Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu (ARDS) için Çift Vuruşlu Bir Model Olarak Domuzlarda Bronkoalveoler Lavaj ve Oleik Asit Enjeksiyonu

Akut solunum sıkıntısı sendromunun (ARDS) patofizyolojisini incelemek için farklı, karmaşık hayvan modelleri mevcuttur. Bronkoalveoler lavaj ve oleik asit enjeksiyonunun neden olduğu akciğer hasarı, akut solunum sıkıntısı sendromunu incelemek için yeni bir çift vuruşlu hayvan modeli olarak uygundur.

ARDS'nin tedavisi, 21. yüzyılda yoğun bakım hekimleri için büyük zorluklar oluşturmaya devam etmekte ve mortalite oranları ciddi vakalarda hala %50'ye ulaşmaktadır. Bu hastalığın karmaşık patofizyolojisini daha iyi anlamak için daha fazla araştırma çabasına ihtiyaç vardır. Akut akciğer hasarını indüklemek için iyi bilinen farklı hayvan modelleri vardır, ancak hiçbiri ARDS'nin karmaşık patomekanizmalarını yeterince taklit edememiştir. Bu durumun gelişmesi için en önemli faktör alveoler kılcal ünitenin hasar görmesidir. İki iyi bilinen akciğer hasarı modelinin kombinasyonu, altta yatan patomekanizmayı daha ayrıntılı olarak taklit etmemizi sağlar. Bronkoalveoler lavaj (BAL), yüzey aktif madde tükenmesine ve alveoler kollapsa yol açar. Sıvı hacimlerinin tekrar tekrar damlatılması sonraki hipoksemiye neden olur. Yüzey aktif madde tükenmesi, insanlarda ARDS'nin önemli bir faktörüdür. BAL sıklıkla diğer akciğer hasarı yaklaşımlarıyla birleştirilir, ancak henüz oleik asit enjeksiyonu (OAI) ile ikinci bir vuruş ile birleştirilmez. Oleik asit enjeksiyonu, ciddi şekilde bozulmuş gaz değişimine, akciğer mekaniğinin bozulmasına ve alveolo-kılcal bariyerin bozulmasına yol açar. OAI, alveoler sızıntı artışı ve gaz değişim bozukluğu ile akciğer dokusunun uzamış inflamasyonundan oluşan ARDS'nin beklenen etkilerinin çoğunu taklit eder. Farklı modellerin kombinasyonunun bir dezavantajı, tek başına BAL'ın, tek başına OAI'nin veya her ikisinin birlikte neden olduğu akciğer hasarına olan etkiyi belirlemenin zorluğudur. Bu raporda sunulan model, yeni bir çift vuruşlu akciğer hasarı modeli olarak BAL ve OAI'nin kombinasyonunu temsil etmektedir. Bu yeni modelin uygulanması kolaydır ve gelecekte ARDS'de farklı terapötik yaklaşımları incelemek için bir alternatiftir.

Akut respiratuar distres sendromu (ARDS), sıklıkla yoğun bakım tedavisi gerektiren, bozulmuş gaz değişimi ve akciğer infiltrasyonundan oluşan bir hastalıktır. Şiddetli ARDS'nin mortalitesi, neredeyse 50 yıllık kapsamlı araştırmalara rağmen dünya çapında yüksek (%50'ye kadar)^{kalmaktadır 1}. ARDS, Berlin Tanımı ile tanımlanır ve tanı kriterleri zamanlama, göğüs görüntülemesi, ödemin kökeni ve hipoksemi² olarak adlandırılır. Farklı ARDS şiddeti seviyelerine sahip hastaları daha iyi kategorize etmek için üç farklı hipoksemi derecesi tanımlanmıştır: hafif (200 mmHg < PaO₂ / FIO₂ ≤ 300 mmHg), orta (100 mmHg < PaO₂ / FIO₂ ≤ 200 mmHg) ve şiddetli (PaO₂ / FIO₂ ≤ 100 mmHg)². ARDS^3'teki patofizyolojik değişiklikleri ve farklı tedavi yaklaşımlarını incelemek için akciğer hasarına odaklanan farklı hayvan modelleri yaygın olarak kullanılmakta ve kabul edilmektedir.

Endotoksinleri kullanan hayvan modelleri (ör., sepsis kaynaklı akciğer hasarını taklit etmek için intravenöz bakteri infüzyonu, çekal ligasyon ve ponksiyon), iskemi / reperfüzyon modelleri, duman / yanık ARDS modelleri, oleik asit infüzyonu ve bronkoalveoler lavaj modelleri bilinmektedir³. Her model, çalışma sonuçlarına göre avantajları ve dezavantajları olan sadece birkaç patofizyolojik değişikliği temsil eder³. Bu, ARDS hastalığının karmaşıklığını yansıtmaz. Kanıtlanmış iki modelin kombinasyonu, ARDS'nin patofizyolojisi hakkında daha iyi sonuçlara varılmasını sağlar. Sunulan modelde, insan ARDS'nin karmaşıklığını taklit etmek için bronkoalveoler lavaj ve oleik asit infüzyonunu birleştirdik. Oleik asit doymamış bir yağ asididir ve doğuştan gelen bağışıklık reseptörlerinin aktivasyonunu tetikleyerek doğrudan akciğerlerin alveolo-kılcal ünitesine etki eder ve ardından nötrofil birikimine, proinflamatuar sitokin üretimine ve hücre ölümüne neden olur ^4,5. Oleik asit infüzyonu ciddi hipoksemiye, pulmoner arter basıncında artışa ve ekstravasküler akciğer suyu birikimine neden olur. Sıklıkla sağ ventrikül yetmezliğine bağlı hipotansiyon ve miyokard depresyonu görülür. Dengeli elektrolit çözeltisi ile tekrarlanan bronkoalveoler lavaj (BAL) ile akciğer hasarının indüksiyonu, alveoler yüzey aktif madde lipid konsantrasyonunu^{azaltır 3}. Yüzey aktif maddeler alveolar yüzey gerilimini azaltır ve alveolar kollapsı önler. BAL ani hipoksemiye ve alveolar-arteriyel oksijen farkının artmasına neden olur³. İnsan ARDS'si ayrıca yüzey aktif madde^3'ün tükenmesi ile de ilişkilidir. Bu kombine modelin dezavantajları santral venöz giriş, entübasyon ve genel anestezi gerekliliğidir. Ayrıca, translasyonel yönler için şüpheli mekanik alaka düzeyi (örneğin, oleik asit infüzyonu) belirsizliğini korumaktadır. En azından, akciğer hasarının hangi kısmının (BAL ve OAI veya her ikisi birlikte) akciğer hasarına katkıda bulunduğunu belirlemek zordur. Bu modelin avantajları, insan hastalara benzer tanıdık izleme ve enstrümantasyona sahip büyük hayvanlarda kullanılabilirliği (özel ekipman gerekmez), ARDS'nin ana yönlerinin iyi bir şekilde çoğaltılması ve sistemik inflamasyon olmadan izole ARDS'yi inceleme olasılığıdır (ör., endotoksin modelleri). Aşağıdaki makalede, domuzlarda çift vuruşlu (BAL ve OAI) akciğer hasarının ayrıntılı bir tanımını veriyoruz ve akciğer fonksiyonundaki uzlaşmaların stabilitesini karakterize etmek için temsili veriler sağlıyoruz.

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri, kurumsal ve devlet hayvan bakım komitesi (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Almanya; onay numarası G18-1-044) tarafından onaylanmıştır ve Avrupa ve Alman Laboratuvar Hayvanları Bilimleri Derneği'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür.

1. Anestezi, entübasyon ve mekanik ventilasyon

1. Aspirasyon riskini azaltmak için anesteziden 6 saat önce yiyecekleri alıkoyun, ancak stresi azaltmak için suya serbest erişime izin verin.
2. Hayvan hayvan kutusundayken sedasyon için kas içine ketamin (4 ^mg-kg-1) ve azaperon (8 ^mg-kg-1) kombinasyonunu enjekte edin.
3. Alkol ile lokal dezenfeksiyondan sonra kulak damarında ortak bir periferik venöz kateter (20 G) ile venöz bir hat oluşturun.
4. Sensörü hayvanın kulaklarından birine veya kuyruğuna takarak periferik oksijen doygunluğunu (SpO₂) izlemeye başlayın.
5. Anestezi indüksiyonu için fentanil (4 ^μg-kg-1), propofol (3 ^mg-kg-1) ve atrakuryum (0.5 ^mg-kg-1) enjekte edin.
6. Domuzu sedye üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
7. Dokuzu, tepe solunum basıncı 20_cmH2O'nun altında, PEEP'i 5_cmH2O, frekansı 14-16 /dk ve FiO_2'si 1.0 olan hayvanlar için uygun bir maske ile havalandırın.
8. Anesteziyi sürdürmek için dengeli elektrolit çözeltisi (5 mL∙^kg-1∙^h-1), propofol (8-12 mg∙^kg-1∙^h-1) ve fentanil (0.1-0.2 mg∙^kg-1∙^h-1) ile sürekli bir infüzyon başlatın.
9. Entübasyon için, endotrakeal tüp introdüseri ile donanmış hayvana uygun ortak bir endotrakeal tüp (örneğin, 25-30 kg ağırlık, endotrakeal tüp ID 6-7) ve Macintosh Blade 4 ile ortak bir laringoskop kullanın. İki kişi gereklidir.
   1. Kişi 1: Bir elinizle dili dışarı çekin ve diğer elinizle burnu aşağı doğru bastırın.
   2. Kişi 2: Laringoskopu yerleştirin ve epiglot görüntülenene kadar her zamanki gibi ilerletin.
10. Ses tellerini görselleştirmek için laringoskopu yukarı doğru çekin. Bazen epiglot yumuşak data "yapışır". Eğer öyleyse, tüpün ucuyla harekete geçirin.
11. Tüpü ses tellerinden geçirin ve introdüseri dışarı çekin.
12. Tüpün balonunu bloke edin.
13. Tüpü ventilatöre bağlayın ve kapnografi ve oskültasyon ile doğru konumlandırmayı kontrol edin.
14. Mekanik ventilasyonu başlatın (tidal hacim 6-8 mL/kg, PEEP 5 cmH₂O, FiO₂ 0.4, etCO_2'yi 35 – 45 mmHg arasında tutma frekansı).

2. Enstrümantasyon

1. Gerekli damarları kateterize etmek için arka bacakları bandajlarla geri çekin. Pulmoner arter kateterinin yerleştirilmesi için bir arteriyel hat, bir arteriyel introdüser kılıf, bir merkezi venöz hat ve bir venöz introdüser kılıf gereklidir.
2. Femoral bölgeyi alkollü dezenfeksiyon ile cömertçe dezenfekte edin. Planlanan muayenelere bağlı olarak, az ya da çok aseptik bir yaklaşım kullanılır.
3. Kateterleri tuzlu su ile yıkayarak hazırlayın.
4. Ultrason probunu kasık bağı üzerine yerleştirin ve femoral damarları tarayın.
5. Uzun eksende femoral arteri tam olarak görselleştirmek için probu 90° çevirin. Gerekirse, farklı durumlarda femoral arteri tam olarak görselleştirmek için kısa eksen görünümünü kullanmak da mümkündür.
6. Seldinger'in tekniğinde ayarlanan introdüser iğnesi ile in-line ultrason görselleştirmesi altında femoral arteri kanüle edin. Titreşimli parlak kan dışarı akarken, kılavuz teli yerleştirin ve iğneyi geri çekin.
7. Femoral veni görselleştirin ve in-line ultrason görselleştirme ve introdüser setinin iğnesi ile sürekli aspirasyon altında veni kanüle edin. Venöz kan aspire edilebilir olduğunda, şırıngayı ayırın ve kılavuz teli yerleştirin. İğneyi geri çekin.
8. Ultrason ile tellerin konumunu kontrol edin.
9. Arteriyel ve venöz hattı yerleştirilen kılavuz tellerin üzerine yerleştirin.
10. Diğer tarafta arteriyel ve venöz noktalama işaretlerini tekrarlayın ve yukarıda açıklandığı gibi Seldinger tekniğine göre giriş kılıflarını yerleştirin.
11. Arteriyel hattı ve venöz hattı her biri bir dönüştürücüye bağlayın.
12. Her iki dönüştürücüyü de kalp hizasına yerleştirin ve sistemi sıfıra kalibre etmek için her iki dönüştürücünün üç musluklarını atmosfere açık hale getirin.
    NOT: Makul değerler oluşturmak için sistemde herhangi bir hava kabarcığı ve kan lekesinden kaçınmak gerekir.
13. Propofol ve fentanil infüzyonunu merkezi venöz hattın portlarından birine geçirin.
14. Probu ultra hızlı pO₂ ölçümleri için kalibre edin ve arteriyel giriş kılıfından geçirin.
    NOT: Ultra hızlı pO₂ ölçümü için prob ile pO₂ ölçümü zorunlu değildir, ancak pO_2'deki gerçek zamanlı değişikliklerin görselleştirilmesine yardımcı olur.

3. Pulmoner arter kateterinin yerleştirilmesi

1. Pulmoner arter kateterinin (PAC) balonunda hasar olup olmadığını kontrol edin.
2. Dönüştürücüye bağlayın ve kalibre edin.
3. PAC'yi giriş kılıfından geçirin (balon sönmüş).
4. PAC giriş kılıfından (15-20 cm) geçtiğinde balonu şişirin.
5. PAC'yi ilerletin ve tipik dalga formlarını izleyin (venöz damarlar, sağ atriyum, sağ ventrikül, pulmoner arter, pulmoner kapiller kama basıncı). Balonu söndürün ve PAC'nin tüm portlarından kan aspire edilip edilemeyeceğini kontrol edin.

4. Akciğer hasarının indüksiyonu: ilk olarak bronkoalveoler lavaj tarafından vuruldu

1. 40 ° C'ye ısıtılmış steril dengeli elektrolit çözeltisi (örneğin, Sterofundin) hazırlayın.
   NOT: Akciğer kirliliğini önlemek için steril dengeli elektrolit çözeltisi kullanılır.
2. Bronkoalveoler lavajı gerçekleştirmeden önce FiO_2'yi 10 dakika boyunca 0,4'ten 1,0'a değiştirin.
3. Ultra hızlı pO₂ ölçümünü başlatın.
4. Sürekli infüzyon ve bolus enjeksiyonu için norepinefrin hazırlayın (ortalama arteriyel basınç 60 mmHg< ise). Norepinefrin şırınga pompasını çalıştırmadan santral venöz kateterin portlarından birine bağlayın.
5. Isıtılmış steril dengeli elektrolit çözeltisinden 30 mL∙^kg-1'i bir huniye doldurun. Huninin endotrakeal tüpe bağlanabildiğini kontrol edin.
6. Ventilatörden gelen inspirasyonda PEEP kaybı olmadan tüpü ayırın.
7. Huniyi endotrakeal tüpe bağlayın.
8. Huniyi hayvanın 1 m üzerine manuel olarak kaldırın.
9. Kapağı açın ve ısıtılmış dengeli elektrolit çözeltisinin tamamını huniden hidrostatik basıncı kullanarak 30 saniye boyunca endotrakeal tüpe damlatın.
10. 30 saniye sonra, huniyi hayvanın 1 metre altına indirerek demlenmiş çözeltiyi çıkarın ve lavaj sıvısını pasif olarak boşaltın. Oksijenasyon için hayvanı ventilatöre yeniden bağlayın.
11. Çıkarılan lavaj sıvısını toplayın ve miktarı not edin. Alveolar sıvı klerensini hesaplamak için gereklidir.
    NOT: Yüzey aktif maddenin yıkanmasını en üst düzeye çıkarmak için bir lavajdan sonra dengeli elektrolit çözeltisini tekrar kullanmayın.
12. Emme kateterleri kullanarak tüpteki çözeltinin geri kalanını aspire edin.
13. Bronkoalveoler lavajdan sonra hemodinamiği yakından izleyin ve norepinefrini elinizin altında bulundurun. Gerekirse, kan basıncını stabilize etmek için bolus veya sürekli infüzyon olarak norepinefrin verin (adım 4.4 ile karşılaştırın).
14. PaO₂ / FiO₂ oranı 250 mmHg'nin altına düşene kadar 4.5-4.13 adımlarında tarif edildiği gibi 30 mL∙^kg-1 dengeli elektrolit çözeltisinin infüzyonunu tekrarlayın. Bronkoalveoler lavajın dört ila beş tekrarı gerekli olabilir.
15. PaO₂ / FiO₂ oranı 250 mmHg'den düşükse, oleik asit enjeksiyonu ile akciğer hasarının indüksiyonu ile başlayın. Bu prosedür sırasında ventilatör ayarlarını değiştirmeyin.

5. Akciğer hasarının indüksiyonu: oleik asit enjeksiyonu ile ikinci vuruş

1. Oleik asit çözeltisi hazırlayın: 20 mL'lik bir şırıngada 0.1 mL∙^kg-1 oleik asit ve 3 bir musluka bağlayın. Başka bir 20 mL şırıngada 2 mL kan alın. Her iki şırıngada toplam 20 mL'lik bir hacme salin ekleyin ve ikinci şırıngayı da 3 musluka bağlayın.
   DİKKAT: Oleik asitle çalışırken eldiven ve göz koruması kullanın.
2. Sürekli infüzyon ve bolus enjeksiyonu için norepinefrin hazırlayın (ortalama arteriyel basınç 60 mmHg< ise). Norepinefrin şırınga pompasını çalıştırmadan santral venöz kateterin portlarından birine bağlayın.
3. Hala ölçülmekte olan ultra hızlı pO₂ ölçümünü izlemeye devam edin. FiO₂ hala 1.0.
4. 3 musluğu PAC'nin proksimal bağlantı noktasına bağlayın.
5. Oleik asit ve kan / salin karışımını, çözeltiyi bir şırıngadan diğer şırıngaya tekrar tekrar kaydırarak ve bunun tersini üç musluk aracılığıyla iyice karıştırın ve her zaman karıştırmaya devam edin. Homojen bir emülsiyon olduğunda, 2 mL emülsiyonu enjekte edin ve karıştırmaya devam edin.
   NOT: Karıştırma durursa, emülsiyon bir lipofilik ve bir hidrofilik kısma ayrılabilir.
6. Oleik asit enjeksiyonundan sonra hemodinamiği yakından izleyin ve norepinefrini elinizin altında bulundurun. Gerekirse, kan basıncını stabilize etmek için bolus veya sürekli infüzyon olarak norepinefrin verin (adım 5.2 ile karşılaştırın).
   NOT: Uyanık olun; Bu işlem sırasında hayvanlar ölebilir.
7. PaO₂ / FiO₂ oranı 150 mmHg'nin altına düşene kadar her 3 dakikada bir 2 mL çözelti enjeksiyonunu tekrarlayın.
8. PaO₂ / FiO₂ oranı 100 ila 200 mmHg arasında olmadan şırınga boşsa, adım 5.1'de açıklandığı gibi 2 şırınga daha hazırlayın. PaO₂/FiO₂ oranı 100 ila 200 mmHg arasına düşene kadar 5.5-5.8 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: Oleik asidin yarım ila tam şırıngası ve kan / salin karışımı genellikle gereklidir.
9. PaO₂/FiO₂ oranı 100 ila 200 mmHg arasındaysa, 30 dakika bekleyin ve tekrar kontrol edin. Sürekli olarak 200 mmHg'nin altındaysa, deney / tedaviye başlayın; Aksi takdirde, adım 5.1'de açıklandığı gibi 2 şırınga daha hazırlayın ve 5.5-5.9 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: Tarif edildiği gibi akciğer hasarının indüksiyonundan sonra, akciğer fonksiyonundaki bozulma sabit kalabilir veya bozulabilir ve hatta belirli sınırlar içinde iyileşebilir.

6. Deneyin sonu ve ötenazi

1. Sürekli anesteziye ek olarak 0.5 mg fentanil enjekte edin ve 5 dakika bekleyin. Derin anestezide hayvanı öldürmek için 200 mg propofol ve 40 mmol potasyum klorür enjekte edin.

PaO₂ / FiO₂ oranı, bronkoalveoler lavaj ve fraksiyone oleik asit uygulamasından sonra azalır (Şekil 1). Bronkoalveoler lavajın etkisini tahmin etmek belirsiz olduğundan (ör., fraksiyone oleik asit dozunun etkisi) PaO₂ / FiO₂ oranı üzerinde, akciğer hasarını indüklerken PaO₂ / FiO₂ oranının izlenmesi önerilir. Ultra hızlı pO₂ ölçümü, PaO_2'nin gerçek ...

Domuzlarda ciddi bir akciğer hasarına neden olmak için tarif edilen çift vuruş yöntemi, ARDS'de farklı tedavi seçeneklerini incelemek için uygundur. Çift vuruşlu model, ARDS'nin patomekanizmasının iki merkezi unsurunu taklit eder: alveolar-kılcal birimin kaybı ve endotel bariyerinin^{bozulması 7}. İki isabet nedeniyle, önceden tanımlanmış hedef değerlere sahip bir çalışma protokolüne sahip olmak önemlidir (örneğin, PaO₂ / FiO

Tüm yazarlar hiçbir finansal veya başka bir çıkar çatışması açıklamaz.

Yazarlar, mükemmel teknik destek için Dagmar Dirvonskis'e teşekkür etmek istiyor.