このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。
Method Article
樹状細胞(DC)は、リーシュマニア感染に対する自然免疫の必須成分です。DCと リーシュマニア の間の複雑な相互作用の根底にあるメカニズムは、まだ十分に理解されていません。ここでは、 リーシュマニア 感染がヒトDCの免疫生物学的機能にどのように影響するかを評価する方法(遊走関連分子発現や共刺激分子発現など)について述べます。
リーシュマニア症は、偏性細胞内原生動物であるリーシュマニア の感染に関連する臨床症状のコレクションで構成されています。 リーシュマニア 寄生虫のライフサイクルは、2つの交互のライフステージ(アマスチゴテスとプロマスティゴテス)で構成されており、その間、寄生虫はそれぞれ節足動物ベクターまたは脊椎動物宿主のいずれかに存在します。特に、 リーシュマニア 原虫と免疫系のいくつかの細胞との間の複雑な相互作用が、感染の結果に大きく影響します。重要なことは、マクロファージが リーシュマニア 複製の主要な宿主ニッチであることが知られていますが、寄生虫は好中球や樹状細胞(DC)などの他の自然免疫細胞によっても食作用されるということです。
DCは、免疫の自然枝と適応枝を橋渡しする主要な役割を果たし、さまざまな病原体に対する免疫応答を調整します。 リーシュマニア とDCが相互作用するメカニズムは不明のままであり、病原体の捕捉、DCの成熟と活性化のダイナミクス、DCの排出リンパ節(dLN)への移動、およびT細胞への抗原提示の側面が関与しています。DCが リーシュマニアに対する免疫応答を調節する上で二重の役割を果たすという考えは、多くの研究で支持されていますが、リー シュマニア に対する感受性や耐性にDC細胞が関与しているかどうかについては、まだ十分に理解されていません。感染後、DCは、共刺激分子(すなわち、CD40、CD80、およびCD86)に加えて、表面主要組織適合遺伝子複合体(MHC)IIのアップレギュレーションに関連する成熟プロセスを経ます。
感染結果におけるDCの役割を理解することは、 リーシュマニアに対する免疫応答を調節するための治療および予防戦略を開発するために重要です。この論文では、 リーシュマニア-DC相互作用の特性評価の方法について説明します。この詳細なプロトコルは、DC分化、細胞表面分子の特性評価、および感染プロトコルのステップ全体にわたるガイダンスを提供し、科学者が リーシュマニア 感染に対するDC応答を調査し、感染の過程でこれらの細胞が果たす役割についての洞察を得ることができます。
リーシュマニア症は、 リーシュマニア 属1の異なる種によって引き起こされる顧みられない疾患の複合体を構成しています。 リーシュマニア は、ヒトや他の哺乳類に感染するトリパノソマ科の細胞内原生動物であり、皮膚病変から内臓形態2までのさまざまな疾患を引き起こします。この疾患の主な臨床症状は、被蓋リーシュマニア症(TL)と内臓リーシュマニア症(VL)です。世界保健機関(WHO)は、年間70万人から100万人の新規症例が発生し、毎年7万人が死亡していると推定しています2。リーシュマニア症は、世界中で約1,200万人から1,500万人が罹患しており、3億5,000万人が罹患するリスクがあります3。
リーシュマニア属は、プロマスタチゴートとアマスティゴート4の2つの進化形態を示します。リーシュマニア前茎動物は、べん毛の存在と高い運動性によって特徴付けられます。これらの形態は、シロチョウバエの消化管に見られ、そこで感染型(メタサイクリック前マスチゴテス)5に分化します。対照的に、アマスチゴテスは感染した哺乳類細胞の細胞内環境に見られます。この進化的形態は、次に、食細胞のファゴリソソームで複製されます6。
リーシュマニア属の感染サイクルは、サシチョウバエが宿主の皮膚にメタ環状前マスティゴットを接種する授血中に始まります1。リーシュマニアの接種後まもなく、好中球や組織常在マクロファージなどの自然免疫細胞が寄生虫を食作用させます。寄生性液胞内では、リーシュマニアはアマスチゴテスに分化して複製し、宿主の細胞膜が破裂し、隣接する細胞の感染と寄生虫の拡散が可能になります4。このサイクルは、フレボトミンがアマスチゴテを含む食細胞を摂取すると完了し、食細胞は昆虫の腸管でプロサイキングプロマスティゴテに分化し、後にメタサイキングプロマスティゴテに分化します7。
樹状細胞は、組織やリンパ節に見られる専門的な抗原提示細胞であり、免疫系のセンチネルとして機能します8。これらの細胞は、主に抗原の捕捉とプロセシングに関与する未成熟段階の末梢組織に見られます。病原体と接触した後、DCは成熟過程を経てリンパ節に移動し、その後、ナイーブCD4+ T細胞に抗原を提示します。これらの細胞は、耐性または炎症を引き起こす自然免疫応答および適応免疫応答の調整にも不可欠です9。DC成熟プロセスには、MHCやCD40やCD86などの共刺激分子の発現の増加、サイトカイン分泌の増強など、いくつかの側面が含まれます。DCはCD11bやCD11cなどの異なるマーカーを発現し、ヒトではCD14+ 単球(moDC)に由来するDCがCD1a10を発現します。CCR7はDCで高発現し、これらの細胞の複雑な移動過程を示している12。CD209およびCD80は、DCおよびリンパ球13との最初の接触においても重要な役割を果たす。
リーシュマニア症では、MoDCが寄生虫を食作用させ、それらをドレインリンパ節(dLN)に送達し、そこでT細胞に抗原を提示することが研究で示唆されています13。寄生虫捕獲機構は、食作用中のアクチンフィラメントによる細胞骨格再編成と関連しており、寄生虫の内在化を促進する14。リーシュマニア症におけるDCの役割に関するほとんどの研究は、L. major、L. amazonensis、およびL. braziliensis15に焦点を当てています。興味深いことに、リーシュマニア感染のin vivo研究では、DC機能の障害が寄生虫株特異的に発生することが示されています。
L. amazonensis感染の初期段階では、DCは寄生虫感染を抑制する能力が低下することが実証されています。逆に、L. braziliensis感染の実験モデルでは、DCはリーシュマニアの生存を制限する適切な免疫応答を開始することが示されました16。リーシュマニア属の感染に対する反応の違いと関連していることが知られている主な側面は、DCの成熟と活性化の程度です。この論文では、ヒトDCがリーシュマニア感染で果たす役割を調査し、これらの細胞が疾患の転帰にどのように影響するかをさらに理解する方法について説明します。
注:細胞は健康なドナーボランティアから採取されました。ここに記載されている手順は、国家倫理委員会(番号2.751.345)-Fiocruz、バイーア、ブラジル)によって承認されました。
1. ヒト樹状細胞の分化
2. リーシュマニア 文化
注:このアッセイでは 、L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125)寄生虫を使用しました。
3. リーシュマニア 感染症
4. フローサイトメトリー解析のための免疫染色
5. アクチン免疫染色
6. 免疫標識
注意: 攪拌しながら次の手順を実行します。
7. 共焦点顕微鏡法による取得とフィジー定量
8. 統計分析
このレポートでは、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を使用して、リーシュマニア感染におけるDCの役割を調査します。最初に、ヒト単球由来DCの表現型プロファイルが確立されました。特に、得られたCD11c+樹状細胞集団は、CCR7、CD209、CD80、CD1a、およびHLA-DRに対して陽性でした。この結果は、DC集団におけるこれらのマーカーの発現がリーシュ?...
リーシュマニア症は、世界中で深刻な公衆衛生上の問題となっています。この疾患の病因は非常に複雑であり、脊椎動物の宿主における寄生虫の生存を促進するメカニズムは依然としてとらえどころのないままです17。DCは、濾過器官やリンパ器官など、全身に見られる専門的な抗原提示細胞です。抗原の捕捉およびプロセシングに続いて、未成熟DC...
著者には、開示すべき利益相反はありません。
Gonçalo Moniz Institute(IGM-Fiocruz)(ブラジル、バイーア)と顕微鏡部門の支援に感謝します。著者らは、Andris K. Walterの批判的分析、英語の校正、原稿の編集支援に感謝しています。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti CCR7 | Thermo | ||
anti CD209 | Isofarma | ||
anti CD83 | Leica SP8 | ||
anti HLA-DR | Gibco | ||
Bovine serum albumin | Thermo | A2153-100G | Sigma |
Ciprofloxacin | Gibco | ||
confocal microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
Fetal bovine serum | Gibco | ||
Flow Jo | Thermo Fisher Scientific | ||
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | ||
Glutamin | Gibco | ||
HEPES | Thermo Fisher Scientific | ||
phalloidin | Thermo Fisher Scientific | ||
Phosphate buffer solution | Peprotech | ||
prolong gold antifade kit | BD pharmigen | ||
RPMI | BD pharmigen | ||
Saponin | BD pharmigen | 47036 – 50G – F | Sigma |
Schneider's insect medium | software BD biosciences |
このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します
許可を申請This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved