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Method Article
Les cellules dendritiques (CD) sont des composants essentiels de l’immunité innée contre l’infection à Leishmania. Les mécanismes sous-jacents à l’interaction complexe entre les DC et Leishmania restent mal compris. Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer comment l’infection à Leishmania affecte la fonction immunobiologique des CD humains, telles que l’expression des molécules liées à la migration et costimulatrices.
La leishmaniose comprend un ensemble de manifestations cliniques associées à l’infection de protozoaires intracellulaires obligatoires, la leishmaniose. Le cycle de vie des parasites Leishmania se compose de deux stades de vie alternés (amastigotes et promastigotes), au cours desquels les parasites résident soit chez des arthropodes vecteurs, soit chez des hôtes vertébrés, respectivement. Notamment, les interactions complexes entre les parasites Leishmania et plusieurs cellules du système immunitaire influencent largement l’issue de l’infection. Il est important de noter que, bien que les macrophages soient connus pour être la principale niche d’hôte pour la réplication de Leishmania , les parasites sont également phagocytés par d’autres cellules immunitaires innées, telles que les neutrophiles et les cellules dendritiques (DC).
Les DC jouent un rôle majeur dans le rapprochement entre les branches innées et adaptatives de l’immunité et orchestrent ainsi les réponses immunitaires contre un large éventail d’agents pathogènes. Les mécanismes par lesquels Leishmania et les DC interagissent restent flous et impliquent des aspects de la capture des agents pathogènes, de la dynamique de la maturation et de l’activation des CD, de la migration des DC vers les ganglions lymphatiques drainants (dLN) et de la présentation de l’antigène aux lymphocytes T. Bien qu’un grand nombre d’études soutiennent l’idée que les CD jouent un double rôle dans la modulation des réponses immunitaires contre Leishmania, la participation de ces cellules à la susceptibilité ou à la résistance à Leishmania reste mal comprise. Après l’infection, les CD subissent un processus de maturation associé à la régulation positive du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) II de surface, en plus des molécules de costimulation (à savoir, CD40, CD80 et CD86).
Comprendre le rôle des CD dans l’issue de l’infection est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques et prophylactiques visant à moduler la réponse immunitaire contre Leishmania. Cet article décrit une méthode de caractérisation de l’interaction Leishmania-DC. Ce protocole détaillé fournit des conseils tout au long des étapes de la différenciation des CD, de la caractérisation des molécules de surface cellulaire et des protocoles d’infection, permettant aux scientifiques d’étudier la réponse des DC à l’infection à Leishmania et de mieux comprendre les rôles joués par ces cellules au cours de l’infection.
La leishmaniose constitue un complexe de maladies négligées causées par différentes espèces du genre Leishmania 1. Leishmania est un protozoaire intracellulaire de la famille des Trypanosomatidae qui infecte les humains et d’autres mammifères, provoquant un éventail de maladies allant des lésions cutanées aux formes viscérales2. Les principales manifestations cliniques de cette maladie sont la leishmaniose tégumentaire (TL) et la leishmaniose viscérale (VL). L’Organisation mondiale de la santé (OMS) estime que 700 000 à 1 million de nouveaux cas surviennent chaque année, causant 70 000 décès chaque année2. Dans le monde, la leishmaniose touche environ 12 à 15 millions de personnes, et 350 millions sont à risque de contracter la maladie3.
Le genre Leishmania présente deux formes évolutives : le promastigote et l’amastigote4. Les promastigotes de Leishmania se caractérisent par la présence de flagelles et une motilité élevée. Ces formes se trouvent dans le tube digestif du phlébotome, où elles subissent une différenciation en forme infectieuse (promastigotes métacycliques)5. En revanche, les amastigotes se trouvent dans l’environnement intracellulaire des cellules de mammifères infectées. Cette forme évolutive, à son tour, se réplique dans les phagolysosomes des cellules phagocytaires6.
Le cycle de transmission de Leishmania spp. commence pendant l’alimentation sanguine, lorsque les phlébotomes inoculent des promastigotes métacycliques dans la peau de l’hôte1. Peu de temps après l’inoculation de Leishmania , les cellules immunitaires innées, y compris les neutrophiles et les macrophages résidant dans les tissus, phagocytent les parasites. À l’intérieur des vacuoles parasitophores, Leishmania se différencie en amastigotes et se réplique, aboutissant à la rupture de la membrane de la cellule hôte, ce qui permet l’infection des cellules voisines et la propagation du parasite4. Le cycle est terminé lorsque les phlébotomines ingèrent des phagocytes contenant de l’amastigote, qui se différencient en promastigotes procycliques et plus tard en promastigotes métacycliques dans le tractus intestinal de l’insecte7.
Les cellules dendritiques, cellules présentatrices d’antigènes professionnelles présentes dans les tissus et les ganglions lymphatiques, agissent comme une sentinelle pour le système immunitaire8. Ces cellules se trouvent dans les tissus périphériques aux stades immatures, principalement impliquées dans la capture et le traitement de l’antigène. Après avoir été en contact avec des agents pathogènes, les DC subissent un processus de maturation qui aboutit à leur migration vers les ganglions lymphatiques, présentant ensuite des antigènes aux lymphocytes T CD4+ naïfs. Ces cellules sont également essentielles dans l’orchestration des réponses immunitaires innées et adaptatives qui génèrent la tolérance ou l’inflammation9. Le processus de maturation des DC implique plusieurs aspects, notamment l’expression accrue du CMH et des molécules costimulatrices, telles que CD40 et CD86, ainsi que l’amélioration de la sécrétion de cytokines. Les DC expriment différents marqueurs, notamment CD11b et CD11c, et, chez l’homme, les DC qui proviennent des monocytes CD14+ (moDC) expriment CD1a10. CCR7 est fortement exprimé sur les DC et indique le processus migratoire complexe de ces cellules12. CD209 et CD80 jouent également un rôle important dans le contact initial avec les DC et les lymphocytes13.
Dans la leishmaniose, des études suggèrent que les moDC phagocytent les parasites et les délivrent aux ganglions lymphatiques drainants (dLN), où ils présentent des antigènes aux lymphocytes T13. Le mécanisme de capture du parasite est associé à la réorganisation du cytosquelette par les filaments d’actine lors de la phagocytose, ce qui favorise l’internalisation du parasite14. La plupart des études concernant les rôles exercés par les DC dans la leishmaniose se sont concentrées sur L. major, L. amazonensis et L. braziliensis15. Il est intéressant de noter que des études in vivo de l’infection à Leishmania ont démontré que l’altération de la fonction des DC se produit d’une manière spécifique à la souche parasitaire.
Il a été démontré qu’au cours des premiers stades de l’infection à L. amazonensis , les CD présentent une capacité réduite à limiter l’infection parasitaire. À l’inverse, dans un modèle expérimental d’infection à L. braziliensis , il a été démontré que les CD développaient des réponses immunitaires appropriées qui limitaient la survie à Leishmania16. Les principaux aspects connus pour être associés aux réponses différentielles à l’infection à Leishmania spp. sont le degré de maturation et d’activation des DC. Cet article décrit une méthode pour étudier le rôle que jouent les CD humains dans l’infection à Leishmania afin de mieux comprendre comment ces cellules influencent l’issue de la maladie.
REMARQUE : Les cellules ont été obtenues à partir de donneurs volontaires sains. La procédure décrite dans le présent document a été approuvée par le Comité national d’éthique (numéro 2.751.345) - Fiocruz, Bahia, Brésil).
1. Différenciation des cellules dendritiques humaines
2. La culture de Leishmania
REMARQUE : Les parasites L . amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125) ont été utilisés dans cet essai.
3. Infection à Leishmania
4. Immunocoloration pour l’analyse par cytométrie en flux
5. Immunomarquage à l’actine
6. Immunomarquage
REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes sous agitation.
7. Acquisition de la microscopie confocale et quantification des Fidji
8. Analyse statistique
Ce rapport étudie le rôle des CD dans l’infection à Leishmania à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie confocale. Initialement, le profil phénotypique de la DC dérivée des monocytes humains a été établi. Notamment, les populations de cellules dendritiques CD11c+ obtenues étaient positives pour CCR7, CD209, CD80, CD1a et HLA-DR. Les résultats indiquent que l’expression de ces marqueurs dans les populations de DC est profondément affec...
La leishmaniose est un grave problème de santé publique dans le monde entier. La pathogenèse de cette maladie est assez complexe, et les mécanismes favorisant la survie des parasites chez les hôtes vertébrés restent insaisissables17. Les DC sont des cellules professionnelles présentatrices d’antigènes présentes dans tout le corps, y compris les organes filtrants et lymphoïdes. Après la capture et le traitement de l’antigène, les CD immatures subis...
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Nous remercions l’Institut Gonçalo Moniz (IGM-Fiocruz) (Bahia, Brésil) et le département de microscopie pour leur aide. Les auteurs sont reconnaissants à Andris K. Walter pour l’analyse critique, la révision de la langue anglaise et l’aide à la révision des manuscrits.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti CCR7 | Thermo | ||
anti CD209 | Isofarma | ||
anti CD83 | Leica SP8 | ||
anti HLA-DR | Gibco | ||
Bovine serum albumin | Thermo | A2153-100G | Sigma |
Ciprofloxacin | Gibco | ||
confocal microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
Fetal bovine serum | Gibco | ||
Flow Jo | Thermo Fisher Scientific | ||
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | ||
Glutamin | Gibco | ||
HEPES | Thermo Fisher Scientific | ||
phalloidin | Thermo Fisher Scientific | ||
Phosphate buffer solution | Peprotech | ||
prolong gold antifade kit | BD pharmigen | ||
RPMI | BD pharmigen | ||
Saponin | BD pharmigen | 47036 – 50G – F | Sigma |
Schneider's insect medium | software BD biosciences |
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