Bronchoalveoläre Lavage und Ölsäure-Injektion bei Schweinen als Double-Hit-Modell für das akute Atemnotsyndrom (ARDS)

Es existieren verschiedene, komplexe Tiermodelle, um die Pathophysiologie des akuten Atemnotsyndroms (ARDS) zu untersuchen. Die durch Bronchoalveoläre Lavage und Ölsäureinjektion induzierte Lungenschädigung eignet sich als neues Double-Hit-Tiermodell für die Untersuchung des akuten Atemnotsyndroms.

Die Behandlung von ARDS stellt die Intensivmediziner auch im 21. Jahrhundert vor große Herausforderungen, da die Sterblichkeitsrate in schweren Fällen immer noch bis zu 50 % erreicht. Weitere Forschungsanstrengungen sind notwendig, um die komplexe Pathophysiologie dieser Krankheit besser zu verstehen. Es gibt verschiedene gut etablierte Tiermodelle, um eine akute Lungenschädigung zu induzieren, aber keines war in der Lage, die komplexen Pathomechanismen von ARDS angemessen nachzuahmen. Der wichtigste Faktor für die Entstehung dieser Erkrankung ist die Schädigung der Alveolarkapillareinheit. Die Kombination von zwei etablierten Lungenverletzungsmodellen ermöglicht es uns, den zugrundeliegenden Pathomechanismus detaillierter nachzuahmen. Die bronchoalveoläre Lavage (BAL) führt zu einer Verarmung des Tensids sowie zum Kollaps der Alveolare. Das wiederholte Einträufeln von Flüssigkeitsvolumen führt zu einer nachfolgenden Hypoxämie. Der Abbau von Tensiden ist ein Schlüsselfaktor für ARDS beim Menschen. BAL wird oft mit anderen Lungenverletzungsansätzen kombiniert, aber noch nicht mit einem zweiten Treffer, gefolgt von einer Ölsäureinjektion (OAI). Die Ölsäureinjektion führt zu einer stark gestörten Gasaustauschung, einer Verschlechterung der Lungenmechanik und einer Störung der Alveolokapillarschranke. Die OAI ahmt die meisten der erwarteten Auswirkungen von ARDS nach, die in einer ausgedehnten Entzündung des Lungengewebes mit einer Zunahme der Alveolarleckage und einer Beeinträchtigung des Gasaustauschs bestehen. Ein Nachteil der Kombination verschiedener Modelle ist die Schwierigkeit, den Einfluss auf die Lungenschädigung durch BAL allein, OAI allein oder beide zusammen zu bestimmen. Das in diesem Bericht vorgestellte Modell stellt die Kombination von BAL und OAI als neues Double-Hit-Lungenverletzungsmodell dar. Dieses neue Modell ist einfach zu implementieren und eine Alternative, um in Zukunft verschiedene Therapieansätze bei ARDS zu untersuchen.

Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist eine Erkrankung, die aus einem gestörten Gasaustausch und einer Lungeninfiltration besteht und häufig eine intensivmedizinische Therapie erfordert. Die Sterblichkeit bei schwerem ARDS ist trotz fast 50 Jahren umfangreicher Forschung weltweit nach wie vor hoch (bis zu 50 %)¹. Das ARDS wird durch die Berliner Definition definiert, die diagnostische Kriterien wie Timing, Thoraxbildgebung, Entstehung des Ödems und Hypoxämie² umfasst. Um Patienten mit unterschiedlichen Schweregraden des ARDS besser kategorisieren zu können, werden drei verschiedene Grade der Hypoxämie definiert: leicht (200 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 300 mmHg), mittelschwer (100 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 200 mmHg) und schwer (PaO₂/FIO₂ ≤ 100 mmHg)². Verschiedene Tiermodelle mit dem Schwerpunkt Lungenschädigung sind weit verbreitet und akzeptiert, um die pathophysiologischen Veränderungen und unterschiedliche Therapieansätze bei ARDS³ zu untersuchen.

Tiermodelle mit Endotoxinen (z. B. intravenöse Infusion von Bakterien, Zäkalligatur und Punktion zur Nachahmung einer Sepsis-induzierten Lungenverletzung), Ischämie-/Reperfusionsmodelle, Rauch-/Verbrennungs-ARDS-Modelle, Infusion von Ölsäure und bronchoalveoläre Lavage-Modelle^{sind bekannt 3}. Jedes Modell repräsentiert nur wenige pathophysiologische Veränderungen mit Vor- und Nachteilen zu den Studienergebnissen³. Dies spiegelt die Komplexität der ARDS-Erkrankung nicht wider. Die Kombination zweier bewährter Modelle erlaubt bessere Rückschlüsse auf die Pathophysiologie des ARDS. Im vorgestellten Modell kombinierten wir bronchoalveoläre Lavage und Ölsäureinfusion, um die Komplexität des humanen ARDS nachzuahmen. Ölsäure ist eine ungesättigte Fettsäure und wirkt direkt auf die Alveolokapillareinheit der Lunge, indem sie die Aktivierung der angeborenen Immunrezeptoren auslöst, was in der Folge zu einer Akkumulation von Neutrophilen, einer proinflammatorischen Zytokinproduktion und zum Zelltod führt ^4,5. Die Ölsäureinfusion induziert eine schwere Hypoxämie, einen Anstieg des pulmonalen arteriellen Drucks und eine Ansammlung von extravaskulärem Lungenwasser. Hypotonie und Myokarddepression aufgrund einer rechtsventrikulären Insuffizienz treten häufig auf. Die Induktion einer Lungenschädigung durch wiederholte bronchoalveoläre Lavage (BAL) mit balancierter Elektrolytlösung reduziert die alveoläre Tensidlipidkonzentration³. Tenside verringern die Oberflächenspannung der Alveolen und verhindern den Kollaps der Alveolare. BAL führt zu einer sofortigen Hypoxämie und einer Erhöhung der alveolär-arteriellen Sauerstoffdifferenz³. Humanes ARDS ist auch mit einer Erschöpfung des Tensids³ verbunden. Die Nachteile dieses kombinierten Modells sind die Notwendigkeit eines zentralvenösen Zugangs, einer Intubation und einer Vollnarkose. Darüber hinaus bleibt die fragwürdige mechanistische Relevanz (z.B. die Ölsäureinfusion) für translationale Aspekte unklar. Zumindest ist es schwierig zu bestimmen, welcher Teil der Lungenverletzung (BAL vs. OAI oder beide zusammen) zur Lungenschädigung beiträgt. Die Vorteile dieses Modells sind seine Anwendbarkeit bei Großtieren mit vertrauter Überwachung und Instrumentierung ähnlich wie bei menschlichen Patienten (keine spezielle Ausrüstung erforderlich), die gute Reproduktion der Hauptaspekte des ARDS und die Möglichkeit, isoliertes ARDS ohne systemische Entzündung zu untersuchen (z.B. Endotoxin-Modelle). Im folgenden Artikel geben wir eine detaillierte Beschreibung der Double-Hit-Lungenschädigung (BAL und OAI) bei Schweinen und liefern repräsentative Daten, um die Stabilität der Kompromisse in der Lungenfunktion zu charakterisieren.

Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden vom institutionellen und staatlichen Tierpflegeausschuss (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Deutschland; Zulassungsnummer G18-1-044) genehmigt und nach den Richtlinien der Europäischen und Deutschen Gesellschaft für Versuchstierwissenschaften durchgeführt.

1. Anästhesie, Intubation und mechanische Beatmung

1. Halten Sie die Nahrung 6 Stunden vor der Anästhesie zurück, um das Risiko einer Aspiration zu verringern, aber erlauben Sie freien Zugang zu Wasser, um Stress abzubauen.
2. Injizieren Sie eine Kombination aus Ketamin (4 mg∙^kg-1) und Azaperon (8 mg∙^kg-1) intramuskulär zur Sedierung, während sich das Tier in der Tierbox befindet.
3. Legen Sie nach lokaler Desinfektion mit Alkohol einen Venenzugang mit einem gemeinsamen peripheren Venenkatheter (20 G) in einer Ohrvene an.
4. Beginnen Sie mit der Überwachung der peripheren Sauerstoffsättigung (SpO₂), indem Sie den Sensor an einem der Ohren oder dem Schwanz des Tieres befestigen.
5. Injizieren Sie Fentanyl (4 μg∙^kg-1), Propofol (3 mg∙^kg-1) und Atracurium (0,5 mg∙^kg-1) zur Einleitung der Anästhesie.
6. Legen Sie das Schwein in Rückenlage auf die Trage.
7. Beatmen Sie das Schwein mit einer Maske, die für Tiere mit einem Spitzeninspirationsdruck unter 20 cmH₂O, einem PEEP von 5 cmH₂O, einer Frequenz von 14-16 /min und einem FiO₂ von 1,0 geeignet ist.
8. Beginnen Sie eine kontinuierliche Infusion mit ausgewogener Elektrolytlösung (5 ml∙^kg-1∙^h-1), Propofol (8-12 mg∙^kg-1∙^h-1) und Fentanyl (0,1-0,2 mg∙^kg-1∙^h-1), um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
9. Für die Intubation verwenden Sie einen für das Tier geeigneten Endotrachealtubus (z. B. Gewicht von 25-30 kg, Endotrachealtubus ID 6-7), der mit einem Endotrachealtubus-Einführkopf bewaffnet ist, und ein gängiges Laryngoskop mit einer Macintosh-Klinge 4. Zwei Personen sind notwendig.
   1. Person 1: Ziehe mit einer Hand die Zunge heraus und drücke mit der anderen die Schnauze nach unten.
   2. Person 2: Legen Sie das Laryngoskop ein und schieben Sie es wie gewohnt vor, bis die Epiglottis sichtbar gemacht werden kann.
10. Ziehen Sie das Laryngoskop nach oben, um die Stimmbänder sichtbar zu machen. Manchmal "klebt" die Epiglottis am weichen Gaumen. Wenn ja, mobilisieren Sie es mit der Spitze des Schlauches.
11. Führen Sie den Schlauch durch die Stimmbänder und ziehen Sie den Einführknopf heraus.
12. Blockieren Sie den Ballon der Röhre.
13. Schließen Sie den Schlauch an das Beatmungsgerät an und überprüfen Sie die korrekte Positionierung mit Kapnographie und Auskultation.
14. Beginn der mechanischen Beatmung (Tidalvolumen 6-8 ml/kg, PEEP 5 cmH₂O, FiO₂ 0,4, Häufigkeit, um etCO₂ zwischen 35 und 45 mmHg zu halten).

2. Besetzung

1. Ziehen Sie die Hinterbeine mit Bandagen zurück, um die notwendigen Gefäße zu katheterisieren. Notwendig sind ein arterieller Zugang, eine arterielle Einführschleuse, ein zentraler Venenzugang und eine venöse Einführschleuse für die Platzierung eines Pulmonalarterienkatheters.
2. Desinfizieren Sie den Oberschenkelbereich großzügig mit alkoholischer Desinfektion. Abhängig von den geplanten Untersuchungen wird ein mehr oder weniger aseptisches Vorgehen gewählt.
3. Bereiten Sie Katheter vor, indem Sie sie mit Kochsalzlösung spülen.
4. Legen Sie die Ultraschallsonde auf das Leistenband und suchen Sie nach Oberschenkelgefäßen.
5. Drehen Sie die Sonde um 90°, um die Oberschenkelarterie in der Längsachse vollständig sichtbar zu machen. Bei Bedarf ist es unter verschiedenen Umständen auch möglich, die Kurzachsenansicht zu verwenden, um die Oberschenkelarterie vollständig sichtbar zu machen.
6. Kanülieren Sie die Oberschenkelarteria unter Inline-Ultraschallvisualisierung mit der Nadel des Einführgeräts nach Seldingers Technik. Wenn pulsierendes helles Blut austritt, führen Sie den Führungsdraht ein und ziehen Sie die Nadel zurück.
7. Visualisieren Sie die Vena femoralis und kanülieren Sie die Vene unter Inline-Ultraschallvisualisierung und kontinuierlicher Aspiration mit der Nadel des Einführsets. Wenn venöses Blut aspirierbar ist, trennen Sie die Spritze und führen Sie den Führungsdraht ein. Ziehen Sie die Nadel zurück.
8. Überprüfen Sie die Position der Drähte mit Ultraschall.
9. Führen Sie die arterielle und die venöse Leitung über die platzierten Führungsdrähte ein.
10. Wiederholen Sie die arterielle und venöse Interpunktion auf der anderen Seite und führen Sie die Einführschleusen gemäß der oben beschriebenen Seldinger-Technik ein.
11. Verbinden Sie den arteriellen Zugang und den Venenzugang jeweils mit einem Schallkopf.
12. Positionieren Sie beide Schallköpfe auf Herzhöhe und schalten Sie die Drei-Wege-Absperrhähne beider Schallköpfe zur Atmosphäre hin offen, um das System auf Null zu kalibrieren.
    HINWEIS: Um plausible Werte zu erzeugen, ist es notwendig, Luftblasen und Blutflecken im System zu vermeiden.
13. Schalten Sie die Infusion von Propofol und Fentanyl auf einen der Ports des zentralen Venengangs um.
14. Kalibrieren Sie die Sonde für ultraschnelle_{pO 2-Messungen} und führen Sie sie durch die arterielle Einführschleuse ein.
    HINWEIS: Die Messung von_{pO 2} mit der Sonde für die ultraschnelle_{pO 2-Messung} ist nicht obligatorisch, hilft aber, die Änderungen von pO₂ in Echtzeit sichtbar zu machen.

3. Einführen eines Pulmonalarterienkatheters

1. Überprüfen Sie den Ballon des Pulmonalarterienkatheters (PAC) auf Beschädigungen.
2. Schließen Sie ihn an den Wandler an und kalibrieren Sie ihn.
3. Führen Sie das PAC durch die Einführschleuse ein (Ballon entleert).
4. Wenn das PAC die Einführschleuse (15-20 cm) passiert hat, blasen Sie den Ballon auf.
5. Verschieben Sie die PAC und überwachen Sie die typischen Wellenformen (venöse Gefäße, rechter Vorhof, rechter Ventrikel, Lungenarteria, pulmonaler Kapillarkeildruck). Lassen Sie die Luft aus dem Ballon und prüfen Sie, ob Blut durch alle Anschlüsse des PAC abgesaugt werden kann.

4. Induktion einer Lungenverletzung: zuerst durch bronchoalveoläre Lavage getroffen

1. Bereiten Sie eine sterile, ausgewogene Elektrolytlösung (z. B. Sterofundin) vor, die auf 40 °C erwärmt ist.
   HINWEIS: Zur Vermeidung von Lungenverschmutzung wird eine sterile Elektrolytlösung verwendet.
2. Ändern Sie den FiO₂ innerhalb von 10 Minuten von 0,4 auf 1,0, bevor Sie die bronchoalveoläre Lavage durchführen.
3. Starten Sie die ultraschnelle_{pO 2-Messung}.
4. Bereiten Sie Noradrenalin für die kontinuierliche Infusion und für die Bolusinjektion vor (wenn der mittlere arterielle Druck 60 mmHg <). Schließen Sie die Noradrenalin-Spritzenpumpe an einen der Anschlüsse des zentralen Venenkatheters an, ohne ihn zu starten.
5. Füllen Sie 30 ml∙^kg-1 aus der erwärmten sterilen Elektrolytlösung in einen Trichter. Prüfen Sie, ob der Trichter mit dem Endotrachealtubus verbunden werden kann.
6. Trennen Sie den Schlauch ohne PEEP-Verlust bei der Inspiration durch das Beatmungsgerät.
7. Verbinden Sie den Trichter mit dem Endotrachealtubus.
8. Heben Sie den Trichter manuell 1 m über das Tier an.
9. Öffnen Sie den Deckel und träufeln Sie die gesamte Menge der erwärmten ausgeglichenen Elektrolytlösung aus dem Trichter über 30 s unter Verwendung des hydrostatischen Drucks in den Endotrachealtubus.
10. Entfernen Sie nach 30 s die infundierte Lösung, indem Sie den Trichter 1 Meter unter das Tier absenken und die Spülflüssigkeit passiv ablassen. Schließen Sie das Tier wieder an das Beatmungsgerät an, um es mit Sauerstoff zu versorgen.
11. Sammeln Sie die entfernte Spülflüssigkeit und notieren Sie die Menge. Es wird benötigt, um die Clearance der Alveolarflüssigkeit zu berechnen.
    HINWEIS: Verwenden Sie die ausgeglichene Elektrolytlösung nach einer Spülung nicht wieder, um das Auswaschen des Tensids zu maximieren.
12. Saugen Sie die Reste der Lösung im Schlauch mit Absaugkathetern ab.
13. Überwachen Sie die Hämodynamik nach der bronchoalveolären Lavage genau und halten Sie Noradrenalin griffbereit. Falls erforderlich, Noradrenalin als Bolus oder kontinuierliche Infusion zur Stabilisierung des Blutdrucks verabreichen (vgl. Schritt 4.4).
14. Wiederholen Sie die Infusion von 30 ml∙^kg-1 ausgeglichener Elektrolytlösung, wie in den Schritten 4.5-4.13 beschrieben, bis das PaO₂/FiO_{2-Verhältnis} unter 250 mmHg liegt. Vier bis fünf Wiederholungen der bronchoalveolären Lavage können notwendig sein.
15. Wenn das_PaO2/FiO2-Verhältnis niedriger als 250 mmHg ist, beginnen Sie mit der Einleitung einer Lungenschädigung durch Ölsäureinjektion. Ändern Sie die Einstellungen des Beatmungsgeräts während dieses Vorgangs nicht.

5. Induktion einer Lungenverletzung: zweiter Treffer durch Ölsäure-Injektion

1. Ölsäurelösung herstellen: 0,1 mL∙^kg-1 Ölsäure in eine 20 mL Spritze geben und an einen 3-Wege-Absperrhahn anschließen. Entnehmen Sie 2 ml Blut in einer weiteren 20 ml Spritze. Geben Sie in beiden Spritzen Kochsalzlösung zu einem Gesamtvolumen von 20 mL und verbinden Sie die zweite Spritze ebenfalls mit dem 3-Wege-Absperrhahn.
   ACHTUNG: Verwenden Sie Handschuhe und Augenschutz, wenn Sie mit Ölsäure arbeiten.
2. Bereiten Sie Noradrenalin für die kontinuierliche Infusion und für die Bolusinjektion vor (wenn der mittlere arterielle Druck 60 mmHg <). Schließen Sie die Noradrenalin-Spritzenpumpe an einen der Anschlüsse des zentralen Venenkatheters an, ohne ihn zu starten.
3. Überwachen Sie weiterhin die ultraschnelle_{pO 2-Messung}, die noch misst. FiO₂ ist immer noch 1,0.
4. Verbinden Sie den 3-Wege-Absperrhahn mit dem proximalen Anschluss des PAC.
5. Mischen Sie die Ölsäure und das Blut-Kochsalz-Gemisch gründlich, indem Sie die Lösung wiederholt von einer Spritze in die andere Spritze und umgekehrt über den Drei-Wege-Absperrhahn umschieben und die ganze Zeit mischen. Wenn es sich um eine homogene Emulsion handelt, injizieren Sie 2 ml der Emulsion und fahren Sie mit dem Mischen fort.
   HINWEIS: Wenn das Mischen stoppt, kann sich die Emulsion in einen lipophilen und einen hydrophilen Teil trennen.
6. Überwachen Sie die Hämodynamik nach der Injektion von Ölsäure genau und halten Sie Noradrenalin griffbereit. Falls erforderlich, Noradrenalin als Bolus oder Dauerinfusion zur Stabilisierung des Blutdrucks verabreichen (vgl. Schritt 5.2).
   HINWEIS: Seien Sie wachsam; Die Tiere können bei diesem Eingriff sterben.
7. Wiederholen Sie die Injektion von 2 mL der Lösung alle 3 Minuten, bis das PaO₂/FiO_{2-Verhältnis} unter 150 mmHg liegt.
8. Wenn die Spritze leer ist, bevor das PaO₂/FiO_{2-Verhältnis} zwischen 100 und 200 mmHg liegt, bereiten Sie 2 weitere Spritzen vor, wie in Schritt 5.1 beschrieben. Wiederholen Sie die Schritte 5.5-5.8, bis das PaO₂/FiO_{2-Verhältnis} zwischen 100 und 200 mmHg liegt.
   HINWEIS: In der Regel ist eine halbe bis volle Spritze mit der Ölsäure und dem Blut-Kochsalzlösung-Gemisch erforderlich.
9. Wenn das PaO₂/FiO_{2-Verhältnis} zwischen 100 und 200 mmHg liegt, warten Sie 30 Minuten und überprüfen Sie es erneut. Wenn er konstant unter 200 mmHg liegt, beginnen Sie mit dem Experiment/der Behandlung. Andernfalls bereiten Sie 2 weitere Spritzen vor, wie in Schritt 5.1 beschrieben, und wiederholen Sie die Schritte 5.5-5.9.
   HINWEIS: Nach Einleitung einer Lungenverletzung wie beschrieben kann die Beeinträchtigung der Lungenfunktion stabil bleiben oder sich verschlechtern oder sogar innerhalb bestimmter Grenzen verbessern.

6. Ende des Versuchs und Euthanasie

1. Injizieren Sie zusätzlich zur Daueranästhesie 0,5 mg Fentanyl und warten Sie 5 min. Injizieren Sie 200 mg Propofol und 40 mmol Kaliumchlorid, um das Tier in tiefer Narkose zu töten.

Das_PaO2/FiO2-Verhältnis nimmt nach bronchoalveolärer Lavage und fraktionierter Anwendung von Ölsäure ab (Abbildung 1). Da es unklar ist, den Einfluss der bronchoalveolären Lavage (z. B. den Einfluss einer fraktionierten Ölsäuredosis) auf das_PaO2/FiO2-Verhältnis vorherzusagen, wird empfohlen, das_PaO2/FiO2-Verhältnis zu überwachen, während die Lungenverletzung induziert wird. Die ultr...

Die beschriebene Double-Hit-Methode zur Herbeiführung einer schweren Lungenschädigung bei Schweinen ist geeignet, um verschiedene Behandlungsoptionen bei ARDS zu untersuchen. Das Double-Hit-Modell ahmt zwei zentrale Elemente des Pathomechanismus des ARDS nach: den Verlust der Alveolen-Kapillar-Einheit und die Störung der Endothelbarriere⁷. Aufgrund der beiden Treffer ist es wichtig, ein Studienprotokoll mit vordefinierten Zielwerten (z.B. PaO₂/FiO

Alle Autoren legen keine finanziellen oder sonstigen Interessenkonflikte offen.

Die Autoren danken Dagmar Dirvonskis für die hervorragende technische Unterstützung.