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Method Article
Le cellule dendritiche (DC) sono componenti essenziali dell'immunità innata contro l'infezione da Leishmania. I meccanismi alla base della complessa interazione tra DC e Leishmania rimangono poco compresi. Qui, descriviamo i metodi per valutare come l'infezione da Leishmania influisce sulla funzione immunobiologica delle DC umane, come l'espressione di molecole costimolatorie e correlate alla migrazione.
La leishmaniosi comprende un insieme di manifestazioni cliniche associate all'infezione dei protozoi intracellulari obbligati, la Leishmania. Il ciclo di vita dei parassiti Leishmania consiste in due fasi di vita alternate (amastigoti e promastigoti), durante le quali i parassiti risiedono rispettivamente all'interno di vettori artropodi o di ospiti vertebrati. In particolare, le complesse interazioni tra i parassiti della Leishmania e diverse cellule del sistema immunitario influenzano in gran parte l'esito dell'infezione. È importante sottolineare che, sebbene i macrofagi siano noti per essere la principale nicchia ospite per la replicazione della Leishmania , i parassiti vengono fagocitati anche da altre cellule immunitarie innate, come i neutrofili e le cellule dendritiche (DC).
Le DC svolgono un ruolo importante nel collegare i rami innato e adattativo dell'immunità e quindi orchestrano le risposte immunitarie contro un'ampia gamma di patogeni. I meccanismi attraverso i quali la Leishmania e le DC interagiscono rimangono poco chiari e coinvolgono aspetti della cattura del patogeno, le dinamiche di maturazione e attivazione delle DC, la migrazione delle DC ai linfonodi drenanti (dLN) e la presentazione dell'antigene alle cellule T. Sebbene un ampio numero di studi sostenga l'idea che le DC svolgano un duplice ruolo nella modulazione delle risposte immunitarie contro la Leishmania, la partecipazione di queste cellule alla suscettibilità o alla resistenza alla Leishmania rimane poco conosciuta. Dopo l'infezione, le DC subiscono un processo di maturazione associato alla sovraregolazione del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) II di superficie, oltre che alle molecole costimolatorie (CD40, CD80 e CD86).
Comprendere il ruolo delle DC nell'esito dell'infezione è fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche e profilattiche per modulare la risposta immunitaria contro la Leishmania. Questo articolo descrive un metodo per la caratterizzazione dell'interazione Leishmania-DC. Questo protocollo dettagliato fornisce una guida durante le fasi della differenziazione delle DC, la caratterizzazione delle molecole della superficie cellulare e i protocolli di infezione, consentendo agli scienziati di studiare la risposta delle DC all'infezione da Leishmania e di ottenere informazioni sui ruoli svolti da queste cellule nel corso dell'infezione.
La leishmaniosi è un complesso di malattie trascurate causate da diverse specie del genere Leishmania 1. La Leishmania è un protozoo intracellulare della famiglia dei Trypanosomatidae che infetta l'uomo e altri mammiferi, causando uno spettro di malattie che vanno dalle lesioni cutanee alle forme viscerali2. Le principali manifestazioni cliniche di questa malattia sono la leishmaniosi tegumentaria (TL) e la leishmaniosi viscerale (VL). L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stima che ogni anno si verifichino da 700.000 a 1 milione di nuovi casi, causando 70.000 decessi ogni anno2. In tutto il mondo, la leishmaniosi colpisce circa 12-15 milioni di persone e 350 milioni sono a rischio di contrarre la malattia3.
Il genere Leishmania presenta due forme evolutive: il promastigote e l'amastigote4. I promastigoti di Leishmania sono caratterizzati dalla presenza di flagelli e da un'elevata motilità. Queste forme si trovano nel tratto digestivo del flebotomo, dove subiscono la differenziazione nella forma infettiva (promastigoti metaciclici)5. Al contrario, gli amastigoti si trovano nell'ambiente intracellulare delle cellule di mammifero infette. Questa forma evolutiva, a sua volta, si replica nei fagolisosomi delle cellule fagocitiche6.
Il ciclo di trasmissione di Leishmania spp. inizia durante l'alimentazione del sangue, quando i flebotomi inoculano i promastigoti metaciclici nella pelle dell'ospite1. Poco dopo l'inoculazione della Leishmania , le cellule immunitarie innate, compresi i neutrofili e i macrofagi residenti nei tessuti, fagocitano i parassiti. All'interno dei vacuoli parassitofori, la Leishmania si differenzia in amastigoti e si replica, culminando nella rottura della membrana cellulare ospite, che consente l'infezione delle cellule vicine e la diffusione del parassita4. Il ciclo si completa quando le flebotomine ingeriscono fagociti contenenti amastigoti, che si differenziano in promastigoti prociclici e successivamente in promastigoti metaciclici nel tratto intestinale dell'insetto7.
Le cellule dendritiche, cellule professionali che presentano l'antigene presenti nei tessuti e nei linfonodi, fungono da sentinella per il sistema immunitario8. Queste cellule si trovano nei tessuti periferici in stadi immaturi, principalmente coinvolte nella cattura e nell'elaborazione dell'antigene. Dopo il contatto con i patogeni, le DC subiscono un processo di maturazione che culmina nella loro migrazione verso i linfonodi, presentando successivamente gli antigeni alle cellule T CD4+ naive. Queste cellule sono anche essenziali nell'orchestrare le risposte immunitarie innate e adattative che generano tolleranza o infiammazione9. Il processo di maturazione delle DC coinvolge diversi aspetti, tra cui l'aumento dell'espressione di MHC e delle molecole costimolatorie, come CD40 e CD86, nonché l'aumento della secrezione di citochine. Le DC esprimono diversi marcatori, tra cui CD11b e CD11c, e, nell'uomo, le DC che originano dai monociti CD14+ (moDC) esprimono CD1a10. CCR7 è altamente espresso sulle DC e indica il complesso processo migratorio di queste cellule12. CD209 e CD80 svolgono anche un ruolo importante nel contatto iniziale con DC e linfociti13.
Nella leishmaniosi, gli studi suggeriscono che le moDC fagocitano i parassiti e li consegnano ai linfonodi drenanti (dLN), dove presentano antigeni alle cellule T13. Il meccanismo di cattura del parassita è associato alla riorganizzazione del citoscheletro da parte dei filamenti di actina durante la fagocitosi, che promuove l'internalizzazione del parassita14. La maggior parte degli studi riguardanti i ruoli esercitati dalle DC nella leishmaniosi si sono concentrati su L. major, L. amazonensis e L. braziliensis15. È interessante notare che studi in vivo sull'infezione da Leishmania hanno dimostrato che la compromissione della funzione DC si verifica in modo specifico per il ceppo parassita.
È stato dimostrato che durante le prime fasi dell'infezione da L. amazonensis , le DC mostrano una ridotta capacità di limitare l'infezione da parassiti. Al contrario, in un modello sperimentale di infezione da L. braziliensis , è stato dimostrato che le DC montano risposte immunitarie appropriate che limitano la sopravvivenza alla Leishmania16. Gli aspetti principali noti per essere associati alle risposte differenziali all'infezione da Leishmania spp. sono il grado di maturazione e attivazione delle DC. Questo articolo descrive un metodo per studiare il ruolo che le DC umane svolgono nell'infezione da Leishmania per comprendere ulteriormente come queste cellule influenzano gli esiti della malattia.
NOTA: Le cellule sono state ottenute da donatori volontari sani. La procedura qui descritta è stata approvata dal Comitato Etico Nazionale (numero 2.751.345)-Fiocruz, Bahia, Brasile).
1. Differenziamento di cellule dendritiche umane
2. Cultura della Leishmania
NOTA: In questo test sono stati utilizzati parassiti L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125).
3. Infezione da leishmania
4. Immunocolorazione per analisi di citometria a flusso
5. Immunocolorazione dell'actina
6. Immunomarcatura
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi in agitazione.
7. Acquisizione al microscopio confocale e quantificazione delle Figi
8. Analisi statistica
Questo rapporto indaga il ruolo delle DC nell'infezione da Leishmania utilizzando la citometria a flusso e la microscopia confocale. Inizialmente, è stato stabilito il profilo fenotipico della DC umana derivata dai monociti. In particolare, le popolazioni di cellule dendritiche CD11c+ ottenute erano positive per CCR7, CD209, CD80, CD1a e HLA-DR. I risultati indicano che l'espressione di questi marcatori nelle popolazioni di DC è profondamente influenzata dall'infezi...
La leishmaniosi è un grave problema di salute pubblica in tutto il mondo. La patogenesi di questa malattia è piuttosto complessa e i meccanismi che favoriscono la sopravvivenza del parassita negli ospiti vertebrati rimangono sfuggenti17. Le DC sono cellule professionali che presentano l'antigene che si trovano in tutto il corpo, compresi gli organi filtranti e linfoidi. Dopo la cattura e l'elaborazione dell'antigene, le DC immature subiscono un complesso process...
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamo l'Istituto Gonçalo Moniz (IGM-Fiocruz) (Bahia, Brasile) e il dipartimento di microscopia per l'assistenza. Gli autori sono grati ad Andris K. Walter per l'analisi critica, la revisione in lingua inglese e l'assistenza nella revisione del manoscritto.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti CCR7 | Thermo | ||
anti CD209 | Isofarma | ||
anti CD83 | Leica SP8 | ||
anti HLA-DR | Gibco | ||
Bovine serum albumin | Thermo | A2153-100G | Sigma |
Ciprofloxacin | Gibco | ||
confocal microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
Fetal bovine serum | Gibco | ||
Flow Jo | Thermo Fisher Scientific | ||
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | ||
Glutamin | Gibco | ||
HEPES | Thermo Fisher Scientific | ||
phalloidin | Thermo Fisher Scientific | ||
Phosphate buffer solution | Peprotech | ||
prolong gold antifade kit | BD pharmigen | ||
RPMI | BD pharmigen | ||
Saponin | BD pharmigen | 47036 – 50G – F | Sigma |
Schneider's insect medium | software BD biosciences |
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