자극 분자(즉, CD40, CD80 및 CD86) 외에도 표면 주요 조직 적합성 복합체(MHC) II의 상향 조절과 관련된 성숙 과정을 거칩니다.
감염 결과에서 DC의 역할을 이해하는 것은 리슈마니아에 대한 면역 반응을 조절하기 위한 치료 및 예방 전략을 개발하는 데 중요합니다. 이 논문은 리슈마니아-DC 상호 작용의 특성화 방법을 설명합니다. 이 상세한 프로토콜은 DC 분화, 세포 표면 분자의 특성화 및 감염 프로토콜 단계 전반에 걸쳐 지침을 제공하여 과학자들이 리슈마니아 감염에 대한 DC 반응을 조사하고 감염 과정에서 이러한 세포가 수행하는 역할에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다.
리슈 마니아 증은 리슈 마 니아 속1의 다른 종에 의해 유발되는 방치 된 질병의 복합체를 구성합니다. 리슈마니아(Leishmania )는 트리파노소마티과(Trypanosomatidae)의 세포 내 원생동물로 인간과 다른 포유류를 감염시켜 피부 병변에서 내장 형태에 이르기까지 다양한 질병을 유발합니다2. 이 질병의 주요 임상 증상은 피막성 리슈마니아증(TL)과 내장 리슈마니아증(VL)입니다. 세계보건기구(WHO)는 매년 700,000명에서 100만 명의 새로운 감염 사례가 발생하여 매년 70,000명이 사망하는 것으로 추정합니다2. 전 세계적으로 리슈마니아증은 약 1,200만 명에서 1,500만 명에게 영향을 미치며, 3억 5,000만 명이 이 질병에 걸릴 위험에 처해 있습니다3.
Leishmania 속은 promastigote와 amastigote4의 두 가지 진화 형태를 나타냅니다. Leishmania promastigotes는 편모의 존재와 높은 운동성을 특징으로합니다. 이러한 형태는 모래 파리의 소화관에서 발견되며, 감염 형태 (metacyclic promastigotes)로 분화를 거칩니다 5. 대조적으로, 아마스티고트는 감염된 포유류 세포의 세포 내 환경에서 발견됩니다. 이 진화적 형태는 차례로 식세포(phagocytic cells)의 식리소좀(phagolysosome)에서 복제됩니다6.
Leishmania spp.의 전염 주기는 혈액을 공급하는 동안 시작되며, 모래파리가 숙주의 피부에 메타고리클릭 전구물을 접종할 때1. 리슈마니아 접종 직후, 호중구와 조직에 상주하는 대식세포를 포함한 선천면역세포가 기생충을 식세포화합니다. 기생충 액포 내부에서 리슈마니아는 아마스티고트로 분화하고 복제되어 숙주 세포막의 파열로 절정에 이르며, 이로 인해 주변 세포의 감염과 기생충이 퍼질 수 있습니다4. 이 주기는 플레보토민(phlebotomines)이 아마스티고트(amastigote)를 함유한 식세포(phagocyte)를 섭취할 때 완료되며, 이 식세포는 곤충의 장관(intestinal tract)에서 프로사이클릭 프로마스티고트(procyclic promastigote)로 분화하고 나중에는 곤충의 장관(intestinal tract)에서 메타고리 프로마스티고트(metacyclic promastigote)로 분화한다7.
조직과 림프절에서 발견되는 전문 항원 제시 세포인 수지상 세포(dendritic cell)는 면역 체계의 파수꾼 역할을 합니다8. 이 세포는 미성숙 단계의 말초 조직에서 발견되며 주로 항원 포획 및 처리에 관여합니다. 병원체와 접촉한 후 DC는 림프절로 이동하는 성숙 과정을 거쳐 순진한 CD4+ T 세포에 항원을 제시합니다. 이 세포는 또한 내성 또는 염증을 유발하는 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 조절하는 데 필수적입니다9. DC 성숙 과정에는 MHC 및 CD40 및 CD86과 같은 공동 자극 분자의 발현 증가, 향상된 사이토카인 분비 등 여러 측면이 포함됩니다. DC는 CD11b 및 CD11c를 포함한 다양한 마커를 발현하며, 인간의 경우 CD14+ 단핵구(moDC)에서 유래한 DC가 CD1a10을 발현합니다. CCR7은 DC에서 많이 발현되며 이러한 세포의 복잡한 이동 과정을 나타냅니다12. CD209 및 CD80은 또한 DC 및 림프구와의 초기 접촉에서 중요한 역할을 합니다13.
리슈마니아증(leishmaniasis)에서 연구에 따르면 moDC는 식세포(phagocytose) 기생충을 배출 림프절(dLN)로 전달하여 T 세포에 항원을 제시합니다13. 기생충 포획 메커니즘은 식세포작용(phagocytosis) 동안 액틴 필라멘트(actin filaments)에 의한 세포골격 재조직(cytoskeletal reorganization)과 관련이 있으며, 이는 기생충의 내재화를 촉진합니다14. 리슈마니아증에서 DC가 행사하는 역할에 관한 대부분의 연구는 L. major, L. amazonensis 및 L. braziliensis15에 초점을 맞추고 있습니다. 흥미롭게도, 리슈마니아 감염에 대한 생체 내 연구는 DC 기능의 손상이 기생충 균주 특이적 방식으로 발생한다는 것을 입증했습니다.
L. amazonensis 감염의 초기 단계에서 DC는 기생충 감염을 억제하는 능력이 감소하는 것으로 입증되었습니다. 반대로, L. braziliensis 감염의 실험 모델에서, DC는 리슈마니아의 생존을 제한하는 적절한 면역 반응을 일으키는 것으로 나타났다16. 리슈마니아 종(Leishmania spp.) 감염에 대한 감별 반응과 관련이 있는 것으로 알려진 주요 측면은 DC 성숙 및 활성화 정도입니다. 이 논문은 이러한 세포가 질병 결과에 미치는 영향을 더 자세히 이해하기 위해 리슈마니아 감염에서 인간 DC가 수행하는 역할을 조사하는 방법을 설명합니다.
참고: 세포는 건강한 기증자 지원자로부터 얻었습니다. 여기에 설명된 절차는 국가 윤리 위원회(번호 2.751.345)-Fiocruz, Bahia, Brazil)의 승인을 받았습니다.
1. 인간 수지상 세포의 분화
2. 리슈마니아 문화
참고: 이 분석에는 L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125) 기생충이 사용되었습니다.
3. 리슈마니아 감염
4. 유세포 분석을 위한 면역염색
5. 액틴 면역 염색
6. 면역 라벨링
참고: 교반 상태에서 다음 단계를 수행합니다.
7. 공초점 현미경 획득 및 피지 정량화
8. 통계 분석
이 보고서는 유세포 분석 및 컨포칼 현미경을 사용하여 리슈마니아 감염에서 DC의 역할을 조사합니다. 초기에는 인간 단핵구 유래 DC의 표현형 프로파일이 확립되었습니다. 특히, 얻어진 CD11c+ 수지상 세포 집단은 CCR7, CD209, CD80, CD1a 및 HLA-DR에 대해 양성이었습니다. 결과는 DC 집단에서 이러한 마커의 발현이 리슈마니아 감염에 의해 큰 영향을 받는다는...
리슈마니아증은 전 세계적으로 심각한 공중 보건 문제입니다. 이 질병의 발병 기전은 매우 복잡하며, 척추동물 숙주에서 기생충의 생존을 촉진하는 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵다17. DC는 여과 및 림프 기관을 포함하여 몸 전체에서 발견되는 전문 항원 제시 세포입니다. 항원 포획 및 처리 후, 미성숙 DC는 림프절로 이동하는 복잡한 성숙 과정을 거?...
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Gonçalo Moniz Institute(IGM-Fiocruz)(브라질 바이아)와 현미경 부서의 도움에 감사드립니다. 저자들은 비평적 분석, 영어 개정 및 원고 카피에디팅 지원을 해준 안드리스 K. 월터(Andris K. Walter)에게 감사를 표한다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti CCR7 | Thermo | ||
anti CD209 | Isofarma | ||
anti CD83 | Leica SP8 | ||
anti HLA-DR | Gibco | ||
Bovine serum albumin | Thermo | A2153-100G | Sigma |
Ciprofloxacin | Gibco | ||
confocal microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
Fetal bovine serum | Gibco | ||
Flow Jo | Thermo Fisher Scientific | ||
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | ||
Glutamin | Gibco | ||
HEPES | Thermo Fisher Scientific | ||
phalloidin | Thermo Fisher Scientific | ||
Phosphate buffer solution | Peprotech | ||
prolong gold antifade kit | BD pharmigen | ||
RPMI | BD pharmigen | ||
Saponin | BD pharmigen | 47036 – 50G – F | Sigma |
Schneider's insect medium | software BD biosciences |
JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기
허가 살펴보기This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유