Unterscheidung von intrapulmonalen Immunzellen von intravaskulären Immunzellpopulationen: der intrajuguläre Ansatz

Ziel der vorliegenden Studie ist es, ein Protokoll zur Unterscheidung zwischen intravaskulären und intraparenchymalen Immunzellen in Studien zur Lungenentzündung zu beschreiben. Wir verwenden eine intrajuguläre Injektion eines fluoreszierenden markierten Antikörpers vor der Lungenentnahme. Darüber hinaus verwenden wir einen inflationsbasierten Lungenverdauungsprozess, um die Ausbeute an Leukozyten aus der Lunge zu verbessern.

Zirkadiane Rhythmen beziehen sich auf Schwingungen in verschiedenen biologischen Prozessen, die mit einer Periode von 24 Stunden auftreten. Auf molekularer Ebene bestehen solche Rhythmen aus einem Netz von transkriptionell-translationalen Rückkopplungsschleifen (TTFL) von Kernuhr-Genen. Einzelne Gewebe und Organsysteme, zu denen auch das Immunsystem gehört, haben eine eigene Uhr. Im systemischen Kreislauf oszillieren verschiedene Mitglieder der CD45⁺ -Population über den Tag; Viele dieser Rhythmen sind jedoch in der geweberesidenten CD45^+- Leukozytenpopulation nicht identisch oder sogar ähnlich. Bei der Untersuchung der Rolle der zirkadianen Regulation von Lungenentzündungen muss möglicherweise CD45⁺ in der Lunge untersucht werden. Trotz optimierter Perfusionsmethoden verbleiben jedoch die aus dem Blutkreislauf eingeschlossenen Leukozyten in der Lunge. Ziel bei der Entwicklung dieses Protokolls war es, zwischen intravaskulären und intraparenchymalen Leukozyten zu unterscheiden. Zu diesem Zweck wird Mäusen kurz vor der Lungenentnahme intrajugulär ein fluoreszierend markierter CD45-Antikörper injiziert. Danach wird die Lunge mit einer maßgeschneiderten Lungenverdauungstechnik verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Probe wird für das reguläre Panel von Antikörpern für intraparenchymale Immunzellen (einschließlich eines weiteren CD45-Antikörpers) gefärbt. Durchflusszytometrische Analysen zeigen eine klare Aufklärung der Populationen. Daher wird die Methode zur Markierung und Definition von intrapulmonalen CD45⁺ -Zellen besonders wichtig sein, wenn das Verhalten von intrapulmonalen und zirkulierenden Immunzellen numerisch und funktionell unterschiedlich ist.

Wir beschreiben hier effiziente und zuverlässige Methoden zur Unterscheidung von intravaskulären Leukozyten von pulmonalen Leukozyten. Selbst mit den besten Perfusionstechniken haben Studien gezeigt, dass restliches CD45⁺ aus dem Blutkreislauf in der Lunge verbleibt. Dies beeinträchtigt die Fähigkeit, zwischen den Rhythmen im Kreislauf und in der Lunge zu unterscheiden. Dieser Effekt wird bei Lungenentzündungen noch verstärkt. Dies ist besonders relevant für die Untersuchung der zirkadianen Regulation von Entzündungen.

Zirkadiane Rhythmen bezeichnen die täglichen Schwingungen in verschiedenen biologischen Prozessen, die mit einer Periode von 24 h ablaufen. Das zirkadiane System ist ein evolutionär konservierter antizipatorischer Mechanismus, der dem Wirt Schutz bietet, wenn er Veränderungen in seiner Umgebung, wie z. B. der Gefahr von Infektionen, ausgesetzt ist. Auf zellulärer Ebene ist die Uhr in selbsterhaltenden transkriptionell-translationalen Rückkopplungsschleifen organisiert, die die Kern-Uhrengene¹ umfassen. Das Immunsystem hat seine eigene Uhr, die seine Reaktion auf Krankheitserreger und Entzündungskrankheiten beeinflusst ^2,3. Als Organ, das ständig der Umwelt ausgesetzt ist, ist der zirkadiane Rhythmus in der Lunge besonders wichtig⁴. Verschiedene Immunprozesse in der Lunge stehen unter Uhrkontrolle ^5,6,7. Die Phase verschiedener biologischer Prozesse in der Lunge und im systemischen Kreislauf ist jedoch nicht identisch⁸, was im weiteren Sinne auch darauf hindeutet, dass die Schwingungen der Leukozyten in der Lunge und im Kreislauf möglicherweise nicht identisch sind. Daher wird es im zirkadianen Kontext von entscheidender Bedeutung sein, eine Methode zur effizienten Unterscheidung zwischen pulmonalen und intravaskulären Leukozyten zu haben.

Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu entwickeln, mit der intravaskuläre und intraparenchymale Leukozyten zuverlässig unterschieden werden können. Zu diesem Zweck verwendeten wir eine Markierung von intravaskulären Leukozyten und eine Lungenverdauungsmethode. Für die Markierung von intravaskulären Leukozyten verwenden wir die intrajuguläre Injektion, die auf ein großes Blutgefäß abzielt und bei Mäusen aller Stämme und Größen reproduzierbar eingesetzt werden kann. Bei vielen anderen Methoden wurde die Schwanzveneninjektion ^9,10 verwendet, die bei Bl6-Mäusen notorisch schwieriger durchzuführen ist¹¹. Die intrajuguläre Injektion erfordert eine Anästhesie und wird am besten unter direkter Visualisierung mit einem Präpariermikroskop oder Lupen durchgeführt. Daher sollte die Leichtigkeit und Zuverlässigkeit der intrajugulären Injektion gegen die Notwendigkeit einer Anästhesie und einer speziellen Ausrüstung abgewogen werden. Angesichts der leichten Verfügbarkeit dieser Geräte in den meisten Forschungslabors sehen wir dies jedoch nicht als einschränkenden Faktor an. Eine Einzelfallbetrachtung scheint jedoch ratsam.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania genehmigt und erfüllten die Anforderungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

HINWEIS: Der Gesamtprozess kann unterteilt werden in 1) intravenöse CD45-Markierung, 2) Ernte, 3) Verdauung und 4) Färbung und Durchflusszytometrie. Diese Schritte sind in Abbildung 1 zusammengefasst.

1. Lösungen/Reagenzienvorbereitung

1. Bereiten Sie das Dissoziationsmedium vor, indem Sie 5 ml 2 mM L-Glutamin, 20 ml fötales Rinderserum (FBS), 1 ml 2-Mercaptoethanol und 10 ml Pen/Strep zu 500 ml DMEM hinzufügen.
   HINWEIS: Dissoziationsmedien sind bei Lagerung bei 2-4 °C bis zu 2 Monate haltbar.
2. Bereiten Sie einen Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierpuffer (FACS) vor, indem Sie 10 ml FBS und 500 mg Natriumazid zu 500 ml PBS ohne Magnesium oder Kalzium hinzufügen.
   HINWEIS: Mit der Zugabe von Natriumazid kann FACS Buffer monatelang bei 2-4 °C gelagert werden.
3. Am Tag der Probenentnahme geben Sie die DNase- und Livase-Lösungen in einer Verdünnung von 1:100 in das Dissoziationsmedium (d. h. fügen Sie 10 μl DNase und Liberase pro 1 ml Dissoziationsmedium hinzu).
   HINWEIS: Für jede Maus werden für die Verdauung der gesamten Lunge 10 ml/Maus und für die Hälfte der Lunge 5 ml/Maus benötigt.

2. Intravenöse CD45-Markierung

1. Verwenden Sie für dieses Experiment adulte C57Bl6-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen.
2. Betäuben Sie die Mäuse mit Mitteln Ihrer Wahl. Zu diesem Zweck wurde eine Kombination aus Xylazin und Ketamin verwendet, aber auch andere Wirkstoffe sind akzeptabel. Ziel ist es, eine moderate bis tiefe Anästhesie zu erreichen, die etwa 5 -10 Minuten dauert.
   HINWEIS: Die Mischung aus Xylazin und Ketamin-Anästhesie wird intraperitoneal verabreicht. Verwenden Sie 10-15 mg/kg Xylazin und 120-150 mg/kg Ketamin.
3. Sobald der Pedalreflex negativ ist, positionieren Sie das Tier auf dem Rücken und kleben Sie seine Gliedmaßen vorsichtig fest, um den Kopf so mittig wie möglich zu halten.
4. Legen Sie die Halsvene und den Brustmuskel frei, indem Sie die Haut mit einer Zange anheben und mit einer scharfen chirurgischen Schere abschneiden.
5. Injizieren Sie 200 μl Anti-CD45-Antikörper (Antikörper in Durchflusszytometrie-Qualität; verdünnt 1:300 in PBS) mit einer 28-G-Nadel in die Halsvene. Warten Sie 2-4 Minuten, damit der Antikörper im gesamten Gefäßsystem zirkulieren kann.
   HINWEIS: Das Eindringen durch den Brustmuskel in die Halsvene aus einem flachen Winkel verhindert das Auftreten erheblicher Blutungen.
6. Danach euthanasieren Sie das Tier, indem Sie es 10 Minuten lang CO₂ ausgesetzt haben. Fahren Sie mit der Lungenperfusion fort und entnehmen Sie Lungen und andere Gewebe.
   HINWEIS: Jede andere Methode der humanen Euthanasie, die den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren entspricht, ist ebenfalls akzeptabel.

3. Sezieren/Ernte (Abbildung 1)

1. Positionieren Sie das Tier auf dem Rücken auf einem flachen Brett und stecken Sie die Pfoten fest, wobei Sie den Kopf in der Mitte halten.
2. Besprühen Sie den Körper mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Brusthöhle mit einer Pinzette und einer Schere, um Lunge, Herz und Luftröhre freizulegen.
3. Perfusionieren Sie die Lunge, indem Sie einen kleinen Schnitt in den linken Ventrikel des Herzens machen und 10 ml kaltes PBS durch den rechten Ventrikel injizieren.
4. Schneiden Sie eine Öffnung in die Luftröhre und führen Sie eine intravenöse Kanüle ein. Sobald die Kanüle eingesetzt ist, führen Sie einen etwa 6-8 cm langen Nahtfaden unter die Luftröhre und binden Sie ihn zweimal an die Kanüle.
5. Stecken Sie den chirurgischen String in die Kanüle und befestigen Sie eine Spritze mit Dissoziationsmedien (5 ml für eine halbe Lunge oder 10 ml für eine ganze Lunge), wie in Abbildung 1B dargestellt.
6. Schneiden Sie die Lunge vorsichtig vom Rest des Körpers ab und platzieren Sie die Spritze mit der Lunge in einem konischen 50-ml-Röhrchen.

4. Aufschluss zur Einzelzellsuspension

1. Inkubieren Sie die Lunge 30-40 Minuten lang bei 37 °C und träufeln Sie alle 5 Minuten 1 ml (für die Hälfte der Lunge) oder 2 ml (für die gesamte Lunge) Dissoziationsmedium.
2. Sobald alle Medien eingeträufelt sind, entfernen Sie die Spritze und die Kanüle und legen Sie das konische 50-ml-Röhrchen für den Rest der Inkubation in ein Schüttelwasserbad bei 180 U/min, um eine bessere Ausbeute zu erzielen.
   HINWEIS: Alternativ können die Röhrchen alle 5 Minuten manuell geschüttelt werden.
3. Fügen Sie 10 ml PBS hinzu und schütteln Sie es 1 Minute lang kräftig, um die Reaktion zu stoppen.
4. Die Lösung wird durch ein Zellsieb (70 μm) in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen geleitet. Verwenden Sie einen 5-ml-Spritzengummistopfen, um Gewebeklumpen durch das Sieb zu führen. Fügen Sie PBS hinzu, so dass das endgültige Volumen 30 ml beträgt.
5. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 1.200 x g und 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Pipettieren Sie die restliche Lösung heraus.
6. Fügen Sie 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC) hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren mit dem Zellpellet.
7. Bei Raumtemperatur 60-90 s inkubieren. Fügen Sie PBS hinzu, so dass das endgültige Volumen 30 mL beträgt, um die Reaktion zu stoppen.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit hängt von der Menge an Blut im Zellpellet ab. Je röter das Zellpellet ist, desto länger ist die Inkubationszeit.
8. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 1.200 x g und 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Pipettieren Sie die restliche Lösung heraus.
9. Geben Sie 1 ml FAC-Puffer zum Zellpellet und mischen Sie es durch Pipettieren.

5. Färben von Zellen für die Durchflusszytometrie

1. Verwenden Sie einen Zellzähler, um die Gesamtzahl der Zellen in der Zellsuspension zu bestimmen.
2. Übertragen Sie die Zellsuspension in jedes markierte FACS-Röhrchen, so dass insgesamt 3 x 10⁶ Zellen pro Probe vorhanden sind.
3. Fc Block (1:100 verdünnt) zugeben und 15 Minuten auf Eis inkubieren.
4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 1.200 x g und 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
5. Die Proben werden mit einer vorgegebenen Antikörpermischung eingefärbt und 20 Minuten auf lichtgeschütztem Eis inkubiert (d.h. durch Abdecken mit Aluminiumfolie). Mischen Sie, indem Sie die Röhrchen nach der Hälfte der Inkubation gegen den Röhrchenhalter abfüllen.
6. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer zum Waschen hinzu und mischen Sie durch Pipettieren.
7. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein anderes FACS-Röhrchen, indem Sie die Suspension langsam durch ein 35-μm-Sieb pipettieren.
8. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 1.200 x g und 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
9. 150 μl FACS-Puffer zugeben und durch Pipettieren mischen.
10. Geben Sie 10 μl DAPI (1:100) unmittelbar vor der Durchführung der Proben in jedes Röhrchen.
    HINWEIS: Die Proben können nun auf dem Durchflusszytometer durchgeführt werden.

Mit dieser Technik lag die Gesamtzellzahl der naiven dissoziierten Lungen (für die repräsentativen Daten wurden nur die linken Lappen verwendet) zwischen 27,3 x 10⁶ und 71,1 x 10⁶ Zellen/ml. Nach dem Gating auf die Größe und dem Ausscheiden von Dubletten und toten Zellen (Gating-Schema in Abbildung 2) reichten die Leukozytenzahlen von 6,9 x 10⁶ bis 13,5 x 10⁶ Zellen/ml. Zirkulierende Leukozyten, die auch nach d...

Sorgfältige Studien von Lungenentzündungen und pulmonalen Immunantworten sind entscheidend für das Verständnis vieler Krankheitszustände. Die Durchflusszytometrie wird routinemäßig eingesetzt, um pulmonale Leukozyten aufzuzählen und ihnen funktionelle Relevanz zuzuschreiben. Die Funktion der Leukozyten hängt zumindest teilweise davon ab, wo sie sich befinden. Obwohl es immer mehr Hinweise darauf gibt, dass auch nach perfekten Perfusionsprotokollen viele intravaskuläre Leukozyte...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit wurde von der NHLBI-K08HL132053 (SS) unterstützt. Die Autoren danken Dr. G. A. FitzGerald für den Zugang zu einem Präpariermikroskop und einem Schüttelwasserbad.