הבחנה בין תאי חיסון תוך-ריאתיים לבין אוכלוסיות תאי חיסון תוך-וסקולריים: הגישה התוך-צווארית

מטרת המחקר הנוכחי היא לתאר פרוטוקול להבחנה בין תאי חיסון תוך-וסקולריים ותוך-פרנכימליים במחקרים על דלקת ריאות. אנו משתמשים בהזרקה תוך-צווארית של נוגדן מתויג פלואורסצנטי לפני קצירת הריאות. יתר על כן, אנו משתמשים בתהליך עיכול ריאות מבוסס אינפלציה כדי לשפר את תפוקת הלויקוציטים מהריאה.

מקצבים צירקדיים מתייחסים לתנודות בתהליכים ביולוגיים שונים המתרחשים עם תקופה של 24 שעות. ברמה המולקולרית, מקצבים כאלה מורכבים מרשת של לולאות משוב שעתוק-תרגום (TTFL) של גני שעון הליבה. לרקמות ומערכות איברים בודדות, כולל מערכת החיסון, יש שעון משלהן. במחזור המערכתי, חברים שונים באוכלוסיית CD45⁺ מתנדנדים לאורך היום; עם זאת, רבים מהמקצבים הללו אינם זהים או אפילו דומים באוכלוסיית הלויקוציטים CD45⁺ השוכנים ברקמות. כאשר חוקרים את תפקיד הוויסות הצירקדי של דלקת ריאות, ייתכן שיהיה צורך לחקור CD45⁺ בתוך הריאה. עם זאת, למרות שיטות הזלוף האופטימליות, לויקוציטים הכלואים ממחזור הדם ממשיכים להתקיים בריאות. המטרה בתכנון פרוטוקול זה הייתה להבחין בין לויקוציטים תוך-וסקולריים לתוך-פרנכימליים. לשם כך, עכברים מוזרקים עם נוגדן CD45 מתויג פלואורסצנטי תוך צווארי זמן קצר לפני קציר הריאות. לאחר מכן, הריאה מתעכלת בטכניקת עיכול ריאות מותאמת אישית לקבלת תרחיף תא בודד. הדגימה מוכתמת עבור הפאנל הרגיל של נוגדנים לתאי חיסון תוך-פרנכימליים (כולל נוגדן CD45 נוסף). ניתוחים פלוציטומטריים מראים הבהרה ברורה של האוכלוסיות. לפיכך, שיטת התיוג וההגדרה של תאי CD45⁺ תוך ריאתיים תהיה חשובה במיוחד כאשר ההתנהגות של תאי חיסון תוך-ריאתיים ותאי חיסון במחזור הדם נבדלת מבחינה מספרית ותפקודית.

אנו מתארים כאן שיטות יעילות ואמינות להבדיל בין לויקוציטים תוך-וסקולריים לבין לויקוציטים ריאתיים. אפילו עם טכניקות הזלוף הטובות ביותר, מחקרים גילו ששאריות CD45⁺ ממחזור הדם נמשכות בריאות. זה פוגע ביכולת להבחין בין המקצבים במחזור הדם לבין הריאות. השפעה זו מוגברת עוד יותר במקרים של דלקת ריאות. זה רלוונטי במיוחד לחקר ויסות השעון הביולוגי של דלקת.

מקצבים צירקדיים מתייחסים לתנודות היומיות בתהליכים ביולוגיים שונים המתרחשים בתקופה של 24 שעות. המערכת הצירקדית היא מנגנון ציפייה משומר אבולוציונית המעניק הגנה למארח כאשר הוא מתמודד עם שינויים בסביבתו כגון איום של זיהומים. ברמה התאית, השעון מאורגן בלולאות משוב שעתוק-תרגום עצמאיות המרכיבות את גני הליבה של השעון¹. למערכת החיסון יש שעון משלה שמשפיע על תגובתה לפתוגנים ולעלבונות דלקתיים ^2,3. כאיבר החשוף לסביבה כל הזמן, השעון הביולוגי חשוב במיוחד בריאה⁴. תהליכים חיסוניים שונים בריאה נמצאים תחת בקרת שעון ^5,6,7. עם זאת, השלב של תהליכים ביולוגיים שונים בריאה ובמחזור הדם המערכתי אינם זהים⁸, מה שמרמז גם על כך שהתנודות של לויקוציטים בריאה ובמחזור הדם עשויות להיות לא זהות. לפיכך, שיטה להבחין ביעילות בין לויקוציטים ריאתיים ותוך-וסקולריים תהיה קריטית בהקשר הצירקדי.

מטרת מחקר זה הייתה להמציא שיטה שתוכל להבדיל בין לויקוציטים תוך-וסקולריים לתוך-פרנכימליים באופן מהימן. לשם כך השתמשנו בתיוג של לויקוציטים תוך-וסקולריים ושיטת עיכול ריאות. לסימון לויקוציטים תוך-וסקולריים, אנו משתמשים בהזרקה תוך-צווארית, המכוונת לכלי דם גדול וניתן להשתמש בה באופן חוזר בעכברים מכל הזנים והגדלים. שיטות רבות אחרות השתמשו בהזרקת וריד זנב ^9,10, הידועה לשמצה כקשה יותר לביצוע בעכברי Bl6¹¹. ההזרקה התוך-צווארית אכן מחייבת שימוש בהרדמה והיא נעשית בצורה הטובה ביותר בהדמיה ישירה עם מיקרוסקופ מנתח או זכוכית מגדלת. לפיכך, יש לשקול את הקלות והאמינות של ההזרקה התוך-צווארית מול הצורך בהרדמה ובציוד מיוחד. עם זאת, בהתחשב בזמינות הציוד הזה ברוב מעבדות המחקר, איננו רואים בכך גורם מגביל. עם זאת, שיקול כל מקרה לגופו נראה נבון.

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פנסילבניה ועמדו בתנאי המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

הערה: ניתן לחלק את התהליך הכולל ל-1) תיוג CD45 תוך ורידי, 2) קציר, 3) עיכול ו-4) צביעה וזרימה ציטומטרית. שלבים אלה סוכמו באיור 1.

1. הכנת פתרונות/ריאגנטים

1. הכן את מדיית הדיסוציאציה על ידי הוספת 5 מ"ל של 2 מ"מ L-גלוטמין, 20 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 1 מ"ל של 2-מרקפטואתנול ו-10 מ"ל של עט/סטרפטוקוקוקוס ל-500 מ"ל DMEM.
   הערה: מדיית דיסוציאציה יציבה עד חודשיים כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורה של 2-4 מעלות צלזיוס.
2. הכן מאגר מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) על ידי הוספת 10 מ"ל FBS ו-500 מ"ג נתרן אזיד ל-500 מ"ל PBS ללא מגנזיום או סידן.
   הערה: בתוספת נתרן אזיד, ניתן לאחסן את FACS Buffer בטמפרטורה של 2-4 מעלות צלזיוס למשך חודשים.
3. ביום איסוף הדגימה, הוסף את פתרונות ה-DNase וה-Liberase למדיית הדיסוציאציה בדילול של 1:100 (כלומר, הוסף 10 מיקרוליטר של DNase ו-Liberase עבור כל 1 מ"ל של מדיית דיסוציאציה).
   הערה: עבור כל עכבר, עיכול הריאה כולה דורש 10 מ"ל/עכבר ומחצית מהריאה דורשת 5 מ"ל/עכבר.

2. תיוג CD45 תוך ורידי

1. לניסוי זה, השתמשו בעכברים בוגרים C57Bl6 בגילאי 8-12 שבועות.
2. להרדים את העכברים עם חומרים לבחירה. שילוב של קסילזין וקטמין שימש למטרה זו, אך גם חומרים אחרים מקובלים. המטרה היא לקבל רמת הרדמה בינונית עד עמוקה שנמשכת כ-5-10 דקות.
   הערה: תערובת ההרדמה קסילזין וקטמין ניתנת תוך צפקית. השתמש ב-10-15 מ"ג/ק"ג קסילזין ו-120-150 מ"ג/ק"ג קטמין.
3. ברגע שרפלקס הדוושה שלילי, מקם את החיה על גבה והדביק את גפיה בעדינות כדי לשמור על הראש מרכזי ככל האפשר.
4. חשוף את וריד הצוואר ושריר החזה על ידי הרמת העור בעזרת מלקחיים וחיתוך במספריים כירורגיות חדות.
5. להזריק 200 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-CD45 (נוגדן בדרגת זרימה ציטומטרית; מדולל 1:300 ב-PBS) לווריד הצוואר באמצעות מחט 28 G. המתן 2-4 דקות כדי שהנוגדן יוכל להסתובב בכל כלי הדם.
   הערה: כניסה דרך שריר החזה לווריד הצוואר מזווית רדודה מונעת דימום ניכר.
6. לאחר מכן המתת חסד של בעל החיים על ידי חשיפה ל-CO₂ למשך 10 דקות. המשך לזלוף ריאות וקצור ריאות ורקמות אחרות.
   הערה: כל שיטה אחרת של המתת חסד הומאנית העומדת בהנחיות AVMA להמתת חסד של בעלי חיים מקובלת גם היא.

3. דיסקציה/קציר (איור 1)

1. מקם את החיה על גבה על קרש שטוח והצמד את הכפות כלפי מטה, תוך שמירה על הראש במרכז.
2. מרססים את הגוף באתנול 70%. פתח את חלל בית החזה בעזרת מלקחיים ומספריים כדי לחשוף את הריאה, הלב וקנה הנשימה.
3. לחלחל את הריאה על ידי ביצוע חתך קטן בחדר השמאלי של הלב והזרקת 10 מ"ל PBS קר דרך החדר הימני.
4. חותכים פתח בקנה הנשימה ומכניסים צינורית תוך ורידית. לאחר שהצינורית נכנסת, העבירו חוט תפר באורך של כ-6-8 ס"מ מתחת לקנה הנשימה וקשרו אותו פעמיים לצינורית.
5. הכניסו את חוט הניתוח לתוך הצינורית והצמידו מזרק המכיל חומר דיסוציאציה (5 מ"ל לחצי ריאה או 10 מ"ל לריאה שלמה) כפי שמתואר באיור 1B.
6. חתכו בעדינות את הריאה משאר הגוף והניחו את המזרק כשהריאה מחוברת לצינור חרוטי של 50 מ"ל.

4. עיכול לתרחיף תא בודד

1. יש לדגור על הריאה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-40 דקות, ולהחדיר 1 מ"ל (למחצית הריאה) או 2 מ"ל (לכל הריאה) של דיסוציאציה מדיה כל 5 דקות.
2. לאחר החדרת כל המדיה, הסר את המזרק והצינורית והנח את הצינור החרוטי בנפח 50 מ"ל לאמבט מים רועדים ב-180 סל"ד למשך שארית הדגירה לתשואה טובה יותר.
   הערה: לחלופין, ניתן לנער את הצינורות באופן ידני כל 5 דקות.
3. הוסף 10 מ"ל PBS ונער במרץ במשך דקה אחת כדי לעצור את התגובה.
4. העבירו את התמיסה דרך מסננת תאים (70 מיקרומטר) לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. השתמש בפקק גומי מזרק בנפח 5 מ"ל כדי להעביר גושי רקמה דרך המסננת. הוסף PBS כך שהנפח הסופי יהיה 30 מ"ל.
5. צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורה של 1,200 x g ו-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. הוצא את כל הפתרון שנותר.
6. הוסף 1 מ"ל של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות (RBC) וערבב עם כדור התא על ידי פיפטינג.
7. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 60-90 שניות. הוסף PBS כך שהנפח הסופי יהיה 30 מ"ל כדי לעצור את התגובה.
   הערה: זמן הדגירה תלוי בכמות הדם בכדור התא; ככל שכדור התא אדום יותר, כך זמן הדגירה ארוך יותר.
8. צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורה של 1,200 x g ו-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. הוצא את כל הפתרון שנותר.
9. הוסף 1 מ"ל של מאגר FAC לגלולת התא וערבב על ידי פיפטינג.

5. צביעת תאים לזרימה ציטומטרית

1. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים בתרחיף התא.
2. העבר את תרחיף התאים לכל צינור FACS מסומן כך שיהיו 3 x 10⁶ תאים בסך הכל לכל דגימה.
3. מוסיפים בלוק Fc (מדולל 1:100) ודוגרים במשך 15 דקות על קרח.
4. צנטריפוגה את הצינורות למשך 5 דקות בטמפרטורה של 1,200 x g ו-4 °C. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
5. צבעו את הדגימות בתערובת נוגדנים מוגדרת ודגרו במשך 20 דקות על קרח מוגן מאור (כלומר, על ידי כיסוי בנייר אלומיניום). מערבבים על ידי צינורות מתלים כנגד מחזיק הצינור באמצע הדגירה.
6. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS לשטיפה ולערבב על ידי פיפטינג.
7. העבר את מתלה התא לצינור FACS אחר על ידי הזרמת המתלה לאט דרך מסננת של 35 מיקרומטר.
8. צנטריפוגה את הצינורות למשך 5 דקות בטמפרטורה של 1,200 x g ו-4 °C. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
9. הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר FACS וערבב על ידי פיפטינג.
10. הוסף 10 מיקרוליטר של DAPI (1:100) לכל צינור מיד לפני הפעלת הדגימות.
    הערה: הדגימות מוכנות כעת להפעלה על ציטומטר הזרימה.

באמצעות טכניקה זו, ספירת התאים הכוללת של הריאות המנותקות הנאיביות (רק האונות השמאליות שימשו לנתונים המייצגים) הייתה בין 27.3 x 10⁶ ל-71.1 x 10⁶ תאים למ"ל. לאחר שער על גודל ושער כפולים ותאים מתים (סכימת שער באיור 2), ספירת הלויקוציטים נעה בין 6.9 x 10⁶ ל-...

מחקרים מדוקדקים של דלקת ריאות ותגובות חיסוניות ריאתיות חיוניים להבנת מצבי מחלה רבים. ציטומטריית זרימה משמשת באופן שגרתי כדי לספור ולייחס רלוונטיות תפקודית ללויקוציטים ריאתיים. תפקידם של לויקוציטים תלוי לפחות בחלקו במקום שבו הם נמצאים. למרות שישנן עדויות מצטברות התומכ...

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי NHLBI-K08HL132053 (SS). המחברים מודים לד"ר ג.א. פיצג'רלד על הגישה למיקרוסקופ מנתח ולאמבט מים רועדים.