التمييز بين الخلايا المناعية داخل الرئة وخلايا المناعة داخل الأوعية الدموية: النهج داخل الوداجي

الهدف من الدراسة الحالية هو وصف بروتوكول للتمييز بين الخلايا المناعية داخل الأوعية الدموية وداخل المتني في دراسات التهاب الرئة. نستخدم حقنة داخل الوداج لجسم مضاد يحمل علامة الفلورسنت قبل حصاد الرئة. علاوة على ذلك ، نستخدم عملية هضم الرئة القائمة على التضخم لتحسين محصول الكريات البيض من الرئة.

تشير إيقاعات الساعة البيولوجية إلى التذبذبات في العمليات البيولوجية المختلفة التي تحدث مع فترة 24 ساعة. على المستوى الجزيئي ، تتكون هذه الإيقاعات من شبكة من حلقات التغذية الراجعة النسخية الانتقالية (TTFL) لجينات الساعة الأساسية. الأنسجة الفردية وأجهزة الأعضاء ، بما في ذلك الجهاز المناعي ، لها ساعتها الخاصة. في الدورة الدموية النظامية ، يتأرجح العديد من أعضاء CD45 ⁺ على مدار اليوم. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الإيقاعات ليست متطابقة أو حتى متشابهة في مجموعة الكريات البيض CD45 ⁺ المقيمة. عند دراسة دور تنظيم الساعة البيولوجية لالتهاب الرئة ، قد يحتاج CD45 ⁺ داخل الرئة إلى التحقيق. ومع ذلك ، على الرغم من طرق التروية المحسنة ، فإن الكريات البيض المحاصرة من الدورة الدموية تستمر في الرئتين. كان الهدف من تصميم هذا البروتوكول هو التمييز بين الكريات البيض داخل الأوعية الدموية وداخل المتني. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم حقن الفئران بجسم مضاد CD45 الموسوم بالفلورسنت داخل الوداج قبل وقت قصير من حصاد الرئة. بعد ذلك ، يتم هضم الرئة باستخدام تقنية هضم الرئة المخصصة للحصول على تعليق خلية واحدة. العينة ملطخة للوحة الأجسام المضادة العادية للخلايا المناعية داخل المتني (بما في ذلك الجسم المضاد CD45 آخر). تظهر تحليلات قياس التدفق الخلوي توضيحا واضحا للسكان. وبالتالي ، فإن طريقة وضع العلامات على خلايا CD45 ⁺ داخل الرئة وتعريفها ستكون مهمة بشكل خاص عندما يكون سلوك الخلايا المناعية داخل الرئة والدورة متميزة عدديا ووظيفيا.

نصف هنا طرقا فعالة وموثوقة للتمييز بين الكريات البيض داخل الأوعية الدموية وبيضاء الرئة. حتى مع أفضل تقنيات التروية ، كشفت الدراسات أن بقايا CD45 ⁺ من الدورة الدموية لا تزال موجودة في الرئة. هذا يضعف القدرة على التمييز بين إيقاعات الدورة الدموية والرئة. يتم تضخيم هذا التأثير بشكل أكبر في حالات التهاب الرئة. هذا مهم بشكل خاص لدراسة تنظيم الساعة البيولوجية للالتهاب.

تشير إيقاعات الساعة البيولوجية إلى التذبذبات النهارية في العمليات البيولوجية المختلفة التي تحدث بفترة 24 ساعة. نظام الساعة البيولوجية هو آلية استباقية محفوظة تطوريا تمنح الحماية للمضيف لأنه يواجه تغيرات في بيئته مثل خطر العدوى. على المستوى الخلوي ، يتم تنظيم الساعة في حلقات تغذية مرتدة نسخية انتقالية ذاتية الاستدامة تشتمل على جينات الساعة الأساسية¹. الجهاز المناعي له ساعته الخاصة التي تؤثر على استجابته لمسببات الأمراض والإهانات الالتهابية^2،3. كعضو يتعرض للبيئة باستمرار ، تعتبر إيقاعات الساعة البيولوجية مهمة بشكل خاص في الرئة⁴. تخضع العمليات المناعية المختلفة في الرئة للسيطرة على مدار الساعة^5،6،7. ومع ذلك ، فإن مرحلة العمليات البيولوجية المختلفة في الرئة والدورة الدموية الجهازية ليست هي^{نفسها 8} ، والتي تشير أيضا إلى أن تذبذبات الكريات البيض في الرئة والدورة الدموية قد لا تكون متطابقة. وبالتالي ، فإن وجود طريقة للتمييز بكفاءة بين الكريات البيض الرئوية وداخل الأوعية الدموية سيكون أمرا بالغ الأهمية في سياق الساعة البيولوجية.

كان الهدف من هذه الدراسة هو ابتكار طريقة يمكنها التمييز بين الكريات البيض داخل الأوعية الدموية وداخل المتني بشكل موثوق. لهذا ، استخدمنا وضع العلامات على الكريات البيض داخل الأوعية الدموية وطريقة هضم الرئة. لوضع العلامات على الكريات البيض داخل الأوعية الدموية ، نستخدم الحقن داخل الوداج ، والذي يستهدف وعاء دموي كبير ويمكن استخدامه بشكل متكرر في الفئران من جميع السلالات والأحجام. استخدمت العديد من الطرق الأخرى حقن وريد الذيل^9،10 ، والتي من المعروف أنها أصعب في أداء الفئران Bl6¹¹. يتطلب الحقن داخل الوداج استخدام التخدير ومن الأفضل القيام به تحت التصور المباشر باستخدام مجهر تشريح أو مكبرات مكبرة. وبالتالي ، يجب موازنة سهولة وموثوقية الحقن داخل الوداج مقابل الحاجة إلى التخدير والمعدات الخاصة. ومع ذلك ، نظرا للتوافر الجاهز لهذه المعدات في معظم مختبرات الأبحاث ، فإننا لا نعتبر هذا عاملا مقيدا. ومع ذلك ، يبدو من الحكمة النظر في كل حالة على حدة.

تمت الموافقة على جميع الدراسات التي أجريت على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة بنسلفانيا واستوفت شروط دليل رعاية واستخدام المختبر.

ملاحظة: يمكن تقسيم العملية الإجمالية إلى 1) وضع العلامات على CD45 في الوريد ، 2) الحصاد ، 3) الهضم ، و 4) تلطيخ وقياس التدفق الخلوي. تم تلخيص هذه الخطوات في الشكل 1.

1. تحضير الحلول / الكاشف

1. تحضير وسائط التفكك عن طريق إضافة 5 مل من 2 ملي ل-جلوتامين ، و 20 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 1 مل من 2-mercaptoethanol ، و 10 مل من Pen / Strep إلى 500 مل من DMEM.
   ملاحظة: تكون وسائط التفكك مستقرة لمدة تصل إلى شهرين عند تخزينها عند 2-4 درجة مئوية.
2. قم بإعداد المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) عن طريق إضافة 10 مل من FBS و 500 مجم من أزيد الصوديوم إلى 500 مل من PBS بدون المغنيسيوم أو الكالسيوم.
   ملاحظة: مع إضافة أزيد الصوديوم ، يمكن تخزين FACS Buffer عند 2-4 درجات مئوية لعدة أشهر.
3. في يوم جمع العينة ، أضف محاليل DNase و Liberase إلى وسائط التفكك عند تخفيف 1: 100 (أي أضف 10 ميكرولتر من DNase و Liberase لكل 1 مل من وسائط التفكك).
   ملاحظة: لكل فأر ، يتطلب هضم الرئة بأكملها 10 مل / فأر ونصف الرئة يتطلب 5 مل / فأر.

2. وضع العلامات على CD45 في الوريد

1. في هذه التجربة ، استخدم الفئران البالغة C57Bl6 التي تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا.
2. تخدير الفئران بعوامل من اختيارك. تم استخدام مزيج من الزيلازين والكيتامين لهذا الغرض ، لكن العوامل الأخرى مقبولة أيضا. الهدف هو الحصول على مستوى متوسط إلى عميق من التخدير يستمر حوالي 5-10 دقائق.
   ملاحظة: يتم إعطاء خليط التخدير الزيلازين والكيتامين داخل الصفاق. استخدم 10-15 مجم / كجم من الزيلازين و 120-150 مجم / كجم من الكيتامين.
3. بمجرد أن يصبح منعكس الدواسة سالبا ، ضع على ظهره وقم بلصق أطرافه برفق للحفاظ على الرأس مركزيا قدر الإمكان.
4. كشف الوريد الوداجي والعضلة الصدرية عن طريق رفع الجلد بالملقط والقص بمقص جراحي حاد.
5. حقن 200 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل CD45 (الجسم المضاد من درجة قياس التدفق الخلوي ؛ مخفف 1: 300 في PBS) في الوريد الوداجي باستخدام إبرة 28 G. انتظر 2-4 دقائق حتى يتمكن الجسم المضاد من الدوران في جميع أنحاء الأوعية الدموية.
   ملاحظة: الدخول من خلال العضلة الصدرية إلى الوريد الوداجي من زاوية ضحلة يمنع حدوث نزيف كبير.
6. بعد ذلك ، قتل عن طريق التعرض لثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 10 دقائق. انتقل إلى نضح الرئة وحصاد الرئتين والأنسجة الأخرى.
   ملاحظة: أي طريقة أخرى للقتل الرحيم الإنساني تلتزم بإرشادات AVMA للقتل الرحيم للحيوانات مقبولة أيضا.

3. التشريح / الحصاد (الشكل 1)

1. ضع على ظهره على لوح مسطح وقم بتثبيت الكفوف لأسفل ، مع الحفاظ على الرأس في المركز.
2. رش الجسم ب 70٪ إيثانول. افتح التجويف الصدري بالملقط والمقص لكشف الرئة والقلب والقصبة الهوائية.
3. قم بنشر الرئة عن طريق عمل شق صغير في البطين الأيسر للقلب وحقن 10 مل من PBS البارد عبر البطين الأيمن.
4. قص فتحة في القصبة الهوائية وأدخل قنية في الوريد. بمجرد دخول القنية ، مرر خيطا بطول 6-8 سم تحت القصبة الهوائية واربطه مرتين بالقنية.
5. دس الخيط الجراحي في القنية وقم بإرفاق حقنة تحتوي على وسائط التفكك (5 مل لنصف رئة أو 10 مل للرئة بأكملها) كما هو موضح في الشكل 1 ب.
6. اقطع الرئة برفق عن باقي الجسم وضع المحقنة مع الرئة متصلة بأنبوب مخروطي سعة 50 مل.

4. الهضم إلى تعليق خلية واحدة

1. احتضان الرئة عند 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة ، مع غرس 1 مل (لنصف الرئة) أو 2 مل (للرئة بأكملها) من وسائط التفكك كل 5 دقائق.
2. بمجرد غرس جميع الوسائط ، قم بإزالة المحقنة والقنية ، وضع الأنبوب المخروطي سعة 50 مل في حمام مائي مهتز عند 180 دورة في الدقيقة لبقية فترة الحضانة للحصول على عائد أفضل.
   ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن هز الأنابيب يدويا كل 5 دقائق.
3. أضف 10 مل من PBS ورجه بقوة لمدة 1 دقيقة لإيقاف التفاعل.
4. مرر المحلول عبر مصفاة خلوية (70 ميكرومتر) إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. استخدم سدادة مطاطية من المحقنة سعة 5 مل لتمرير أي كتل من الأنسجة عبر المصفاة. أضف PBS بحيث يكون الحجم النهائي 30 مل.
5. الطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق عند 1,200 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. Pipet أي حل متبقي.
6. أضف 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) واخلطه مع حبيبات الخلية عن طريق سحب العينات.
7. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 60-90 ثانية. أضف PBS بحيث يكون الحجم النهائي 30 مل لإيقاف التفاعل.
   ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على كمية الدم في حبيبات الخلية. كلما كانت حبيبات الخلية أكثر احمرارا ، كلما طالت مدة الحضانة.
8. الطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق عند 1,200 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. Pipet أي حل متبقي.
9. أضف 1 مل من المخزن المؤقت ل FACs إلى حبيبات الخلية واخلطها عن طريق سحب العينات.

5. تلطيخ الخلايا لقياس التدفق الخلوي

1. استخدم عداد الخلايا لتحديد العدد الإجمالي للخلايا في معلق الخلية.
2. انقل تعليق الخلية إلى كل أنبوب FACS مسمى بحيث يكون هناك 3 × 10⁶ خلايا إجمالا لكل عينة.
3. أضف Fc Block (مخفف 1: 100) واحتضنه لمدة 15 دقيقة على الثلج.
4. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1,200 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
5. قم بتلطيخ العينات بخليط محدد من الأجسام المضادة واحتضانها لمدة 20 دقيقة على ثلج محمي من الضوء (أي عن طريق تغطيتها بورق الألمنيوم). امزج عن طريق أنابيب الأرفف مقابل حامل الأنبوب في منتصف فترة الحضانة.
6. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS للغسيل والخلط عن طريق سحب العينات.
7. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب FACS آخر عن طريق سحب التعليق ببطء من خلال مصفاة 35 ميكرومتر.
8. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1,200 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
9. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS واخلطه عن طريق سحب العينات.
10. أضف 10 ميكرولتر من DAPI (1: 100) إلى كل أنبوب مباشرة قبل تشغيل العينات.
    ملاحظة: العينات جاهزة الآن للتشغيل على مقياس التدفق الخلوي.

باستخدام هذه التقنية ، كان إجمالي عدد الخلايا للرئتين الساذجة المنفصلتين (تم استخدام الفص الأيسر فقط للبيانات التمثيلية) بين 27.3 × 10⁶ إلى 71.1 × 10⁶ خلايا / مل. بعد تحديد الحجم وإخراج الثنائيات والخلايا الميتة (مخطط البوابات في الشكل 2) ، تراوحت أعدا...

تعد الدراسات الدقيقة لالتهاب الرئة والاستجابات المناعية الرئوية ضرورية لفهم العديد من الحالات المرضية. يستخدم قياس التدفق الخلوي بشكل روتيني لتعداد وإسناد الأهمية الوظيفية للكريات البيض الرئوية. تعتمد وظيفة الكريات البيض جزئيا على الأقل على مكان وجودها. على الرغم من ?...

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

تم دعم هذا العمل من قبل NHLBI-K08HL132053 (SS). يشكر المؤلفون الدكتور جي إيه فيتزجيرالد على الوصول إلى مجهر تشريح وحمام مائي مهتز.