Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Дендритные клетки (ДК) являются важными компонентами врожденного иммунитета против инфекции Leishmania. Механизмы, лежащие в основе сложного взаимодействия между ДК и лейшманией , остаются малоизученными. В данной статье мы описываем методы оценки того, как инфекция Leishmania влияет на иммунобиологическую функцию ДК человека, такую как экспрессия молекул, связанная с миграцией и костимулирующая экспрессия.
Лейшманиоз представляет собой совокупность клинических проявлений, связанных с инфекцией облигатных внутриклеточных простейших, Leishmania. Жизненный цикл паразитов Leishmania состоит из двух чередующихся жизненных стадий (амастиготы и промастиготы), в течение которых паразиты обитают либо в членистоногих переносчиках, либо в позвоночных хозяевах, соответственно. Примечательно, что сложные взаимодействия между паразитами Leishmania и несколькими клетками иммунной системы в значительной степени влияют на исход инфекции. Важно отметить, что, хотя известно, что макрофаги являются основной нишей хозяина для репликации Leishmania , паразиты также фагоцитируются другими клетками врожденного иммунитета, такими как нейтрофилы и дендритные клетки (ДК).
ДК играют важную роль в соединении врожденных и адаптивных ветвей иммунитета и, таким образом, организуют иммунные реакции против широкого спектра патогенов. Механизмы, с помощью которых Leishmania и DC взаимодействуют, остаются неясными и включают в себя аспекты захвата патогена, динамики созревания и активации DC, миграции DC в дренирующие лимфатические узлы (dLNs) и презентации антигена в Т-клетках. Несмотря на то, что большое количество исследований поддерживает идею о том, что ДК играют двойную роль в модуляции иммунных реакций против лейшмании, участие этих клеток в восприимчивости или устойчивости к лейшмании остается плохо изученным. После инфицирования ДК подвергаются процессу созревания, связанному с активацией поверхностного большого комплекса гистосовместимости (MHC) II, в дополнение к костимулирующим молекулам (а именно, CD40, CD80 и CD86).
Понимание роли ДК в исходе инфекции имеет решающее значение для разработки терапевтических и профилактических стратегий для модуляции иммунного ответа против лейшмании. В данной статье описан метод характеристики взаимодействия Leishmania-DC. Этот подробный протокол содержит рекомендации на всех этапах дифференцировки ДК, характеристики молекул клеточной поверхности и протоколов инфекции, что позволяет ученым исследовать реакцию ДК на инфекцию Leishmania и получить представление о роли, которую эти клетки играют в ходе инфекции.
Лейшманиоз представляет собой комплекс запущенных заболеваний, вызываемых различными видами рода Leishmania рода1. Leishmania — внутриклеточный простейший из семейства Trypanosomatidae, который инфицирует людей и других млекопитающих, вызывая спектр заболеваний, начиная от поражений кожи и заканчивая висцеральнымиформами. Основными клиническими проявлениями этого заболевания являются тегументарный лейшманиоз (ТЛ) и висцеральный лейшманиоз (ВЛ). По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ежегодно происходит от 700 000 до 1 миллиона новых случаев заболевания, что приводит к 70 000 смертей каждыйгод2. Лейшманиозом во всем мире страдают от 12 до 15 миллионов человек, и 350 миллионов человек подвержены риску заражения этой болезнью3.
Род Leishmania представляет две эволюционные формы: промастиготу и амастиготу4. Leishmania promastigotes характеризуются наличием жгутиков и высокой подвижностью. Эти формы обнаруживаются в пищеварительном тракте песчаной мухи, где они подвергаются дифференцировке в инфекционную форму (метациклические промастиготы)5. Напротив, амастиготы обнаруживаются во внутриклеточной среде инфицированных клеток млекопитающих. Эта эволюционная форма, в свою очередь, реплицируется в фаголизосомах фагоцитарных клеток6.
Цикл передачи Leishmania spp. начинается во время кормления кровью, когда москитные мухи инокулируют метациклические промастиготы в кожу хозяина1. Вскоре после инокуляции лейшмании клетки врожденного иммунитета, включая нейтрофилы и тканевые макрофаги, фагоцитируют паразитов. Внутри паразитофорных вакуолей лейшмании дифференцируются в амастиготы и реплицируются, что приводит к разрыву клеточной мембраны хозяина, что способствует инфицированию соседних клетоки распространению паразита4. Цикл завершается, когда флеботомины поглощают фагоциты, содержащие амастигот, которые дифференцируются в проциклические промастиготы, а затем в метациклические промастиготы в кишечном тракте насекомого7.
Дендритные клетки, профессиональные антигенпрезентирующие клетки, обнаруженные в тканях и лимфатических узлах, действуют как страж иммунной системы8. Эти клетки обнаруживаются в периферических тканях на незрелых стадиях, в основном участвуют в захвате и обработке антигена. После контакта с патогенами ДК подвергаются процессу созревания, который завершается их миграцией в лимфатические узлы, впоследствии представляя антигены наивным CD4+ Т-клеткам. Эти клетки также играют важную роль в организации врожденных и адаптивных иммунных реакций, которые вызывают толерантность или воспаление9. Процесс созревания ДК включает в себя несколько аспектов, включая повышенную экспрессию MHC и костимулирующих молекул, таких как CD40 и CD86, а также усиленную секрецию цитокинов. ДК экспрессируют различные маркеры, включая CD11b и CD11c, а у человека ДК, происходящие из моноцитов CD14+ (moDCs), экспрессируют CD1a10. CCR7 высоко экспрессируется на ДК и указывает на сложный миграционный процесс этих клеток12. CD209 и CD80 также играют важную роль в первичном контакте с ДК и лимфоцитами13.
Исследования показывают, что при лейшманиозе moDC фагоцитозируют паразитов и доставляют их в дренажные лимфатические узлы (dLNs), где они представляют антигены Т-клеткам13. Механизм захвата паразита связан с реорганизацией цитоскелета актиновыми филаментами во время фагоцитоза, что способствует интернализации паразита14. Большинство исследований, посвященных роли ДК в лейшманиозе, были сосредоточены на L. major, L. amazonensis и L. braziliensis15. Интересно, что исследования инфекции лейшмании in vivo показали, что нарушение функции ДК происходит специфическим для паразита штаммоспецифическим образом.
Было продемонстрировано, что на ранних стадиях инфекции L. amazonensis ДК демонстрируют сниженную способность сдерживать паразитарную инфекцию. И наоборот, в экспериментальной модели инфекции L. braziliensis было показано, что ДК вызывают соответствующие иммунные реакции, которые ограничивают выживаемость Leishmania16. Основными известными аспектами, связанными с дифференциальными ответами на инфекцию Leishmania spp., являются степень созревания и активации ДК. В этой статье описывается метод исследования роли ДК человека в инфекции лейшмании для дальнейшего понимания того, как эти клетки влияют на исходы заболевания.
Примечание: Клетки были получены от здоровых добровольцев-доноров. Описанная в настоящем документе процедура была одобрена Национальным комитетом по этике (номер 2.751.345) - Фиокрус, Баия, Бразилия).
1. Дифференцировка дендритных клеток человека
2. Культура лейшмании
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе использовались паразиты L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125).
3. Инфекция лейшмании
4. Иммуноокрашивание для анализа проточной цитометрии
5. Иммуноокрашивание актином
6. Иммуномаркировка
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия во время перемешивания.
7. Получение данных с помощью конфокальной микроскопии и количественная оценка на Фиджи
8. Статистический анализ
В этом отчете исследуется роль ДК в инфекции Leishmania с использованием проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Первоначально был установлен фенотипический профиль ДК, полученного из моноцитов человека. Примечательно, что полученные популяции дендритных ...
Лейшманиоз является серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. Патогенез этого заболевания довольно сложен, и механизмы, способствующие выживанию паразитов в позвоночных организмах-хозяевах, остаютсянеясными17. ДК — это профессио?...
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарим за помощь Институт Гонсалу Мониша (IGM-Fiocruz) (Баия, Бразилия) и отдел микроскопии. Авторы выражают благодарность Андрису К. Вальтеру за критический анализ, редактирование английского языка и помощь в редактировании рукописей.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti CCR7 | Thermo | ||
anti CD209 | Isofarma | ||
anti CD83 | Leica SP8 | ||
anti HLA-DR | Gibco | ||
Bovine serum albumin | Thermo | A2153-100G | Sigma |
Ciprofloxacin | Gibco | ||
confocal microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
Fetal bovine serum | Gibco | ||
Flow Jo | Thermo Fisher Scientific | ||
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | ||
Glutamin | Gibco | ||
HEPES | Thermo Fisher Scientific | ||
phalloidin | Thermo Fisher Scientific | ||
Phosphate buffer solution | Peprotech | ||
prolong gold antifade kit | BD pharmigen | ||
RPMI | BD pharmigen | ||
Saponin | BD pharmigen | 47036 – 50G – F | Sigma |
Schneider's insect medium | software BD biosciences |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены