Отличие внутрилегочных иммунных клеток от внутрисосудистых иммунных клеточных популяций: внутрияремный доступ

Целью настоящего исследования является описание протокола дифференциации внутрисосудистых и интрапаренхиматозных иммунных клеток в исследованиях воспаления легких. Мы используем внутрияремную инъекцию флуоресцентного меченого антитела перед забором легких. Кроме того, мы используем процесс переваривания легких, основанный на инфляции, для улучшения выхода лейкоцитов из легких.

Циркадные ритмы относятся к колебаниям в различных биологических процессах, которые происходят с периодом в 24 часа. На молекулярном уровне такие ритмы состоят из сети транскрипционно-трансляционных петель обратной связи (TTFL) генов основных часов. Отдельные ткани и системы органов, в том числе и иммунная система, имеют свои часы. В системном кровообращении различные члены популяции CD45⁺ колеблются в течение дня; однако многие из этих ритмов не идентичны или даже не сходны в популяции CD45⁺ лейкоцитов, резидентных в тканях. При изучении роли циркадной регуляции воспаления легких, может потребоваться исследование CD45⁺ в легких. Однако, несмотря на оптимизированные методы перфузии, лейкоциты, захваченные из кровообращения, сохраняются в легких. Целью разработки этого протокола было различие между внутрисосудистыми и внутрипаренхиматозными лейкоцитами. С этой целью мышам вводят флуоресцентное меченое антитело к CD45 внутрияремное незадолго до забора легких. После этого легкое переваривается с использованием специальной техники разложения легких для получения суспензии из одной клетки. Образец окрашивают на обычную панель антител к интрапаренхиматозным иммунным клеткам (включая другое антитело к CD45). Проточно-цитометрический анализ показывает четкое выяснение популяций. Таким образом, метод маркировки и определения внутрилегочных CD45⁺ клеток будет особенно важен в тех случаях, когда поведение внутрилегочных и циркулирующих иммунных клеток численно и функционально различается.

Здесь описаны эффективные и достоверные методы дифференциации внутрисосудистых лейкоцитов от легочных лейкоцитов. Исследования показали, что даже при использовании самых лучших методов перфузии остаточный CD45⁺ от циркуляции сохраняется в легких. Это ухудшает способность различать ритмы в кровообращении и легких. Этот эффект еще больше усиливается в случаях воспаления легких. Это особенно актуально для изучения циркадной регуляции воспаления.

Циркадные ритмы относятся к суточным колебаниям в различных биологических процессах, происходящих с периодом 24 ч. Циркадная система является эволюционно консервативным упреждающим механизмом, который обеспечивает защиту хозяина, когда он сталкивается с изменениями в окружающей среде, такими как угроза инфекций. На клеточном уровне часы организованы в самоподдерживающиеся транскрипционно-трансляционные петли обратной связи, содержащие основные гены часов¹. Иммунная система имеет свои собственные часы, которые влияют на ее реакцию на патогенные микроорганизмы и воспалительные процессы ^2,3. Поскольку циркадные ритмы постоянно подвергаются воздействию окружающей среды, циркадные ритмы особенно важны в легких⁴. Различные иммунные процессы в легких находятся под круглосуточным контролем ^5,6,7. Однако фаза различных биологических процессов в легких и системном кровотоке^{не является одним} и тем же8, что, в свою очередь, также предполагает, что колебания лейкоцитов в легких и циркуляции могут быть неидентичными. Таким образом, наличие метода эффективного различения легочных и внутрисосудистых лейкоцитов будет иметь решающее значение в циркадном контексте.

Целью данного исследования было разработать метод, который мог бы надежно дифференцировать внутрисосудистые и внутрипаренхиматозные лейкоциты. Для этого мы использовали мечение внутрисосудистых лейкоцитов и метод переваривания легких. Для мечения внутрисосудистых лейкоцитов мы используем внутрияремную инъекцию, которая нацелена на крупный кровеносный сосуд и может быть воспроизведена у мышей всех штаммов и размеров. Во многих других методах использовалась инъекция в хвостовую вену ^9,10, которая, как известно, сложнее выполнить у мышей Bl6¹¹. Внутрияремная инъекция требует использования анестезии и лучше всего проводится под прямой визуализацией с помощью препарирующего микроскопа или увеличительной лупы. Таким образом, легкость и надежность внутрияремной инъекции следует сопоставлять с необходимостью анестезии и специального оборудования. Однако, учитывая доступность этого оборудования в большинстве исследовательских лабораторий, мы не считаем это ограничивающим фактором. Тем не менее, рассмотрение каждого конкретного случая кажется разумным.

Все исследования на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Пенсильванского университета и соответствовали положениям Руководства по уходу и использованию лабораторных животных.

Примечание: Общий процесс может быть разделен на 1) внутривенное мечение CD45, 2) забор, 3) переваривание и 4) окрашивание и проточную цитометрию. Эти шаги кратко изложены на рисунке 1.

1. Приготовление растворов/реагентов

1. Приготовьте диссоциативную среду, добавив 5 мл 2 мМ L-глутамина, 20 мл фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1 мл 2-меркаптоэтанола и 10 мл Pen/Strep к 500 мл DMEM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциативные среды стабильны до 2 месяцев при хранении при температуре 2-4 °C.
2. Приготовьте буфер для сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS), добавив 10 мл FBS и 500 мг азида натрия к 500 мл PBS без магния или кальция.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С добавлением азида натрия буфер FACS можно хранить при температуре 2-4 °C в течение нескольких месяцев.
3. В день сбора образца добавьте растворы ДНКазы и Либеразы в среду диссоциации в соотношении 1:100 (т. е. добавьте 10 мкл ДНКазы и Либеразы на каждый 1 мл диссоциационной среды).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши для переваривания всего легкого требуется 10 мл/мышь, а для половины легкого требуется 5 мл/мышь.

2. Внутривенное мечение CD45

1. Для этого эксперимента использовали взрослых мышей C57Bl6 в возрасте 8-12 недель.
2. Обезболивайте мышей средствами по выбору. Для этой цели использовалась комбинация ксилазина и кетамина, но приемлемы и другие препараты. Цель состоит в том, чтобы получить умеренный или глубокий уровень анестезии, который длится около 5-10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь для анестезии ксилазина и кетамина вводится внутрибрюшинно. Используйте 10-15 мг/кг ксилазина и 120-150 мг/кг кетамина.
3. Как только педальный рефлекс станет отрицательным, положите животное на спину и аккуратно обмотайте его конечности скотчем, чтобы голова была как можно ближе к центру.
4. Обнажите яремную вену и грудную мышцу, приподняв кожу щипцами и отрезав острыми хирургическими ножницами.
5. Введите 200 мкл антитела против CD45 (антитело класса проточной цитометрии; разведенное в соотношении 1:300 в PBS) в яремную вену с помощью иглы 28 G. Подождите 2-4 минуты, чтобы антитело могло циркулировать по всей сосудистой сети.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Введение через грудную мышцу в яремную вену под небольшим углом предотвращает значительное кровотечение.
6. После этого усыпьте животное путем воздействия CO₂ в течение 10 минут. Приступайте к перфузии легких и забору легких и других тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любой другой метод гуманной эвтаназии, который соответствует рекомендациям AVMA по эвтаназии животных, также приемлем.

3. Вскрытие/сбор урожая (Рисунок 1)

1. Расположите животное на спине на плоской доске и прижмите лапы вниз, держа голову в центре.
2. Опрыскайте тело 70% этанолом. Откройте грудную полость с помощью щипцов и ножниц, чтобы обнажить легкое, сердце и трахею.
3. Перфузируйте легкое, сделав небольшой разрез в левом желудочке сердца и введя 10 мл холодного PBS через правый желудочек.
4. Отрежьте отверстие в трахее и введите внутривенную канюлю. Как только канюля будет вставлена, проденьте шовный шов длиной около 6-8 см под трахею и дважды завяжите его к канюле.
5. Вставьте хирургический нить в канюлю и присоедините шприц, содержащий диссоциативные среды (5 мл для половины легкого или 10 мл для всего легкого), как показано на рисунке 1B.
6. Аккуратно отрежьте легкое от остальной части тела и поместите шприц с прикрепленным легким в коническую трубку объемом 50 мл.

4. Разложение до одноклеточной суспензии

1. Инкубируйте легкое при температуре 37 °C в течение 30-40 минут, вводя 1 мл (на половину легкого) или 2 мл (на все легкое) диссоциативной среды каждые 5 минут.
2. После того, как вся среда будет введена, извлеките шприц и канюлю и поместите коническую трубку объемом 50 мл в водяную баню со скоростью 180 об/мин на оставшуюся часть инкубации для лучшего выхода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, пробирки можно вручную встряхивать каждые 5 минут.
3. Добавьте 10 мл PBS и энергично встряхивайте в течение 1 минуты, чтобы остановить реакцию.
4. Пропустите раствор через сетчатое фильтр (70 мкм) в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Используйте резиновую пробку шприца объемом 5 мл, чтобы пропустить любые комки ткани через ситечко. Добавьте PBS так, чтобы итоговый объем составил 30 мл.
5. Центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 1 200 x g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Отпишите остатки раствора.
6. Добавьте 1 мл буфера для лизиса эритроцитов (RBC) и смешайте с клеточной гранулой с помощью пипетирования.
7. Выдерживать при комнатной температуре в течение 60-90 с. Добавьте PBS так, чтобы итоговый объем составил 30 мл, чтобы остановить реакцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от количества крови в клеточной грануле; Чем краснее клеточная гранула, тем дольше время инкубации.
8. Центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 1 200 x g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Отпишите остатки раствора.
9. Добавьте 1 мл буфера FACs в клеточную гранулу и перемешайте с помощью пипетирования.

5. Окрашивание клеток для проточной цитометрии

1. Используйте счетчик клеток для определения общего количества клеток в клеточной суспензии.
2. Перенесите клеточную суспензию в каждую меченую пробирку FACS так, чтобы всего в образце было 3 x 10⁶ клеток.
3. Добавьте Fc Block (разбавленный 1:100) и выдержите 15 минут на льду.
4. Центрифугируйте пробирки в течение 5 минут при температуре 1 200 x g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы.
5. Окрасить образцы указанной смесью антител и инкубировать в течение 20 минут на защищенном от света льду (т.е. накрыв алюминиевой фольгой). Перемешивайте, прижимая пробирки к держателю пробирок в середине инкубации.
6. Добавьте 1 мл буфера FACS для промывки и перемешайте с помощью пипетирования.
7. Перенесите клеточную суспензию в другую пробирку FACS, медленно пипетируя суспензию через сетчатый фильтр 35 мкм.
8. Центрифугируйте пробирки в течение 5 минут при температуре 1 200 x g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы.
9. Добавьте 150 мкл буфера FACS и перемешайте с помощью пипетирования.
10. Добавьте 10 μL DAPI (1:100) в каждую пробирку непосредственно перед запуском проб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь образцы готовы к запуску на проточном цитометре.

Используя эту методику, общее количество клеток наивных диссоциированных легких (для репрезентативных данных использовались только левые доли) составило от 27,3 x 10⁶ до 71,1 x 10⁶ клеток/мл. После калибровки по размеру и удаления дублетов и мертвых клеток (схема ?...

Тщательные исследования воспаления легких и легочных иммунных реакций имеют решающее значение для понимания многих заболеваний. Проточная цитометрия обычно используется для подсчета и приписывания функциональной значимости легочным лейкоцитам. Функция лейкоцито...

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана NHLBI-K08HL132053 (SS). Авторы благодарят доктора Г. А. Фитцджеральда за доступ к препарирующему микроскопу и встряхивающей водяной бане.