In vitro Diferenciação de células dendríticas humanas e seus marcadores na infecção por Leishmania

As células dendríticas (DCs) são componentes essenciais da imunidade inata contra a infecção por Leishmania. Os mecanismos subjacentes à complexa interação entre CDs e Leishmania permanecem pouco compreendidos. Aqui, descrevemos métodos para avaliar como a infecção por Leishmania afeta a função imunobiológica de DCs humanas, como expressão de moléculas relacionadas à migração e coestimulatórias.

A leishmaniose compreende um conjunto de manifestações clínicas associadas à infecção de protozoários intracelulares obrigatórios, Leishmania. O ciclo de vida dos parasitas Leishmania consiste em dois estágios de vida alternados (amastigotas e promastigotas), durante os quais os parasitas residem em vetores artrópodes ou hospedeiros vertebrados, respectivamente. Notavelmente, as complexas interações entre os parasitas Leishmania e várias células do sistema imunológico influenciam amplamente o resultado da infecção. É importante ressaltar que, embora os macrófagos sejam conhecidos por serem o principal nicho do hospedeiro para a replicação de Leishmania , os parasitas também são fagocitados por outras células imunes inatas, como neutrófilos e células dendríticas (DCs).

As DCs desempenham um papel importante na ponte entre os ramos inato e adaptativo da imunidade e, assim, orquestram as respostas imunes contra uma ampla gama de patógenos. Os mecanismos pelos quais Leishmania e DCs interagem permanecem obscuros e envolvem aspectos da captura de patógenos, a dinâmica de maturação e ativação de DC, migração de DC para linfonodos de drenagem (dLNs) e apresentação de antígenos para células T. Embora um grande corpo de estudos apóie a noção de que as DCs desempenham um papel duplo na modulação das respostas imunes contra Leishmania, a participação dessas células na suscetibilidade ou resistência à Leishmania permanece pouco compreendida. Após a infecção, as DCs passam por um processo de maturação associado à regulação positiva do complexo principal de histocompatibilidade de superfície (MHC) II, além de moléculas coestimulatórias (a saber, CD40, CD80 e CD86).

Compreender o papel das DCs no desfecho da infecção é crucial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e profiláticas para modular a resposta imune contra Leishmania. Este artigo descreve um método para a caracterização da interação Leishmania-DC. Este protocolo detalhado fornece orientação ao longo das etapas de diferenciação DC, caracterização de moléculas de superfície celular e protocolos de infecção, permitindo que os cientistas investiguem a resposta DC à infecção por Leishmania e obtenham informações sobre os papéis desempenhados por essas células no curso da infecção.

A leishmaniose constitui um complexo de doenças negligenciadas causadas por diferentes espécies do gênero Leishmania ¹. Leishmania é um protozoário intracelular da família Trypanosomatidae que infecta humanos e outros mamíferos, causando um espectro de doenças que vão desde lesões cutâneas até formas viscerais². As principais manifestações clínicas dessa doença são a leishmaniose tegumentar (LT) e a leishmaniose visceral (LV). A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 700.000 a 1 milhão de novos casos ocorram anualmente, causando 70.000 mortes a cada ano². Em todo o mundo, a leishmaniose afeta aproximadamente 12 a 15 milhões de pessoas, e 350 milhões estão em risco de contrair a doença³.

O gênero Leishmania apresenta duas formas evolutivas: a promastigota e a amastigota⁴. Os promastigotas de Leishmania são caracterizados pela presença de flagelos e alta motilidade. Essas formas são encontradas no trato digestivo do flebotomíneo, onde sofrem diferenciação para a forma infecciosa (promastigotas metacíclicos)⁵. Por outro lado, as amastigotas são encontradas no ambiente intracelular de células de mamíferos infectadas. Essa forma evolutiva, por sua vez, se replica nos fagolisossomos das células fagocíticas⁶.

O ciclo de transmissão de Leishmania spp. começa durante a alimentação sanguínea, quando os flebotomíneos inoculam promastigotas metacíclicos na pele do hospedeiro¹. Logo após a inoculação de Leishmania , células imunes inatas, incluindo neutrófilos e macrófagos residentes no tecido, fagocitam os parasitas. Dentro dos vacúolos parasitóforos, Leishmania se diferencia em amastigotas e se replica, culminando na ruptura da membrana da célula hospedeira, o que permite a infecção das células vizinhas e a disseminação do parasita⁴. O ciclo é completado quando os flebotomíneos ingerem fagócitos contendo amastigotas, que se diferenciam em promastigotas pró-cíclicos e, posteriormente, em promastigotas metacíclicos no trato intestinal do inseto⁷.

As células dendríticas, células apresentadoras de antígenos profissionais encontradas em tecidos e linfonodos, atuam como sentinelas para o sistema imunológico⁸. Essas células são encontradas em tecidos periféricos em estágios imaturos, envolvidas principalmente na captura e processamento de antígenos. Após o contato com patógenos, as DCs passam por um processo de maturação que culmina em sua migração para os linfonodos, apresentando posteriormente antígenos para células T CD4⁺ virgens. Essas células também são essenciais para orquestrar as respostas imunes inatas e adaptativas que geram tolerância ou inflamação⁹. O processo de maturação da DC envolve vários aspectos, incluindo aumento da expressão de MHC e moléculas coestimulatórias, como CD40 e CD86, bem como aumento da secreção de citocinas. As DCs expressam diferentes marcadores, incluindo CD11b e CD11c, e, em humanos, as DCs que se originam de monócitos CD14⁺ (moDCs) expressam CD1a¹⁰. O CCR7 é altamente expresso em DCs e indica o complexo processo migratório dessas células¹². CD209 e CD80 também desempenham um papel importante no contato inicial com DCs e linfócitos¹³.

Na leishmaniose, estudos sugerem que os moDCs fagocitam parasitas e os entregam aos linfonodos drenantes (dLNs), onde apresentam antígenos para as células T¹³. O mecanismo de captura do parasita está associado à reorganização do citoesqueleto por filamentos de actina durante a fagocitose, o que promove a internalização do parasita¹⁴. A maioria dos estudos sobre os papéis exercidos pelas CDs na leishmaniose tem se concentrado em L. major, L. amazonensis e L. braziliensis¹⁵. Curiosamente, estudos in vivo de infecção por Leishmania demonstraram que o comprometimento da função DC ocorre de maneira específica da cepa do parasita.

Foi demonstrado que durante os estágios iniciais da infecção por L. amazonensis , as DCs exibem uma capacidade diminuída de restringir a infecção do parasita. Por outro lado, em um modelo experimental de infecção por L. braziliensis , as DCs demonstraram montar respostas imunes apropriadas que restringiram a sobrevivência de Leishmania¹⁶. Os principais aspectos conhecidos por estarem associados às respostas diferenciais à infecção por Leishmania spp. são o grau de maturação e ativação da DC. Este artigo descreve um método para investigar o papel que as DCs humanas desempenham na infecção por Leishmania para entender melhor como essas células influenciam os resultados da doença.

NOTA: As células foram obtidas de voluntários doadores saudáveis. O procedimento aqui descrito foi aprovado pelo Comitê Nacional de Ética (número 2.751.345) - Fiocruz, Bahia, Brasil).

1. Diferenciação de células dendríticas humanas

1. Pipetar 10 mL de mistura de triazoato de polissacarose e sódio em tubos cônicos de 50 mL.
2. Rotule os tubos cônicos de 50 mL, respectivamente, para cada doador.
3. Colete 30 mL de sangue de doadores saudáveis e execute todas as etapas subsequentes na capela de fluxo laminar.
4. Transfira cuidadosamente o sangue para os tubos cônicos e dilua o sangue em solução salina (cloreto de sódio a 0,9%) na proporção de 1:1 à temperatura ambiente.
5. Cubra o sangue lentamente diluído na mistura de triazoato de polissacarose e sódio nos tubos (etapa 1.1). Centrifugar os tubos uma vez a 400 × g durante 30 min a 25 °C.
   NOTA: Desligue o freio antes da centrifugação para evitar a mistura de camadas de gradiente. Após a primeira centrifugação, diminuir a temperatura para 4 °C na centrífuga.
6. Retire cuidadosamente os tubos da centrífuga.
7. Procure o anel formado por células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) na amostra (buffy coat); aspirar cuidadosamente o plasma residual com uma pipeta.
   NOTA: A centrifugação leva à formação das seguintes camadas de gradiente: eritrócitos, meio de gradiente de densidade, anel PBMC e plasma. O anel PBMC está entre o meio gradiente de densidade e as camadas de plasma.
8. Transfira a camada turva de PBMC para outro tubo e adicione solução salina até um volume final de 30 mL.
9. Centrifugar os tubos que contêm as suspensões celulares a 250 × g durante 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de solução salina para ressuspender o pellet.
10. Colete uma alíquota para contagem de células e dilua-a 1:1.000. Use 10 μL das células diluídas para contar as células pelo método de exclusão de azul de tripano usando uma câmara de Neubauer para determinar a viabilidade celular.
11. Girar novamente a suspensão a 200 × g durante 10 min a 4 °C.
12. Ressuspenda o pellet no tampão de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS). Use 80 μL do tampão por 1 × 10⁷ células.
    NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter a composição do buffer MACS. Mantenha o tampão frio e armazene-o a 2-8 °C.
13. Adicione microesferas de CD14 à suspensão celular preparada na etapa 1.9. Use 20 μL de microesferas CD14 por 1 × 10⁷ células.
    NOTA: As microesferas de CD14 são usadas para selecionar positivamente monócitos humanos de PBMCs, pois as esferas contendo anti-CD14 humano se ligam a células CD14 ⁺ expressas nas superfícies da maioria dos monócitos.
14. Pipete para cima e para baixo para ressuspender os pellets e microesferas uniformemente. Mantenha no gelo por 15 min.
15. Centrifugar a suspensão a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
16. Ressuspenda as células no buffer MACS. Use 1-2 mL por 1 × 10⁷ células na mistura célula-microesfera.
17. Centrifugar a suspensão a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
18. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão MACS.
    NOTA: Este é o volume máximo da suspensão da célula a ser processada em uma coluna.
19. Monte a coluna magnética.
20. Lave a coluna uma vez com 500 μL de tampão MACS e deixe o tampão fluir sob gravidade através da coluna.
    NOTA: Tome cuidado para não permitir que a coluna fique seca, pois o ar pode obstruir a coluna.
21. Adicionar 500 μL da suspensão célula-grânulo (passo 1.19) por coluna. Permita que a suspensão da célula flua sob gravidade através da coluna.
22. Lave a coluna com 500 μL de tampão MACS (2x). Adicione um novo buffer somente quando o reservatório da coluna estiver vazio. Não deixe a coluna secar.
23. Coloque um novo tubo embaixo da coluna, pipete 1 mL do tampão MACS na coluna e lave imediatamente as células marcadas magneticamente para fora da coluna empurrando firmemente o êmbolo.
24. Centrifugar as células enriquecidas com CD14 a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
25. Conte as células usando uma câmara de Neubauer.
26. Ressuspenda as células em 1 mL de RPMI completo com 100 μL / mL de interleucina-4 (IL-4) ((50 ng / mL) + fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) (50 ng / mL).
27. Células de sementes em uma placa de 24 poços a uma concentração de 2 × 10⁵ células por poço em 500 μL de meio RPMI completo contendo as citocinas acima e incubar por 7 dias a 37 ° C.

2. Cultura Leishmania

NOTA: Parasitas L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125) foram utilizados neste ensaio.

1. Mantenha promastigotas em meio de ágar sangue Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) com 5 mL de meio completo ou meio essencial mínimo (MEM) de Schneider em um frasco de cultura^{de 25 cm 2} em uma incubadora de demanda de biooxigênio (DBO) a 24 ° C.
   NOTA: Para o cultivo da forma promastigota da espécie L. amazonensis , foram utilizados 5 mL de meio completo de Schneider (Schneider ́s Insect Medium contendo 10% de soro fetal bovino inativado (FBS) e gentamicina na concentração de 50 μg/mL).
2. Incubar durante 7 dias a 24 °C na incubadora de CBO.
3. Pipetar 100 μL de cultura promastigota para um novo balão de cultura de^{2 células de} 25 cm.
4. Adicione 5 mL do MEM suplementado.
5. Incubar a 24 °C na incubadora BOD e contar periodicamente os promastigotas transferindo uma alíquota de suspensão de células parasitas diluídas em solução salina para uma câmara de Neubauer (ou seja, hemocitômetro) até que a fase estacionária seja atingida.
   NOTA: Não use a primeira passagem pós-NNN Medium para experimentos.
6. Transfira 1 × 10⁵ de promastigotas da fase de crescimento estacionário de Leishmania para um novo frasco de cultura de células² de 25 cm e adicione 5 mL do MEM suplementado.
7. Monitore periodicamente o crescimento das culturas usando uma câmara de Neubauer até que a fase estacionária seja alcançada.
   NOTA: Use culturas promastigotas por até 7 passagens in vitro para evitar perda de virulência.

3. Infecção por Leishmania

1. Depois de verificar o crescimento em fase estacionária dos parasitas cultivados, remova todo o conteúdo dos frascos de cultura e coloque-os em tubos cônicos de 50 mL. Adicione solução salina fria para atingir um volume final de 30 mL.
2. Centrifugue por 10 min a 4 °C a 1.600 × g três vezes. Rejeitar o sobrenadante após centrifugação e ressuspender o sedimento numa solução salina fria.
3. Lave as células para remover quaisquer parasitas não viáveis e ressuspenda o pellet em 1 mL de solução salina fria. Passe a suspensão 5 vezes lentamente através de uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 16 G para separar os aglomerados de parasitas.
4. Remover uma alíquota da amostra para contar a concentração do parasita num hemocitómetro utilizando a Eq (1).
   Concentração parasitária = média dos parasitas em 4 quadrantes × factor de diluição × 10⁴ (1)
5. Calcule a quantidade de Leishmania sp. necessário para o número de células hospedeiras a serem plaqueadas para manter uma proporção de 10:1 parasita: célula hospedeira (etapa 1.27).
6. Lave as DCs adicionando 1 mL de solução salina e centrifugando as células três vezes a 300 × g por 10 min em temperatura ambiente.
7. Coloque o volume necessário de Leishmania em cada alvéolo da placa de cultura de células de 24 poços (consulte a etapa 3.5).
8. Incubar as DCs com parasitas durante 4 h numa incubadora a 37 °C numa atmosfera de CO₂ a 5%.

4. Imunocoloração para análise por citometria de fluxo

1. Após a infecção, lave as células duas vezes com 1 mL de solução salina para remover quaisquer parasitas não internalizados.
   NOTA: O painel com clones de anticorpos e fluorocromos está listado na Tabela de Materiais.
2. Dilua os anticorpos (1:50) em tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (1x PBS com 1% de BSA) a um volume final de 50 μL por condição experimental.
   NOTA: É importante titular os anticorpos antes da experimentação para garantir concentrações ideais de coloração. Neste protocolo, 1:50 foi utilizado após os experimentos de titulação.
3. Prepare uma mistura master (1x PBS com 1% BSA + mistura de anticorpos). Vórtice e pipeta 50 μL da mistura em poços contendo células.
4. Incube brevemente as DCs com a mistura de anticorpos (anti-CD1a humano, anti-CCR7 humano, anti-CD83 humano, anti-CD11c, anti-CD209 humano, anti-HLA-DR humano) em gelo por 30 min, protegido da luz.
5. Lave as células duas vezes com 1 mL de tampão de coloração a frio (1% FBS em 1x PBS) e centrifugue a 300 × g por 5 min a 4 ° C.
6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 μl de tampão de coloração a frio.
7. Prossiga com a aquisição de dados em um citômetro de fluxo.
   NOTA: Para garantir as condições ideais para a análise FACS, a aquisição de dados deve ser realizada dentro de 48 h após a coloração da amostra. Os dados foram analisados por meio do software FlowJo.
   1. Abra o programa de software FlowJo e crie um novo espaço de trabalho. Adicione os arquivos de citometria de fluxo a serem analisados arrastando-os para a janela da área de trabalho.
   2. Clique no nome do tubo para selecionar os parâmetros de dispersão lateral (SSC) e dispersão direta (FSC).
      NOTA: A análise por citometria de fluxo da maturação DC foi baseada na expressão de CD1a, CD11c, CD80, CCR7, CD209 e HLA-DR.
   3. Usando a ferramenta de passagem de polígonos , desenhe uma porta ao redor dos DCs. Clique duas vezes nas células fechadas selecionadas para exibir uma nova janela. Execute a limpeza dupla selecionando os parâmetros FSC-A e FSC-H. Usando a ferramenta polígono , desenhe um novo gráfico em torno de células individuais.
   4. Clique duas vezes nas células fechadas e selecione os parâmetros SSC e CD11c para gerar uma porta contendo células CD11c⁺ .
   5. Exporte a porta da célula CD11c⁺ limpa selecionando-a. Clique com o botão direito do mouse no portão e selecione a opção Selecionar nós equivalentes . Clique com o botão direito do mouse e exporte a porta junto com todos os parâmetros compensados, salvando-a em uma pasta criada recentemente.
   6. Crie um novo espaço de trabalho abrindo os arquivos salvos recentemente. Clique em Espaço de trabalho e selecione plugins | Redução da amostra | 30.000 a 50.000 eventos; pressione OK.
      NOTA: Como o TSNE é um processo demorado e computacionalmente exigente, esta etapa é recomendada para reduzir o número total de eventos analisados.
   7. Clique com o botão direito do mouse em um arquivo com resolução reduzida e selecione nós equivalentes.
   8. Clique com o botão direito do mouse em um arquivo com resolução reduzida e selecione Exportar/concatenar.
   9. Clique na janela de concatenação e selecione todos os parâmetros compensados. Selecione os arquivos concatenados e clique em workspace | plugin | tSNE.
   10. Selecione os parâmetros desejados (CD1a, HLA-DR, CCR7, CD80, CD209 e CD11c) para criar clusters. Pressione OK.
   11. Clique no arquivo concatenado para visualizar os parâmetros tSNE1 e tSNE2.

5. Imunomarcação de actina

1. DCs infectadas com placas em lamínulas colocadas em placas de 24 poços. Centrifugar as placas a 300 × g a 4 °C durante 10 min. Lave as células 3x com solução salina estéril após a infecção em temperatura ambiente para remover quaisquer parasitas extracelulares.
2. Incube as DCs com 500 μL de paraformaldeído a 4% por 15 min em temperatura ambiente. Remova o paraformaldeído e adicione 1 mL de solução salina (ver Tabela 1).

6. Imunomarcação

NOTA: Execute as etapas a seguir sob agitação.

1. Lave as lamínulas com 1x PBS por 5 min; repita 3x. Adicionar 500 μL de solução de cloreto de amônio por poço; Incube por 10 min em temperatura ambiente.
2. Lave as lamínulas com 1x PBS por 5 min; repita 3x.
3. Permeabilize a membrana com saponina a 0,15% por 15 min.
4. Bloqueie por 1 h com 1x PBS 1x/3% BSA/0,15% saponina. Lave as lamínulas com 1x PBS/0,15% de saponina por 5 min; repita 3x.
5. Incubar as células por 1 h com faloidina (1:1.200) diluída em 1x PBS/1% BSA/0,15% saponina. Lave as lamínulas com 1x PBS/0,15% de saponina por 5 min; repita 3x.
6. Coloque as lamínulas com as células voltadas para baixo no meio de montagem com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Cubra as lâminas com papel alumínio para protegê-las da luz.
7. Adquira imagens usando um microscópio de fluorescência confocal com uma objetiva de 63x/1,4.

7. Aquisição de microscopia confocal e quantificação de Fiji

1. Capture imagens de imunofluorescência usando um microscópio confocal de varredura a laser (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Para obter a melhor resolução, use uma lente objetiva de imersão em óleo de 63x.
2. Proteja as lamínulas da luz e deixe-as em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos antes da aquisição.
3. Use lenço absorvente para limpar as lamínulas. Adicione uma gota de óleo de imersão à objetiva e coloque a lâmina no microscópio stage. Selecione a objetiva 63x com óleo, levante a plataforma até que o óleo toque a lâmina e ajuste o foco no microscópio.
4. Abra o programa e ative os comprimentos de onda do laser de 488, 552 e 405 nm.
5. Defina a resolução da imagem para 1024 x 1024 pixels.
6. Clique na parte inferior ao vivo, defina a pilha Z e pressione Iniciar. Repita esse processo e pressione o botão Terminar .
7. Aguarde a conclusão da aquisição da imagem e selecione a opção Projeção máxima nas ferramentas.
8. Salve o experimento e exporte as imagens no formato .lif para um computador.
9. Abra o programa FIJI, abra o experimento em FIJI e defina a pilha de exibição como Hyperstack.
10. Selecione abrir arquivos de imagem individualmente | costurar ladrilhos.
11. Selecione a ferramenta mão livre na barra de ferramentas Fiji e trace cada célula cuidadosamente à mão. Pressione analyze | measure para visualizar a intensidade da fluorescência. Repita esse processo para cada tipo de célula por grupo.
12. Salve as medidas e exporte-as para uma planilha. Abra o arquivo que contém os dados usando o software de análise estatística (consulte a Tabela de Materiais) para realizar a análise estatística.

8. Análise estatística

1. Abra um novo projeto no software.
2. Para dados com distribuição normal, use o teste t de Student; para dados não paramétricos, use o teste U de Mann-Whitney.
3. Cole os valores obtidos dos resultados experimentais na tabela.
4. Selecione estatísticas descritivas e escolha a opção estatísticas de coluna [todos os testes] para analisar a distribuição de dados.
   NOTA: Se os dados seguirem a distribuição gaussiana, escolha o teste t para examinar amostras comparando dois pares. Se a distribuição for não gaussiana, analise os dados usando o teste U de Mann-Whitney com medidas de tendência central (médias ou medianas) e medidas de variação.
5. Escolha a melhor opção de gráfico para uma representação de dados ideal.

Este relatório investiga o papel das DCs na infecção por Leishmania usando citometria de fluxo e microscopia confocal. Inicialmente, foi estabelecido o perfil fenotípico da DC derivada de monócitos humanos. Notavelmente, as populações de células dendríticas CD11c⁺ obtidas foram positivas para CCR7, CD209, CD80, CD1a e HLA-DR. Os resultados indicam que a expressão desses marcadores em populações DC é profundamente impactada pela infecção por Leishman...

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecemos ao Instituto Gonçalo Moniz (IGM-Fiocruz) (Bahia, Brasil) e ao departamento de microscopia pelo auxílio. Os autores agradecem a Andris K. Walter pela análise crítica, revisão da língua inglesa e assistência na edição de manuscritos.