A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
תאים דנדריטיים (DCs) הם מרכיבים חיוניים של חסינות מולדת נגד זיהום לישמניה. המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציה המורכבת בין DCs ללישמאניה נותרו לא מובנים היטב. כאן, אנו מתארים שיטות להעריך כיצד זיהום לישמניה, משפיע על התפקוד האימונוביולוגי של DCs אנושיים, כגון ביטוי מולקולות הקשורות להגירה ועליות.
לישמניאזיס מורכבת מאוסף של ביטויים קליניים הקשורים לזיהום של פרוטוזואנים תוך-תאיים מחייבים, לישמניה. מחזור החיים של טפילי לישמניה , מורכב משני שלבי חיים מתחלפים (אמסטיגוטים ופרומסטיגוטים), שבמהלכם טפילים שוכנים בתוך וקטורים של פרוקי רגליים או פונדקאים של בעלי חוליות, בהתאמה. יש לציין כי האינטראקציות המורכבות בין טפילי הלישמניה למספר תאים של מערכת החיסון משפיעות במידה רבה על תוצאות הזיהום. חשוב לציין, למרות שידוע כי מקרופאגים הם הנישה המארחת העיקרית לשכפול הלישמניה , טפילים עוברים פגוציטוזות גם על ידי תאים חיסוניים מולדים אחרים, כגון נויטרופילים ותאים דנדריטיים (DCs).
DCs ממלאים תפקיד מרכזי בגישור בין הענפים המולדים והנרכשים של החיסון ובכך מתזמרים תגובות חיסוניות נגד מגוון רחב של פתוגנים. המנגנונים שבאמצעותם לישמנייה ו-DCs מתקשרים נותרו לא ברורים וכוללים היבטים של לכידת פתוגנים, הדינמיקה של התבגרות והפעלה של DC, נדידת DC לבלוטות לימפה מנקזות (dLNs) והצגת אנטיגן לתאי T. למרות שגוף גדול של מחקרים תומך ברעיון ש-DCs ממלאים תפקיד כפול בוויסות התגובות החיסוניות נגד לישמניה, השתתפותם של תאים אלה ברגישות או עמידות ללישמניה , נותרה לא מובנת היטב. לאחר ההדבקה, DCs עוברים תהליך התבגרות הקשור לוויסות של קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרית על פני השטח (MHC) II, בנוסף למולקולות קוסטימולטוריות (כלומר, CD40, CD80 ו-CD86).
הבנת תפקידם של DCs בתוצאות הזיהום היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות ומניעתיות לווסת את התגובה החיסונית נגד לישמניה. מאמר זה מתאר שיטה לאפיון אינטראקציה בין לישמניה-DC. פרוטוקול מפורט זה מספק הדרכה לאורך כל שלבי התמיינות DC, אפיון מולקולות פני התא ופרוטוקולי זיהום, ומאפשר למדענים לחקור את תגובת DC לזיהום בלישמניה ולקבל תובנה לגבי התפקידים שממלאים תאים אלה במהלך ההדבקה.
לישמניאזיס מהווה קומפלקס של מחלות מוזנחות הנגרמות על ידי מינים שונים של הסוג לישמניה. לישמניה היא פרוטוזואה תוך-תאית ממשפחת Trypanosomatidae המדביקה בני אדם ויונקים אחרים, וגורמת לספקטרום של מחלות החל מנגעי עור ועד צורות קרביים2. הביטויים הקליניים העיקריים של מחלה זו הם לישמניאזיס טגומנטרי (TL) ולישמניאזיס קרביים (VL). ארגון הבריאות העולמי (WHO) מעריך כי 700,000 עד מיליון מקרים חדשים מתרחשים מדי שנה, הגורמים ל-70,000 מקרי מוותמדי שנה. ברחבי העולם, לישמניאזיס פוגעת בכ-12 עד 15 מיליון בני אדם, ו-350 מיליון נמצאים בסיכון להידבק במחלה3.
הסוג Leishmania מציג שתי צורות אבולוציוניות: הפרומסטיגוטה והאמסטיגוטה4. פרומסטיגוטים של לישמניה, מאופיינים בנוכחות של דגלים ותנועתיות גבוהה. צורות אלה נמצאות במערכת העיכול של זבוב החול, שם הן עוברות התמיינות לצורה הזיהומית (פרומסטיגוטים מטציקליים)5. לעומת זאת, אמסטיגוטים נמצאים בסביבה התוך-תאית של תאי יונקים נגועים. צורה אבולוציונית זו, בתורה, משתכפלת בפגוליזוזומים של תאים פגוציטים6.
מחזור ההעברה של Leishmania spp. מתחיל במהלך הזנת הדם, כאשר זבובי חול מחסנים פרומסטיגוטים מטציקליים לתוך עור המארח1. זמן קצר לאחר חיסון הלישמניה , תאי חיסון מולדים, כולל נויטרופילים ומקרופאגים השוכנים ברקמות, מביאים לפגוציטים של הטפילים. בתוך ואקואולים טפילים, הלישמניה מתמיינה לאמסטיגוטים ומשתכפלת, ומגיעה לשיאה בקרע של קרום התא המארח, המאפשר זיהום של תאים שכנים והתפשטות טפילים4. המחזור הושלם כאשר פלבוטומינים בולעים פגוציטים המכילים אמסטיגוטה, המתמיינים לפרומאסטיגוטים פרוציקליים ומאוחר יותר לפומסטיגוטים מטציקליים במערכת העיכול של החרק7.
תאים דנדריטיים, תאים מקצועיים מציגי אנטיגן הנמצאים ברקמות ובבלוטות הלימפה, פועלים כזקיף למערכת החיסון8. תאים אלה נמצאים ברקמות היקפיות בשלבים לא בשלים, ומעורבים בעיקר בלכידת אנטיגן ועיבודו. לאחר מגע עם פתוגנים, DCs עוברים תהליך התבגרות שמגיע לשיאו בנדידתם לבלוטות הלימפה, ולאחר מכן מציגים אנטיגנים לתאי CD4+ T נאיביים. תאים אלה חיוניים גם בתזמור התגובות החיסוניות המולדות והמסתגלות היוצרות סבילות או דלקת9. תהליך ההתבגרות של DC כולל מספר היבטים, כולל ביטוי מוגבר של MHC ומולקולות קוסטימולטוריות, כגון CD40 ו-CD86, כמו גם הפרשת ציטוקינים מוגברת. DCs מבטאים סמנים שונים, כולל CD11b ו-CD11c, ובבני אדם, ה-DCs שמקורם ב-CD14+ מונוציטים (moDCs) מבטאים CD1a10. CCR7 מתבטא מאוד ב-DCs ומצביע על תהליך הנדידה המורכב של תאים אלה12. CD209 ו-CD80 ממלאים גם תפקיד חשוב במגע הראשוני עם DCs ולימפוציטים13.
בלישמניאזיס, מחקרים מצביעים על כך ש-moDCs טפילי פגוציטוז ומעבירים אותם לבלוטות הלימפה המנקזות (dLNs), שם הם מציגים אנטיגנים לתאי T13. מנגנון לכידת הטפיל קשור לארגון מחדש של השלד הציטולוגי על ידי חוטי אקטין במהלך פגוציטוזיס, מה שמקדם את הפנמת הטפיל14. רוב המחקרים הנוגעים לתפקידים שממלאים DCs בלישמניאזיס התמקדו ב-L. major, L. amazonensis ו-L. braziliensis15. מעניין לציין שמחקרים in vivo על זיהום לישמניה, הראו כי הפגיעה בתפקוד DC מתרחשת באופן ספציפי לזן הטפיל.
הוכח כי בשלבים המוקדמים של זיהום L. amazonensis , DCs מפגינים יכולת מופחתת לרסן זיהום טפיל. לעומת זאת, במודל ניסיוני של זיהום L. braziliensis , הוכח כי DCs מפעילים תגובות חיסוניות מתאימות שהגבילו את הישרדות הלישמניה16. ההיבטים העיקריים הידועים כקשורים לתגובות דיפרנציאליות לזיהום ב-Leishmania spp. הם מידת ההתבגרות וההפעלה של DC. מאמר זה מתאר שיטה לחקור את התפקיד שממלאים DCs אנושיים בזיהום לישמניה , כדי להבין עוד יותר כיצד תאים אלה משפיעים על תוצאות המחלה.
הערה: התאים הושגו ממתנדבים תורמים בריאים. הנוהל המתואר כאן אושר על ידי ועדת האתיקה הלאומית (מספר 2.751.345) - Fiocruz, Bahia, ברזיל).
1. התמיינות של תאים דנדריטיים אנושיים
2. תרבות הלישמניה
הערה: טפילי L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125) שימשו בבדיקה זו.
3. זיהום בלישמניה
4. צביעה חיסונית לניתוח ציטומטריית זרימה
5. צביעה חיסונית של אקטין
6. תיוג חיסוני
הערה: בצע את השלבים הבאים תחת תסיסה.
7. רכישת מיקרוסקופיה קונפוקלית וכימות פיג'י
8. ניתוח סטטיסטי
דוח זה חוקר את תפקידם של DCs בזיהום לישמניה, באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. בתחילה, נקבע הפרופיל הפנוטיפי של DC שמקורו במונוציטים אנושיים. יש לציין כי אוכלוסיות התאים הדנדריטים CD11c+ שהושגו היו חיוביות ל-CCR7, CD209, CD80, CD1a ו-HLA-DR. התוצאות מצביעות על כך ...
לישמניאזיס היא בעיה חמורה של בריאות הציבור ברחבי העולם. הפתוגנזה של מחלה זו מורכבת למדי, והמנגנונים המעדיפים את הישרדות הטפילים במארחים של בעלי חוליות נותרו חמקמקים17. DCs הם תאים מקצועיים המציגים אנטיגן הנמצאים בכל הגוף, כולל איברי סינון ולימפה. לאחר לכידת א?...
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
אנו מודים למכון גונסאלו מוניז (IGM-Fiocruz) (באהיה, ברזיל) ולמחלקה למיקרוסקופיה על הסיוע. המחברים אסירי תודה לאנדריס ק. וולטר על ניתוח ביקורתי, תיקון בשפה האנגלית וסיוע בעריכת כתבי יד.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti CCR7 | Thermo | ||
anti CD209 | Isofarma | ||
anti CD83 | Leica SP8 | ||
anti HLA-DR | Gibco | ||
Bovine serum albumin | Thermo | A2153-100G | Sigma |
Ciprofloxacin | Gibco | ||
confocal microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
Fetal bovine serum | Gibco | ||
Flow Jo | Thermo Fisher Scientific | ||
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | ||
Glutamin | Gibco | ||
HEPES | Thermo Fisher Scientific | ||
phalloidin | Thermo Fisher Scientific | ||
Phosphate buffer solution | Peprotech | ||
prolong gold antifade kit | BD pharmigen | ||
RPMI | BD pharmigen | ||
Saponin | BD pharmigen | 47036 – 50G – F | Sigma |
Schneider's insect medium | software BD biosciences |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved