Distinguindo Células Imunes Intrapulmonares de Populações de Células Imunes Intravasculares: a Abordagem Intrajugular

O objetivo do presente estudo é descrever um protocolo para diferenciar entre células imunes intravasculares e intraparenquimatosas em estudos de inflamação pulmonar. Usamos uma injeção intrajugular de um anticorpo marcado com fluorescência antes da coleta do pulmão. Além disso, usamos um processo de digestão pulmonar baseado em inflação para melhorar o rendimento de leucócitos do pulmão.

Os ritmos circadianos referem-se a oscilações em vários processos biológicos que ocorrem com um período de 24 horas. No nível molecular, esses ritmos são compostos por uma teia de loops de feedback transcricional-translacional (TTFL) de genes do relógio central. Tecidos e sistemas de órgãos individuais, incluindo o sistema imunológico, têm seu próprio relógio. Na circulação sistêmica, vários membros da população CD45⁺ oscilam ao longo do dia; no entanto, muitos desses ritmos não são idênticos ou mesmo semelhantes na população de leucócitos CD45⁺ residentes no tecido. Ao estudar o papel da regulação circadiana da inflamação pulmonar, o CD45⁺ dentro do pulmão pode precisar ser investigado. No entanto, apesar dos métodos de perfusão otimizados, os leucócitos retidos da circulação persistem nos pulmões. O objetivo ao projetar este protocolo foi distinguir entre leucócitos intravasculares e intraparenquimatosos. Para esse fim, os camundongos são injetados com um anticorpo CD45 marcado com fluorescência por via intrajugular pouco antes da coleta do pulmão. Depois disso, o pulmão é digerido usando uma técnica de digestão pulmonar personalizada para obter uma suspensão de célula única. A amostra é corada para o painel regular de anticorpos para células imunes intraparenquimatosas (incluindo outro anticorpo CD45). As análises de citometria de fluxo mostram uma clara elucidação das populações. Assim, o método de marcação e definição de células CD45⁺ intrapulmonares será particularmente importante onde o comportamento das células imunes intrapulmonares e circulantes são numérica e funcionalmente distintos.

Descrevemos aqui métodos eficientes e confiáveis de diferenciação de leucócitos intravasculares de leucócitos pulmonares. Mesmo com as melhores técnicas de perfusão, estudos revelaram que o CD45⁺ residual da circulação persiste no pulmão. Isso prejudica a capacidade de distinguir entre os ritmos da circulação e do pulmão. Este efeito é ainda mais amplificado em casos de inflamação pulmonar. Isso é particularmente relevante para o estudo da regulação circadiana da inflamação.

Os ritmos circadianos referem-se às oscilações diurnas em vários processos biológicos que ocorrem com um período de 24 h. O sistema circadiano é um mecanismo antecipatório evolutivamente conservado que confere proteção ao hospedeiro à medida que enfrenta mudanças em seu ambiente, como ameaça de infecções. No nível celular, o relógio é organizado em loops de feedback transcricional-translacional autossustentados que compreendem os genes do relógio central¹. O sistema imunológico tem seu próprio relógio que afeta sua resposta a patógenos e insultos inflamatórios ^2,3. Como órgão exposto ao ambiente constantemente, os ritmos circadianos são particularmente importantes no pulmão⁴. Vários processos imunológicos no pulmão estão sob controle do relógio ^5,6,7. No entanto, a fase de vários processos biológicos no pulmão e a circulação sistêmica não são^{as mesmas8}, o que, por extensão, também sugere que as oscilações dos leucócitos no pulmão e na circulação podem não ser idênticas. Assim, ter um método para distinguir eficientemente entre leucócitos pulmonares e intravasculares será fundamental no contexto circadiano.

O objetivo deste estudo foi desenvolver um método que possa diferenciar entre leucócitos intravasculares e intraparenquimatosos de forma confiável. Para isso, utilizamos uma marcação de leucócitos intravasculares e método de digestão pulmonar. Para a marcação de leucócitos intravasculares, usamos injeção intrajugular, que tem como alvo um grande vaso sanguíneo e pode ser usada de forma reprodutível em camundongos de todas as cepas e tamanhos. Muitos outros métodos usaram injeção na veia da cauda ^9,10, que são notoriamente mais difíceis de realizar em camundongos Bl6¹¹. A injeção intrajugular requer o uso de anestesia e é melhor realizada sob visualização direta com microscópio de dissecação ou lupas de aumento. Assim, a facilidade e a confiabilidade da injeção intrajugular devem ser ponderadas em relação à necessidade de anestesia e equipamentos especiais. No entanto, dada a pronta disponibilidade desses equipamentos na maioria dos laboratórios de pesquisa, não vemos isso como um fator limitante. No entanto, uma análise caso a caso parece prudente.

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Pensilvânia e atenderam às estipulações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

NOTA: O processo geral pode ser dividido em 1) marcação intravenosa de CD45, 2) colheita, 3) digestão e 4) coloração e citometria de fluxo. Essas etapas foram resumidas na Figura 1.

1. Preparação de soluções/reagentes

1. Prepare o meio de dissociação adicionando 5 mL de 2 mM de L-glutamina, 20 mL de soro fetal bovino (FBS), 1 mL de 2-mercaptoetanol e 10 mL de Pen/Strep a 500 mL de DMEM.
   NOTA: O meio de dissociação é estável por até 2 meses quando armazenado a 2-4 °C.
2. Prepare o tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) adicionando 10 mL de FBS e 500 mg de azida de sódio a 500 mL de PBS sem magnésio ou cálcio.
   NOTA: Com a adição de azida de sódio, o FACS Buffer pode ser armazenado a 2-4 °C por meses.
3. No dia da coleta da amostra, adicione as soluções de DNase e Liberase aos meios de dissociação em uma diluição de 1:100 (ou seja, adicione 10 μL de DNase e liberase para cada 1 mL de meio de dissociação).
   NOTA: Para cada camundongo, a digestão de todo o pulmão requer 10 mL / camundongo e metade do pulmão requer 5 mL / camundongo.

2. Marcação intravenosa de CD45

1. Para este experimento, use camundongos C57Bl6 adultos com 8 a 12 semanas de idade.
2. Anestesie os camundongos com agentes de sua escolha. Uma combinação de xilazina e cetamina foi usada para esse fim, mas outros agentes também são aceitáveis. O objetivo é obter um nível moderado a profundo de anestesia que dure cerca de 5 a 10 minutos.
   NOTA: A mistura de anestesia de xilazina e cetamina é administrada por via intraperitoneal. Use 10-15 mg/kg de xilazina e 120-150 mg/kg de cetamina.
3. Quando o reflexo do pedal for negativo, posicione o animal de costas e prenda seus membros suavemente para manter a cabeça o mais central possível.
4. Exponha a veia jugular e o músculo peitoral levantando a pele com uma pinça e cortando com uma tesoura cirúrgica afiada.
5. Injete 200 μL de anticorpo anti-CD45 (anticorpo grau de citometria de fluxo; diluído 1:300 em PBS) na veia jugular usando uma agulha 28 G. Aguarde 2-4 minutos para que o anticorpo possa circular por toda a vasculatura.
   NOTA: Entrar pelo músculo peitoral na veia jugular a partir de um ângulo raso evita a ocorrência de sangramento considerável.
6. Em seguida, eutanasiar o animal por exposição ao CO₂ por 10 minutos. Prossiga para a perfusão pulmonar e colha pulmões e outros tecidos.
   NOTA: Qualquer outro método de eutanásia humanitária que siga as diretrizes da AVMA para a eutanásia de animais também é aceitável.

3. Dissecção / colheita (Figura 1)

1. Posicione o animal de costas em uma tábua plana e prenda as patas para baixo, mantendo a cabeça central.
2. Pulverize o corpo com etanol 70%. Abra a cavidade torácica com fórceps e tesoura para expor o pulmão, o coração e a traqueia.
3. Perfundir o pulmão fazendo uma pequena incisão no ventrículo esquerdo do coração e injetando 10 mL de PBS frio através do ventrículo direito.
4. Corte uma abertura na traqueia e insira uma cânula intravenosa. Assim que a cânula estiver inserida, passe um fio de sutura com cerca de 6 a 8 cm de comprimento por baixo da traqueia e amarre-o duas vezes à cânula.
5. Coloque o fio cirúrgico na cânula e coloque uma seringa contendo meio de dissociação (5 mL para meio pulmão ou 10 mL para um pulmão inteiro), conforme ilustrado na Figura 1B.
6. Corte suavemente o pulmão do resto do corpo e coloque a seringa com o pulmão conectado em um tubo cônico de 50 mL.

4. Digestão em suspensão de célula única

1. Incube o pulmão a 37 °C por 30-40 minutos, instilando 1 mL (para metade do pulmão) ou 2 mL (para todo o pulmão) de meio de dissociação a cada 5 minutos.
2. Depois que todo o meio estiver instilado, remova a seringa e a cânula e coloque o tubo cônico de 50 mL em banho-maria agitado a 180 rpm pelo restante da incubação para melhor rendimento.
   NOTA: Alternativamente, os tubos podem ser agitados manualmente a cada 5 minutos.
3. Adicione 10 mL de PBS e agite vigorosamente por 1 minuto para interromper a reação.
4. Passe a solução através de um filtro de células (70 μm) para um novo tubo cônico de 50 mL. Use uma rolha de borracha de seringa de 5 mL para passar quaisquer aglomerados de tecido pelo filtro. Adicione PBS para que o volume final seja de 30 mL.
5. Centrifugar as amostras durante 10 minutos a 1 200 x g e a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Pipetar qualquer solução restante.
6. Adicione 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) e misture com o pellet celular por pipetagem.
7. Incube em temperatura ambiente por 60-90 s. Adicione PBS para que o volume final seja de 30 mL para interromper a reação.
   NOTA: O tempo de incubação depende da quantidade de sangue no pellet celular; Quanto mais vermelho o pellet celular, maior o tempo de incubação.
8. Centrifugar as amostras durante 10 minutos a 1 200 x g e a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Pipetar qualquer solução restante.
9. Adicione 1 mL de tampão FACs ao pellet celular e misture pipetando.

5. Coloração de células para citometria de fluxo

1. Use um contador de células para determinar o número total de células na suspensão de células.
2. Transfira a suspensão celular para cada tubo FACS rotulado para que haja um total de 3 x 10⁶ células por amostra.
3. Adicione Fc Block (diluído 1:100) e incube por 15 minutos no gelo.
4. Centrifugue os tubos por 5 minutos a 1.200 x g e 4 °C. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
5. Manchar as amostras com uma mistura de anticorpos especificada e incubar por 20 minutos em gelo protegido da luz (ou seja, cobrindo com papel alumínio). Misture os tubos contra o suporte do tubo na metade da incubação.
6. Adicione 1 mL de tampão FACS para lavar e misturar por pipetagem.
7. Transferir a suspensão celular para outro tubo FACS, pipetando lentamente a suspensão através de um filtro de 35 μm.
8. Centrifugue os tubos por 5 minutos a 1.200 x g e 4 °C. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
9. Adicione 150 μL de tampão FACS e misture por pipetagem.
10. Adicione 10 μL de DAPI (1:100) a cada tubo imediatamente antes de executar as amostras.
    NOTA: As amostras estão agora prontas para serem executadas no citômetro de fluxo.

Usando essa técnica, a contagem total de células dos pulmões dissociados virgens (apenas os lobos esquerdos foram usados para os dados representativos) estava entre 27,3 x 10⁶ a 71,1 x 10⁶ células/mL. Após o gating no tamanho e o gating out de dupletos e células mortas (esquema de gating na Figura 2), a contagem de leucócitos variou de 6,9 x 10⁶ a 13,5 x 10⁶ células/mL. Os leucócitos circulantes que perman...

Estudos cuidadosos da inflamação pulmonar e das respostas imunes pulmonares são cruciais para a compreensão de muitas doenças. A citometria de fluxo é rotineiramente usada para enumerar e atribuir relevância funcional aos leucócitos pulmonares. A função dos leucócitos depende, pelo menos em parte, de onde eles são encontrados. Embora haja evidências acumuladas para apoiar que, mesmo após protocolos de perfusão perfeitos, muitos leucócitos intravasculares persistem nos pul...

Os autores não têm nada a divulgar.

Este trabalho foi apoiado pelo NHLBI-K08HL132053 (SS). Os autores agradecem ao Dr. G. A. FitzGerald pelo acesso a um microscópio de dissecação e a um banho-maria agitado.