İntrapulmoner İmmün Hücrelerin İntravasküler İmmün Hücre Popülasyonlarından Ayırt Edilmesi: İntrajuguler Yaklaşım

Bu çalışmanın amacı, akciğer inflamasyonu çalışmalarında intravasküler ve intraparankimal immün hücreler arasında ayrım yapmak için bir protokol tanımlamaktır. Akciğer hasadından önce floresan etiketli bir antikorun intrajuguler enjeksiyonunu kullanıyoruz. Ayrıca, akciğerden lökosit verimini artırmak için enflasyona dayalı bir akciğer sindirim süreci kullanıyoruz.

Sirkadiyen ritimler, 24 saatlik bir periyotla meydana gelen çeşitli biyolojik süreçlerdeki salınımları ifade eder. Moleküler düzeyde, bu tür ritimler, çekirdek saat genlerinin bir transkripsiyonel-translasyonel geri besleme döngüleri (TTFL) ağından oluşur. Bağışıklık sistemi de dahil olmak üzere bireysel doku ve organ sistemlerinin kendi saatleri vardır. Sistemik dolaşımda, CD45⁺ popülasyonunun çeşitli üyeleri gün boyunca salınır; bununla birlikte, bu ritimlerin çoğu, dokuda yerleşik CD45 ⁺ lökosit popülasyonunda aynı veya hatta benzer değildir. Akciğer iltihabının sirkadiyen regülasyonunun rolünü incelerken, akciğerdeki CD45 ⁺ 'nın araştırılması gerekebilir. Bununla birlikte, optimize edilmiş perfüzyon yöntemlerine rağmen, dolaşımdan sıkışan lökositler akciğerlerde kalır. Bu protokolün tasarlanmasındaki amaç, intravasküler ve intraparankimal lökositleri ayırt etmekti. Bu amaçla, farelere akciğer hasadından kısa bir süre önce intrajuguler olarak floresan etiketli CD45 antikoru enjekte edilir. Daha sonra akciğer, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için özelleştirilmiş bir akciğer sindirim tekniği kullanılarak sindirilir. Numune, intraparankimal bağışıklık hücreleri (başka bir CD45 antikoru dahil) için düzenli antikor paneli için boyanır. Flowsitometrik analizler, popülasyonların net bir şekilde aydınlatıldığını göstermektedir. Bu nedenle, intrapulmoner CD45⁺ hücrelerinin etiketlenmesi ve tanımlanması yöntemi, intrapulmoner ve dolaşımdaki immün hücrelerin davranışlarının sayısal ve fonksiyonel olarak farklı olduğu durumlarda özellikle önemli olacaktır.

Burada intravasküler lökositleri pulmoner lökositlerden ayırt etmenin etkili ve güvenilir yöntemlerini açıklıyoruz. En iyi perfüzyon teknikleriyle bile, çalışmalar akciğerde dolaşımdan kalan CD45 ⁺ 'nın devam ettiğini ortaya koymuştur. Bu, dolaşımdaki ritimler ile akciğerdeki ritimleri ayırt etme yeteneğini bozar. Bu etki, akciğer iltihabı vakalarında daha da artar. Bu, özellikle inflamasyonun sirkadiyen regülasyonu ile ilgilidir.

Sirkadiyen ritimler, 24 saatlik bir periyotla meydana gelen çeşitli biyolojik süreçlerdeki günlük salınımları ifade eder. Sirkadiyen sistem, enfeksiyon tehdidi gibi çevresindeki değişikliklerle karşı karşıya kaldığında konakçıya koruma sağlayan, evrimsel olarak korunmuş bir öngörü mekanizmasıdır. Hücresel düzeyde, saat, çekirdek saat genlerini içeren kendi kendini idame ettiren transkripsiyonel-translasyonel geri bildirim döngüleri halinde düzenlenir¹. Bağışıklık sisteminin, patojenlere ve enflamatuar hakaretlere^tepkisini etkileyen kendi saati vardır ^2,3. Sürekli çevreye maruz kalan bir organ olarak akciğerde sirkadiyen ritimler özellikle önemlidir⁴. Akciğerdeki çeşitli bağışıklık süreçleri saat kontrolü altındadır ^5,6,7. Bununla birlikte, akciğerdeki çeşitli biyolojik süreçlerin ve sistemik dolaşımın fazı aynı^{değildir 8}, bu da buna bağlı olarak, akciğerdeki lökositlerin salınımlarının ve dolaşımın aynı olmayabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, pulmoner ve intravasküler lökositleri etkili bir şekilde ayırt etmek için bir yönteme sahip olmak sirkadiyen bağlamda kritik olacaktır.

Bu çalışmanın amacı, intravasküler ve intraparankimal lökositleri güvenilir bir şekilde ayırt edebilecek bir yöntem geliştirmekti. Bunun için intravasküler lökosit etiketlemesi ve akciğer sindirim yöntemi kullandık. İntravasküler lökositlerin etiketlenmesi için, büyük bir kan damarını hedef alan ve tüm suş ve boyutlardaki farelerde tekrarlanabilir şekilde kullanılabilen intrajuguler enjeksiyon kullanıyoruz. Diğer birçok yöntem, Bl6 farelerinde^{gerçekleştirilmesi} çok daha zor olan kuyruk damar enjeksiyonu ^9,10'u kullanmıştır 11. İntrajuguler enjeksiyon anestezi kullanımını gerektirir ve en iyi diseksiyon mikroskobu veya büyüteç lupları ile doğrudan görselleştirme altında yapılır. Bu nedenle, intrajuguler enjeksiyonun kolaylığı ve güvenilirliği, anestezi ve özel ekipman ihtiyacına karşı tartılmalıdır. Bununla birlikte, bu ekipmanların çoğu araştırma laboratuvarında hazır bulunması göz önüne alındığında, bunu sınırlayıcı bir faktör olarak görmüyoruz. Bununla birlikte, duruma göre bir değerlendirme ihtiyatlı görünmektedir.

Tüm hayvan çalışmaları, Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun şartlarını karşıladı.

NOT: Genel süreç 1) intravenöz CD45 etiketlemesi, 2) hasat, 3) sindirim ve 4) boyama ve akış sitometrisine ayrılabilir. Bu adımlar Şekil 1'de özetlenmiştir.

1. Çözeltiler / Reaktif hazırlama

1. 500 mL DMEM'e 5 mL 2 mM L-glutamin, 20 mL Fetal Sığır Serumu (FBS), 1 mL 2-merkaptoetanol ve 10 mL Kalem / Strep ekleyerek Dissosiyasyon Ortamı hazırlayın.
   NOT: Ayrışma Ortamı, 2-4 °C'de saklandığında 2 aya kadar stabildir.
2. Magnezyum veya kalsiyum içermeyen 500 mL PBS'ye 10 mL FBS ve 500 mg sodyum azid ekleyerek Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) Tamponu hazırlayın.
   NOT: Sodyum azid ilavesi ile FACS Tampon 2-4 °C'de aylarca saklanabilir.
3. Numunenin alındığı gün, DNaz ve Liberaz çözeltilerini 1:100 seyreltmede Dissosiyasyon Ortamına ekleyin (ör., her 1 mL Ayrışma Ortamı için 10 μL DNaz ve Liberaz ekleyin).
   NOT: Her fare için, tüm akciğeri sindirmek için 10 mL/fare ve akciğerin yarısı için 5 mL/fare gerekir.

2. İntravenöz CD45 etiketleme

1. Bu deney için, 8-12 haftalık yetişkin C57Bl6 fareleri kullanın.
2. Fareleri tercih edilen ajanlarla uyuşturun. Bu amaçla ksilazin ve ketamin bir kombinasyonu kullanıldı, ancak diğer ajanlar da kabul edilebilir. Amaç, yaklaşık 5-10 dakika süren orta ve derin düzeyde anestezi elde etmektir.
   NOT: Ksilazin ve ketamin anestezi karışımı intraperitoneal olarak uygulanır. 10-15 mg / kg ksilazin ve 120-150 mg / kg ketamin kullanın.
3. Pedal refleksi negatif olduğunda, hayvanı sırt üstü yatırın ve başını mümkün olduğunca merkezi tutmak için uzuvlarını nazikçe bantlayın.
4. Cildi forseps ile kaldırarak ve keskin cerrahi makasla keserek juguler ven ve göğüs kasını ortaya çıkarın.
5. 28 G'lik bir iğne kullanarak juguler ven içine 200 μL anti-CD45 antikoru (akış sitometrisi dereceli antikor; PBS'de 1:300 oranında seyreltilmiş) enjekte edin. Antikorun damar sistemi boyunca dolaşabilmesi için 2-4 dakika bekleyin.
   NOT: Göğüs kasından juguler ven içine sığ bir açıdan girilmesi, önemli miktarda kanamanın oluşmasını önler.
6. Daha sonra hayvanı 10 dakika boyunca CO_2'ye maruz bırakarak ötenazi yapın. Akciğer perfüzyonuna devam edin ve akciğerleri ve diğer dokuları toplayın.
   NOT: Hayvanların ötenazisi için AVMA yönergelerine uyan diğer herhangi bir insancıl ötenazi yöntemi de kabul edilebilir.

3. Diseksiyon/Hasat (Şekil 1)

1. Hayvanı düz bir tahta üzerine sırt üstü yatırın ve başını ortada tutarak pençeleri aşağı doğru sabitleyin.
2. Vücuda% 70 etanol püskürtün. Akciğeri, kalbi ve trakeayı ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunu forseps ve makasla açın.
3. Kalbin sol ventrikülünde küçük bir kesi yaparak ve sağ ventrikülden 10 mL soğuk PBS enjekte ederek akciğeri perfüze edin.
4. Trakeadaki bir açıklığı kesin ve intravenöz bir kanül yerleştirin. Kanül içeri girdikten sonra, trakeanın altından yaklaşık 6-8 cm uzunluğunda bir dikiş ipi geçirin ve kanüle iki kez bağlayın.
5. Cerrahi ipi kanülün içine sokun ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi Dissosiyasyon Ortamı (yarım akciğer için 5 mL veya tüm akciğer için 10 mL) içeren bir şırınga takın.
6. Akciğeri vücudun geri kalanından nazikçe kesin ve şırıngayı akciğer takılı olarak 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.

4. Tek hücreli süspansiyona sindirim

1. Akciğeri 37 ° C'de 30-40 dakika inkübe edin, her 5 dakikada bir 1 mL (akciğerin yarısı için) veya 2 mL (tüm akciğer için) Dissosiyasyon Ortamı damlatın.
2. Tüm ortam damlatıldıktan sonra, şırıngayı ve kanülü çıkarın ve daha iyi verim için 50 mL konik tüpü, inkübasyonun geri kalanı için 180 rpm'de çalkalanan bir su banyosuna yerleştirin.
   NOT: Alternatif olarak, tüpler her 5 dakikada bir manuel olarak çalkalanabilir.
3. 10 mL PBS ekleyin ve reaksiyonu durdurmak için 1 dakika kuvvetlice çalkalayın.
4. Çözeltiyi bir hücre süzgecinden (70 μm) 50 mL'lik yeni bir konik tüpe geçirin. Herhangi bir doku kümesini süzgeçten geçirmek için 5 mL'lik bir şırınga lastik tıpa kullanın. Son hacim 30 mL olacak şekilde PBS ekleyin.
5. Numuneleri 1.200 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı atın. Kalan çözeltiyi pipetleyin.
6. 1 mL Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Lizis Tamponu ekleyin ve pipetleyerek hücre peleti ile karıştırın.
7. Oda sıcaklığında 60-90 s inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için son hacim 30 mL olacak şekilde PBS ekleyin.
   NOT: Kuluçka süresi, hücre peletindeki kan miktarına bağlıdır; Hücre peleti ne kadar kırmızı olursa, kuluçka süresi o kadar uzun olur.
8. Numuneleri 1.200 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı atın. Kalan çözeltiyi pipetleyin.
9. Hücre peletine 1 mL FAC tamponu ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.

5. Akış sitometrisi için boyama hücreleri

1. Hücre askıya alma durumundaki toplam hücre sayısını belirlemek için bir hücre sayacı kullanın.
2. Hücre süspansiyonunu, numune başına toplam 3 x 10⁶ hücre olacak şekilde etiketli her bir FACS tüpüne aktarın.
3. Fc Block (1:100 seyreltilmiş) ekleyin ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
4. Tüpleri 1.200 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı atın.
5. Numuneleri belirli bir antikor karışımı ile boyayın ve ışıktan korunan buz üzerinde 20 dakika inkübe edin (yani alüminyum folyo ile kaplanarak). Tüpleri inkübasyonun yarısında tüp tutucusuna karşı raflayarak karıştırın.
6. Yıkamak için 1 mL FACS tamponu ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.
7. Süspansiyonu 35 μm'lik bir süzgeçten yavaşça pipetleyerek hücre süspansiyonunu başka bir FACS tüpüne aktarın.
8. Tüpleri 1.200 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı atın.
9. 150 μL FACS tamponu ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.
10. Numuneleri çalıştırmadan hemen önce her tüpe 10 μL DAPI (1:100) ekleyin.
    NOT: Numuneler artık akış sitometresinde çalıştırılmaya hazırdır.

Bu tekniği kullanarak, saf ayrışmış akciğerlerin toplam hücre sayısı (temsili veriler için sadece sol loblar kullanıldı) 27.3 x 10⁶ ila 71.1 x 10⁶ hücre / mL arasındaydı. Boyuta göre açı yaptıktan ve çiftler ve ölü hücreleri dışarı çıkardıktan sonra ( Şekil 2'deki geçit şeması), lökosit sayıları 6.9 x 10⁶ ila 13.5 x 10⁶ hücre / mL arasında değişmektedir. Akciğerleri temizlem...

Akciğer iltihabı ve pulmoner immün yanıtların dikkatli çalışmaları, birçok hastalık durumunun anlaşılması için çok önemlidir. Akış sitometrisi, pulmoner lökositlere fonksiyonel ilgiyi numaralandırmak ve atfetmek için rutin olarak kullanılır. Lökositlerin işlevi, en azından kısmen bulundukları yere bağlıdır. Mükemmel perfüzyon protokollerinden sonra bile birçok intravasküler lökositin akciğerlerde kaldığını destekleyen birikmiş kanıtlar olmasın...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma NHLBI-K08HL132053 (SS) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, diseksiyon mikroskobuna ve çalkalama su banyosuna erişim için Dr. G. A. FitzGerald'a teşekkür eder.