Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Dendritik hücreler (DC'ler), Leishmania enfeksiyonuna karşı doğuştan gelen bağışıklığın temel bileşenleridir. DC'ler ve Leishmania arasındaki karmaşık etkileşimin altında yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania enfeksiyonunun, göçle ilgili ve kostimülatör molekül ekspresyonu gibi insan DC'lerinin immünobiyolojik işlevini nasıl etkilediğini değerlendirmek için yöntemleri açıklıyoruz.
Leishmaniasis, zorunlu hücre içi protozoonlar, Leishmania enfeksiyonu ile ilişkili bir dizi klinik belirti içerir. Leishmania parazitlerinin yaşam döngüsü, parazitlerin sırasıyla eklembacaklı vektörleri veya omurgalı konakçıları içinde bulunduğu iki alternatif yaşam evresinden (amastigotlar ve promastigotlar) oluşur. Özellikle, Leishmania parazitleri ve bağışıklık sisteminin çeşitli hücreleri arasındaki karmaşık etkileşimler, enfeksiyonun sonucunu büyük ölçüde etkiler. Daha da önemlisi, makrofajların Leishmania replikasyonu için ana konak nişi olduğu bilinmesine rağmen, parazitler ayrıca nötrofiller ve dendritik hücreler (DC'ler) gibi diğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri tarafından fagosite edilir.
DC'ler, bağışıklığın doğuştan gelen ve adaptif dalları arasında köprü kurmada önemli bir rol oynar ve böylece çok çeşitli patojenlere karşı bağışıklık tepkilerini düzenler. Leishmania ve DC'lerin etkileşime girdiği mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır ve patojen yakalama, DC olgunlaşma ve aktivasyon dinamikleri, drenaj lenf noduna (dLN'ler) DC göçü ve T hücrelerine antijen sunumu yönlerini içerir. Her ne kadar çok sayıda çalışma, DC'lerin Leishmania'ya karşı bağışıklık tepkilerini modüle etmede ikili bir rol oynadığı fikrini desteklese de, bu hücrelerin Leishmania'ya duyarlılık veya dirençteki katılımı tam olarak anlaşılamamıştır. Enfeksiyondan sonra, DC'ler, yardımcı uyarıcı moleküllere (yani CD40, CD80 ve CD86) ek olarak, yüzey majör histouyumluluk kompleksi (MHC) II'nin yukarı regülasyonu ile ilişkili bir olgunlaşma sürecinden geçer.
DC'lerin enfeksiyon sonucundaki rolünü anlamak, Leishmania'ya karşı immün yanıtı modüle etmek için terapötik ve profilaktik stratejiler geliştirmek için çok önemlidir. Bu makale, Leishmania-DC etkileşiminin karakterizasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu ayrıntılı protokol, DC farklılaşması, hücre yüzey moleküllerinin karakterizasyonu ve enfeksiyon protokolleri boyunca rehberlik sağlayarak bilim adamlarının Leishmania enfeksiyonuna DC yanıtını araştırmasına ve bu hücrelerin enfeksiyon sırasında oynadığı roller hakkında fikir edinmesine olanak tanır.
Leishmaniasis, Leishmania cinsi1'in farklı türlerinin neden olduğu ihmal edilmiş hastalıkların bir kompleksini oluşturur. Leishmania , insanları ve diğer memelileri enfekte eden ve cilt lezyonlarından viseral formlara kadar değişen bir hastalık spektrumuna neden olan Trypanosomatidae familyasının hücre içi bir protozoanıdır2. Bu hastalığın ana klinik belirtileri tegumentary leishmaniasis (TL) ve visseral leishmaniasis'tir (VL). Dünya Sağlık Örgütü (WHO), yılda 700.000 ila 1 milyon yeni vakanın meydana geldiğini ve her yıl 70.000 ölüme neden olduğunu tahmin etmektedir2. Dünya çapında, leishmaniasis yaklaşık 12 ila 15 milyon insanı etkilemektedir ve 350 milyon kişi hastalığa yakalanma riski altındadır3.
Leishmania cinsi iki evrimsel form sunar: promastigot ve amastigot4. Leishmania promastigotları, flagella varlığı ve yüksek motilite ile karakterizedir. Bu formlar, kum sineğinin sindirim sisteminde bulunur ve burada enfektif forma (metasiklik promastigotlar) farklılaşırlar5. Buna karşılık, amastigotlar, enfekte olmuş memeli hücrelerinin hücre içi ortamında bulunur. Bu evrimsel form, sırayla, fagositik hücrelerin6 fagolizozomlarında çoğalır.
Leishmania spp.'nin bulaşma döngüsü, kanla beslenme sırasında, kum sineklerinin metasiklik promastigotları konakçının derisine aşıladığı zaman başlar1. Leishmania aşılamasından kısa bir süre sonra, nötrofiller ve dokuda yerleşik makrofajlar dahil olmak üzere doğuştan gelen bağışıklık hücreleri parazitleri fagositleştirir. Parazitoforöz vakuollerin içinde, Leishmania amastigotlara farklılaşır ve çoğalır, bu da komşu hücrelerin enfeksiyonuna ve parazitin yayılmasına izin veren konakçı hücre zarının yırtılmasıyla sonuçlanır4. Flebotominaslar, prosiklik promastigotlara ve daha sonra böceğin bağırsak sistemindeki metasiklik promastigotlarafarklılaşan amastigot içeren fagositleri yuttuğunda döngü tamamlanır 7.
Dokularda ve lenf düğümlerinde bulunan profesyonel antijen sunan hücreler olan dendritik hücreler, bağışıklık sistemi için bir nöbetçi görevi görür8. Bu hücreler, esas olarak antijen yakalama ve işlemede rol oynayan olgunlaşmamış aşamalarda periferik dokularda bulunur. Patojenlerle temastan sonra, DC'ler lenf düğümlerine göçleriyle sonuçlanan bir olgunlaşma sürecinden geçer ve daha sonra antijenleri saf CD4 + T hücrelerine sunar. Bu hücreler aynı zamanda tolerans veya iltihaplanma oluşturan doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklık tepkilerinin düzenlenmesinde de gereklidir9. DC olgunlaşma süreci, MHC'nin ve CD40 ve CD86 gibi uyarıcı moleküllerin artan ekspresyonunun yanı sıra gelişmiş sitokin sekresyonu dahil olmak üzere çeşitli yönleri içerir. DC'ler, CD11b ve CD11c dahil olmak üzere farklı belirteçleri eksprese eder ve insanlarda, CD14+ monositlerinden (moDC'ler) kaynaklanan DC'ler CD1a10'u eksprese eder. CCR7, DC'lerde yüksek oranda eksprese edilir ve bu hücrelerin karmaşık göç sürecinigösterir 12. CD209 ve CD80 ayrıca DC'ler ve lenfositler13 ile ilk temasta önemli bir rol oynar.
Leishmaniasis'te çalışmalar, moDC'lerin fagositozların parazitleri ve onları T hücrelerine antijen sundukları drenaj lenf düğümlerine (dLN'ler) ilettiğini göstermektedir13. Parazit yakalama mekanizması, fagositoz sırasında aktin filamentleri tarafından hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi ile ilişkilidir, bu da parazitin14 içselleştirilmesini destekler. Leishmaniasis'te DC'lerin oynadığı rollerle ilgili çoğu çalışma L. major, L. amazonensis ve L. braziliensis15'e odaklanmıştır. İlginç bir şekilde, Leishmania enfeksiyonunun in vivo çalışmaları, DC fonksiyonunun bozulmasının parazit suşuna özgü bir şekilde meydana geldiğini göstermiştir.
L. amazonensis enfeksiyonunun erken evrelerinde, DC'lerin parazit enfeksiyonunu sınırlama yeteneğinin azaldığı gösterilmiştir. Tersine, deneysel bir L. braziliensis enfeksiyonu modelinde, DC'lerin Leishmania sağkalımını kısıtlayan uygun bağışıklık tepkileri oluşturduğu gösterilmiştir16. Leishmania spp. enfeksiyonuna farklı yanıtlarla ilişkili olduğu bilinen başlıca yönler, DC olgunlaşma ve aktivasyon derecesidir. Bu makale, bu hücrelerin hastalık sonuçlarını nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için insan DC'lerinin Leishmania enfeksiyonunda oynadığı rolü araştırmak için bir yöntemi açıklamaktadır.
NOT: Hücreler sağlıklı donör gönüllülerden elde edilmiştir. Burada açıklanan prosedür Ulusal Etik Komitesi (sayı 2.751.345)-Fiocruz, Bahia, Brezilya tarafından onaylanmıştır.
1. İnsan dendritik hücrelerinin farklılaşması
2. Leishmania kültürü
NOT: Bu testte L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125) parazitleri kullanılmıştır.
3. Leishmania enfeksiyonu
4. Akış sitometrisi analizi için immün boyama
5. Aktin immün boyama
6. İmmün etiketleme
NOT: Çalkalama altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
7. Konfokal mikroskopi alımı ve Fiji miktar tayini
8. İstatistiksel analiz
Bu rapor, akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi kullanarak DC'lerin Leishmania enfeksiyonundaki rolünü araştırmaktadır. Başlangıçta, insan monositinden türetilmiş DC'nin fenotipik profili oluşturuldu. Özellikle, elde edilen CD11c + dendritik hücre popülasyonları CCR7, CD209, CD80, CD1a ve HLA-DR için pozitifti. Sonuçlar, DC popülasyonlarında bu belirteçlerin ekspresyonunun Leishmania enfeksiyonundan derinden etkilendiğini göstermekted...
Leishmaniasis dünya çapında ciddi bir halk sağlığı sorunudur. Bu hastalığın patogenezi oldukça karmaşıktır ve omurgalı konakçılarda parazit sağkalımını destekleyen mekanizmalar hala belirsizdir17. DC'ler, filtreleme ve lenfoid organlar dahil olmak üzere vücudun her yerinde bulunan profesyonel antijen sunan hücrelerdir. Antijen yakalama ve işlemeyi takiben, olgunlaşmamış DC'ler, bu hücrelerin antijenleri T lenfositlerine
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Gonçalo Moniz Enstitüsü'ne (IGM-Fiocruz) (Bahia, Brezilya) ve mikroskopi bölümüne yardımları için teşekkür ederiz. Yazarlar, eleştirel analiz, İngilizce dil revizyonu ve el yazması kopya düzenleme yardımı için Andris K. Walter'a minnettardır.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti CCR7 | Thermo | ||
anti CD209 | Isofarma | ||
anti CD83 | Leica SP8 | ||
anti HLA-DR | Gibco | ||
Bovine serum albumin | Thermo | A2153-100G | Sigma |
Ciprofloxacin | Gibco | ||
confocal microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
Fetal bovine serum | Gibco | ||
Flow Jo | Thermo Fisher Scientific | ||
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | ||
Glutamin | Gibco | ||
HEPES | Thermo Fisher Scientific | ||
phalloidin | Thermo Fisher Scientific | ||
Phosphate buffer solution | Peprotech | ||
prolong gold antifade kit | BD pharmigen | ||
RPMI | BD pharmigen | ||
Saponin | BD pharmigen | 47036 – 50G – F | Sigma |
Schneider's insect medium | software BD biosciences |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır