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Method Article
As células dendríticas (DCs) são componentes essenciais da imunidade inata contra a infecção por Leishmania. Os mecanismos subjacentes à complexa interação entre CDs e Leishmania permanecem pouco compreendidos. Aqui, descrevemos métodos para avaliar como a infecção por Leishmania afeta a função imunobiológica de DCs humanas, como expressão de moléculas relacionadas à migração e coestimulatórias.
A leishmaniose compreende um conjunto de manifestações clínicas associadas à infecção de protozoários intracelulares obrigatórios, Leishmania. O ciclo de vida dos parasitas Leishmania consiste em dois estágios de vida alternados (amastigotas e promastigotas), durante os quais os parasitas residem em vetores artrópodes ou hospedeiros vertebrados, respectivamente. Notavelmente, as complexas interações entre os parasitas Leishmania e várias células do sistema imunológico influenciam amplamente o resultado da infecção. É importante ressaltar que, embora os macrófagos sejam conhecidos por serem o principal nicho do hospedeiro para a replicação de Leishmania , os parasitas também são fagocitados por outras células imunes inatas, como neutrófilos e células dendríticas (DCs).
As DCs desempenham um papel importante na ponte entre os ramos inato e adaptativo da imunidade e, assim, orquestram as respostas imunes contra uma ampla gama de patógenos. Os mecanismos pelos quais Leishmania e DCs interagem permanecem obscuros e envolvem aspectos da captura de patógenos, a dinâmica de maturação e ativação de DC, migração de DC para linfonodos de drenagem (dLNs) e apresentação de antígenos para células T. Embora um grande corpo de estudos apóie a noção de que as DCs desempenham um papel duplo na modulação das respostas imunes contra Leishmania, a participação dessas células na suscetibilidade ou resistência à Leishmania permanece pouco compreendida. Após a infecção, as DCs passam por um processo de maturação associado à regulação positiva do complexo principal de histocompatibilidade de superfície (MHC) II, além de moléculas coestimulatórias (a saber, CD40, CD80 e CD86).
Compreender o papel das DCs no desfecho da infecção é crucial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e profiláticas para modular a resposta imune contra Leishmania. Este artigo descreve um método para a caracterização da interação Leishmania-DC. Este protocolo detalhado fornece orientação ao longo das etapas de diferenciação DC, caracterização de moléculas de superfície celular e protocolos de infecção, permitindo que os cientistas investiguem a resposta DC à infecção por Leishmania e obtenham informações sobre os papéis desempenhados por essas células no curso da infecção.
A leishmaniose constitui um complexo de doenças negligenciadas causadas por diferentes espécies do gênero Leishmania 1. Leishmania é um protozoário intracelular da família Trypanosomatidae que infecta humanos e outros mamíferos, causando um espectro de doenças que vão desde lesões cutâneas até formas viscerais2. As principais manifestações clínicas dessa doença são a leishmaniose tegumentar (LT) e a leishmaniose visceral (LV). A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 700.000 a 1 milhão de novos casos ocorram anualmente, causando 70.000 mortes a cada ano2. Em todo o mundo, a leishmaniose afeta aproximadamente 12 a 15 milhões de pessoas, e 350 milhões estão em risco de contrair a doença3.
O gênero Leishmania apresenta duas formas evolutivas: a promastigota e a amastigota4. Os promastigotas de Leishmania são caracterizados pela presença de flagelos e alta motilidade. Essas formas são encontradas no trato digestivo do flebotomíneo, onde sofrem diferenciação para a forma infecciosa (promastigotas metacíclicos)5. Por outro lado, as amastigotas são encontradas no ambiente intracelular de células de mamíferos infectadas. Essa forma evolutiva, por sua vez, se replica nos fagolisossomos das células fagocíticas6.
O ciclo de transmissão de Leishmania spp. começa durante a alimentação sanguínea, quando os flebotomíneos inoculam promastigotas metacíclicos na pele do hospedeiro1. Logo após a inoculação de Leishmania , células imunes inatas, incluindo neutrófilos e macrófagos residentes no tecido, fagocitam os parasitas. Dentro dos vacúolos parasitóforos, Leishmania se diferencia em amastigotas e se replica, culminando na ruptura da membrana da célula hospedeira, o que permite a infecção das células vizinhas e a disseminação do parasita4. O ciclo é completado quando os flebotomíneos ingerem fagócitos contendo amastigotas, que se diferenciam em promastigotas pró-cíclicos e, posteriormente, em promastigotas metacíclicos no trato intestinal do inseto7.
As células dendríticas, células apresentadoras de antígenos profissionais encontradas em tecidos e linfonodos, atuam como sentinelas para o sistema imunológico8. Essas células são encontradas em tecidos periféricos em estágios imaturos, envolvidas principalmente na captura e processamento de antígenos. Após o contato com patógenos, as DCs passam por um processo de maturação que culmina em sua migração para os linfonodos, apresentando posteriormente antígenos para células T CD4+ virgens. Essas células também são essenciais para orquestrar as respostas imunes inatas e adaptativas que geram tolerância ou inflamação9. O processo de maturação da DC envolve vários aspectos, incluindo aumento da expressão de MHC e moléculas coestimulatórias, como CD40 e CD86, bem como aumento da secreção de citocinas. As DCs expressam diferentes marcadores, incluindo CD11b e CD11c, e, em humanos, as DCs que se originam de monócitos CD14+ (moDCs) expressam CD1a10. O CCR7 é altamente expresso em DCs e indica o complexo processo migratório dessas células12. CD209 e CD80 também desempenham um papel importante no contato inicial com DCs e linfócitos13.
Na leishmaniose, estudos sugerem que os moDCs fagocitam parasitas e os entregam aos linfonodos drenantes (dLNs), onde apresentam antígenos para as células T13. O mecanismo de captura do parasita está associado à reorganização do citoesqueleto por filamentos de actina durante a fagocitose, o que promove a internalização do parasita14. A maioria dos estudos sobre os papéis exercidos pelas CDs na leishmaniose tem se concentrado em L. major, L. amazonensis e L. braziliensis15. Curiosamente, estudos in vivo de infecção por Leishmania demonstraram que o comprometimento da função DC ocorre de maneira específica da cepa do parasita.
Foi demonstrado que durante os estágios iniciais da infecção por L. amazonensis , as DCs exibem uma capacidade diminuída de restringir a infecção do parasita. Por outro lado, em um modelo experimental de infecção por L. braziliensis , as DCs demonstraram montar respostas imunes apropriadas que restringiram a sobrevivência de Leishmania16. Os principais aspectos conhecidos por estarem associados às respostas diferenciais à infecção por Leishmania spp. são o grau de maturação e ativação da DC. Este artigo descreve um método para investigar o papel que as DCs humanas desempenham na infecção por Leishmania para entender melhor como essas células influenciam os resultados da doença.
NOTA: As células foram obtidas de voluntários doadores saudáveis. O procedimento aqui descrito foi aprovado pelo Comitê Nacional de Ética (número 2.751.345) - Fiocruz, Bahia, Brasil).
1. Diferenciação de células dendríticas humanas
2. Cultura Leishmania
NOTA: Parasitas L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125) foram utilizados neste ensaio.
3. Infecção por Leishmania
4. Imunocoloração para análise por citometria de fluxo
5. Imunomarcação de actina
6. Imunomarcação
NOTA: Execute as etapas a seguir sob agitação.
7. Aquisição de microscopia confocal e quantificação de Fiji
8. Análise estatística
Este relatório investiga o papel das DCs na infecção por Leishmania usando citometria de fluxo e microscopia confocal. Inicialmente, foi estabelecido o perfil fenotípico da DC derivada de monócitos humanos. Notavelmente, as populações de células dendríticas CD11c+ obtidas foram positivas para CCR7, CD209, CD80, CD1a e HLA-DR. Os resultados indicam que a expressão desses marcadores em populações DC é profundamente impactada pela infecção por Leishman...
A leishmaniose é um grave problema de saúde pública em todo o mundo. A patogênese dessa doença é bastante complexa, e os mecanismos que favorecem a sobrevivência do parasita em hospedeiros vertebrados permanecem indescritíveis17. DCs são células apresentadoras de antígenos profissionais encontradas em todo o corpo, incluindo órgãos filtrantes e linfóides. Após a captura e processamento do antígeno, as DCs imaturas passam por um complexo processo de...
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecemos ao Instituto Gonçalo Moniz (IGM-Fiocruz) (Bahia, Brasil) e ao departamento de microscopia pelo auxílio. Os autores agradecem a Andris K. Walter pela análise crítica, revisão da língua inglesa e assistência na edição de manuscritos.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti CCR7 | Thermo | ||
anti CD209 | Isofarma | ||
anti CD83 | Leica SP8 | ||
anti HLA-DR | Gibco | ||
Bovine serum albumin | Thermo | A2153-100G | Sigma |
Ciprofloxacin | Gibco | ||
confocal microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
Fetal bovine serum | Gibco | ||
Flow Jo | Thermo Fisher Scientific | ||
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | ||
Glutamin | Gibco | ||
HEPES | Thermo Fisher Scientific | ||
phalloidin | Thermo Fisher Scientific | ||
Phosphate buffer solution | Peprotech | ||
prolong gold antifade kit | BD pharmigen | ||
RPMI | BD pharmigen | ||
Saponin | BD pharmigen | 47036 – 50G – F | Sigma |
Schneider's insect medium | software BD biosciences |
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