区分肺内免疫细胞和血管内免疫细胞群：颈内入路

当前研究的目的是描述在肺部炎症研究中区分血管内和脑实质内免疫细胞的方案。我们在肺收获前使用荧光标记抗体的颈内注射。此外，我们使用基于充气的肺消化过程来提高肺白细胞的产量。

昼夜节律是指在 24 小时内发生的各种生物过程中的振荡。在分子水平上，这种节律由核心时钟基因的转录-翻译反馈回路 （TTFL） 网络组成。个体组织和器官系统，包括免疫系统，都有自己的时钟。在体循环中，CD45⁺ 群体的不同成员在一天中振荡;然而，在组织驻留的 CD45 ⁺ 白细胞群中，其中许多节律并不相同甚至相似。在研究昼夜节律调节肺部炎症的作用时，可能需要研究肺内的 CD45 ⁺ 。然而，尽管优化了灌注方法，但从循环中捕获的白细胞仍存在于肺部。设计该方案的目标是区分血管内和脑实质内白细胞。为此，在肺收获前不久颈内注射小鼠荧光标记的CD45抗体。此后，使用定制的肺消化技术消化肺以获得单细胞悬液。对样品进行脑实质内免疫细胞常规抗体组（包括另一种 CD45 抗体）染色。流式细胞术分析显示对人群的清晰阐明。因此，当肺内免疫细胞和循环免疫细胞的行为在数量和功能上不同时，标记和定义肺内 CD45 ⁺ 细胞的方法将尤为重要。

我们在这里描述了区分血管内白细胞和肺白细胞的有效和可靠的方法。即使使用最好的灌注技术，研究也表明，循环中残留的 CD45⁺ 仍会持续存在于肺部。这会损害区分循环和肺节律的能力。这种影响在肺部炎症的情况下会进一步放大。这与炎症的昼夜节律调节研究特别相关。

昼夜节律是指以 24 小时为周期发生的各种生物过程中的昼夜振荡。昼夜节律系统是一种进化上保守的预期机制，当宿主面临环境变化（例如感染威胁）时，它会为宿主提供保护。在细胞水平上，时钟被组织成由核心时钟基因¹ 组成的自我维持的转录-翻译反馈回路。免疫系统有自己的时钟，会影响其对病原体和炎症损伤的反应 ^2,3。作为一个经常暴露在环境中的器官，昼夜节律在肺中尤为重要⁴。肺部的各种免疫过程都受到时钟控制 ^5,6,7。然而，肺和体循环中各种生物过程的阶段并不相同⁸，这推而广之，这也表明肺中白细胞和循环的振荡可能并不相同。因此，在昼夜节律环境中，拥有一种有效区分肺白细胞和血管内白细胞的方法将至关重要。

本研究的目的是设计一种能够可靠地区分血管内和脑实质内白细胞的方法。为此，我们使用了血管内白细胞的标记和肺消化法。对于血管内白细胞的标记，我们使用颈内注射，它针对大血管，可以可重复地用于所有菌株和大小的小鼠。许多其他方法都使用了尾静脉注射 ^9,10，众所周知，这在 Bl6 小鼠中更难进行¹¹。颈内静脉注射确实需要使用麻醉，最好在解剖显微镜或放大镜的直接观察下进行。因此，应权衡颈内静脉注射的简便性和可靠性与麻醉和特殊设备的需求。然而，鉴于这些设备在大多数研究实验室中随时可用，我们认为这并不是一个限制因素。然而，逐案考虑似乎是谨慎的。

所有动物研究均已获得宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会的批准，并符合《实验动物护理和使用指南》的规定。

注意：整个过程可分为 1） 静脉内 CD45 标记，2） 收获，3） 消化，以及 4） 染色和流式细胞术。 图 1 总结了这些步骤。

1. 溶液/试剂制备

1. 向 500 mL DMEM 中加入 5 mL 2 mM L-谷氨酰胺、20 mL 胎牛血清 （FBS）、1 mL 2-巯基乙醇和 10 mL Pen/Strep 来制备解离培养基。
   注：解离培养基在 2-4 °C 下储存时可稳定长达 2 个月。
2. 向 500 mL 不含镁或钙的 PBS 中加入 10 mL FBS 和 500 mg 叠氮化钠，制备荧光激活细胞分选 （FACS） 缓冲液。
   注意：添加叠氮化钠后，FACS 缓冲液可在 2-4 °C 下储存数月。
3. 在样品采集当天，将 DNase 和 Liberase 溶液以 1：100 的稀释度添加到解离培养基中（即，每 1 mL 解离培养基添加 10 μL DNase 和 Liberase）。
   注：对于每只小鼠，消化整个肺需要 10 mL/小鼠，半个肺需要 5 mL/小鼠。

2. 静脉注射 CD45 标记

1. 对于该实验，使用 8-12 周龄的成年 C57Bl6 小鼠。
2. 用选择的药物麻醉小鼠。为此目的使用了甲苯噻嗪和氯胺酮的组合，但其他药物也是可以接受的。目的是获得持续约 5 -10 分钟的中度至深度麻醉。
   注意：甲苯噻嗪和氯胺酮麻醉混合物经腹膜内给药。使用 10-15 mg/kg 的甲苯噻嗪和 120-150 mg/kg 的氯胺酮。
3. 一旦踏板反射为负，将动物仰卧并轻轻地用胶带固定其四肢，以使头部尽可能居中。
4. 用镊子提起皮肤并用锋利的手术剪刀剪断，露出颈静脉和胸肌。
5. 使用 28 G 针头将 200 μL 抗 CD45 抗体（流式细胞术级抗体;在 PBS 中以 1：300 稀释）注射到颈静脉中。等待 2-4 分钟，以便抗体可以在整个脉管系统中循环。
   注意：从浅角度通过胸肌进入颈静脉可防止发生大量出血。
6. 此后，通过暴露于 CO₂ 10 分钟对动物实施安乐死。进行肺灌注并收集肺和其他组织。
   注意：任何其他符合 AVMA 动物安乐死指南的人道安乐死方法也是可以接受的。

3. 解剖/收获（图 1）

1. 将动物仰卧在平板上，将爪子固定下来，保持头部居中。
2. 用 70% 乙醇喷洒身体。用镊子和剪刀打开胸腔，露出肺、心脏和气管。
3. 通过在心脏的左心室做一个小切口并通过右心室注射 10 mL 冷 PBS 来灌注肺部。
4. 在气管上剪一个开口并插入静脉插管。插管插入后，将一根约 6-8 厘米长的缝合线穿过气管下方，并将其系在套管上两次。
5. 将手术绳塞入套管中，并连接一个含有解离培养基（半肺 5 mL 或整个肺 10 mL）的注射器，如图 1B 所示。
6. 轻轻地将肺与身体其他部分切开，然后将带有肺的注射器放入 50 mL 锥形管中。

4. 消化成单细胞悬液

1. 在 37 °C 下孵育肺 30-40 分钟，每 5 分钟滴注 1 mL（半个肺）或 2 mL（整个肺）解离培养基。
2. 滴入所有培养基后，取出注射器和套管，将 50 mL 锥形管以 180 rpm 的速度放入振荡水浴中，进行剩余的孵育，以获得更好的产量。
   注：或者，可以每 5 分钟手动摇动一次试管。
3. 加入 10 mL PBS 并剧烈摇晃 1 分钟以终止反应。
4. 将溶液通过细胞过滤器 （70 μm） 进入新的 50 mL 锥形管中。使用 5 mL 注射器橡胶塞将任何组织块穿过过滤器。加入 PBS，使最终体积为 30 mL。
5. 将样品在 1,200 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟。 弃去上清液，不要干扰沉淀。吸出任何剩余的溶液。
6. 加入 1 mL 红细胞 （RBC） 裂解缓冲液，并通过移液与细胞沉淀混合。
7. 在室温下孵育 60-90 秒。加入 PBS，使最终体积为 30 mL 以终止反应。
   注：孵育时间取决于细胞沉淀中的血液量;细胞沉淀越红，孵育时间越长。
8. 将样品在 1,200 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟。 弃去上清液，不要干扰沉淀。吸出任何剩余的溶液。
9. 向细胞沉淀中加入 1 mL FACs 缓冲液，并通过移液混合。

5. 用于流式细胞术的细胞染色

1. 使用细胞计数仪确定细胞悬液中的细胞总数。
2. 将细胞悬液转移到每个标记的 FACS 管中，使每个样品总共有 3 x 10⁶ 个细胞。
3. 加入 Fc 模块（1：100 稀释），在冰上孵育 15 分钟。
4. 将试管在 1,200 x g 和 4 °C 下离心 5 分钟。 弃去上清液，不要干扰沉淀。
5. 用指定的抗体混合物对样品进行染色，并在避光的冰上孵育 20 分钟（即，用铝箔覆盖）。在孵育中途将试管固定在试管支架上，混匀。
6. 加入 1 mL FACS 缓冲液洗涤并通过移液混合。
7. 通过将悬浮液缓慢移液通过 35 μm 过滤器，将细胞悬液转移到另一个 FACS 管中。
8. 将试管在 1,200 x g 和 4 °C 下离心 5 分钟。 弃去上清液，不要干扰沉淀。
9. 加入 150 μL FACS 缓冲液并通过移液混合。
10. 在运行样品之前，立即向每个试管中加入 10 μL DAPI （1：100）。
    注：样品现在可以在流式细胞仪上运行。

使用这种技术，幼稚分离肺的总细胞计数 （仅左叶用于代表性数据） 在 27.3 x 10⁶ 至 71.1 x 10⁶ 个细胞/mL 之间。在对大小设门并设门双合体和死细胞（ 图 2 中的设门方案）后，白细胞计数范围为 6.9 x 10⁶ 至 13.5 x 10⁶ 个细胞/mL。在实验中，即使在灌注以清除肺部后仍被困住的循环白细胞约占活细胞的 4% 至 13%。虽然解离?...

仔细研究肺部炎症和肺部免疫反应对于了解许多疾病状况至关重要。流式细胞术通常用于计数和归因于肺白细胞的功能相关性。白细胞的功能至少部分取决于它们的发现位置。尽管有越来越多的证据支持，即使在完美的灌注方案之后，许多血管内白细胞仍存在于肺部，但大多数研究并未区分肺内和血管内白细胞。此外，根据制备方法，肺灌注后残留的血管内白细胞很可能...

作者没有什么可披露的。

这项工作得到了 NHLBI-K08HL132053 （SS） 的支持。作者感谢 G. A. FitzGerald 博士提供解剖显微镜和摇动水浴。