Lavado broncoalveolar e inyección de ácido oleico en cerdos como modelo de doble golpe para el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA)

Existen modelos animales diferentes y complejos para estudiar la fisiopatología del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). El lavado broncoalveolar y la lesión pulmonar inducida por inyección de ácido oleico son adecuados como un nuevo modelo animal de doble golpe para estudiar el síndrome de dificultad respiratoria aguda.

El tratamiento del SDRA sigue planteando grandes desafíos para los médicos intensivistas en el siglo XXI, con tasas de mortalidad que aún alcanzan el 50% en los casos graves. Se necesitan más esfuerzos de investigación para comprender mejor la compleja fisiopatología de esta enfermedad. Existen diferentes modelos animales bien establecidos para inducir lesiones pulmonares agudas, pero ninguno ha sido capaz de imitar adecuadamente los complejos mecanismos patológicos del SDRA. El factor más crucial para el desarrollo de esta afección es el daño a la unidad capilar alveolar. La combinación de dos modelos de lesión pulmonar bien establecidos nos permite imitar con más detalle el mecanismo patológico subyacente. El lavado broncoalveolar (LBA) conduce a la depleción del surfactante, así como al colapso alveolar. La instilación repetida de volúmenes de líquido provoca hipoxemia posterior. La depleción de surfactante es un factor clave del SDRA en los seres humanos. El LBA a menudo se combina con otros enfoques de lesión pulmonar, pero aún no con un segundo golpe seguido de una inyección de ácido oleico (OAI). La inyección de ácido oleico provoca una grave alteración del intercambio gaseoso, un deterioro de la mecánica pulmonar y una alteración de la barrera alveolo-capilar. El OAI imita la mayoría de los efectos esperados del SDRA, que consiste en una inflamación prolongada del tejido pulmonar con un aumento de la fuga alveolar y un deterioro del intercambio gaseoso. Una desventaja de la combinación de diferentes modelos es la dificultad de determinar la influencia en la lesión pulmonar causada por el LBA solo, el OAI solo o ambos juntos. El modelo presentado en este informe representa la combinación de BAL y OAI como un nuevo modelo de lesión pulmonar de doble impacto. Este nuevo modelo es fácil de implementar y una alternativa para estudiar diferentes abordajes terapéuticos en el SDRA en el futuro.

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es una enfermedad que consiste en una alteración del intercambio de gases y la infiltración pulmonar, que a menudo requiere tratamiento de cuidados intensivos. La mortalidad del SDRA grave sigue siendo alta (hasta el 50%) en todo el mundo, a pesar de casi 50 años de investigación exhaustiva¹. El SDRA está definido por la Definición de Berlín, incluyendo criterios diagnósticos como el tiempo, las imágenes de tórax, el origen del edema y la hipoxemia². Para categorizar mejor a los pacientes con diferentes niveles de severidad del SDRA, se definen tres grados diferentes de hipoxemia: leve (200 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 300 mmHg), moderada (100 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 200 mmHg) y grave (PaO₂/FIO₂ ≤ 100 mmHg)². Diferentes modelos animales con un enfoque en la lesión pulmonar son ampliamente utilizados y aceptados para examinar los cambios fisiopatológicos y los diferentes enfoques terapéuticos en el SDRA³.

Se conocen modelos animales que utilizan endotoxinas (p. ej., infusión intravenosa de bacterias, ligadura cecal y punción para imitar una lesión pulmonar inducida por sepsis), modelos de isquemia/reperfusión, modelos de SDRA por humo/quemadura, infusión de ácido oleico y modelos de lavado broncoalveolar³. Cada modelo representa solo unos pocos cambios fisiopatológicos, con ventajas y desventajas para los resultados del estudio³. Esto no refleja la complejidad de la enfermedad del SDRA. La combinación de dos modelos probados permite obtener mejores conclusiones sobre la fisiopatología del SDRA. En el modelo presentado, combinamos el lavado broncoalveolar y la infusión de ácido oleico para imitar la complejidad del SDRA humano. El ácido oleico es un ácido graso insaturado y actúa directamente sobre la unidad alveolo-capilar de los pulmones desencadenando la activación de los receptores inmunes innatos, causando posteriormente la acumulación de neutrófilos, la producción de citoquinas proinflamatorias y la muerte celular ^4,5. La infusión de ácido oleico induce hipoxemia severa, aumento de la presión arterial pulmonar y acumulación de agua pulmonar extravascular. A menudo se presenta hipotensión y depresión miocárdica debido a insuficiencia ventricular derecha. La inducción de la lesión pulmonar mediante lavado broncoalveolar repetido (LBA) con solución electrolítica equilibrada reduce la concentración de lípidos del surfactante alveolar³. Los tensioactivos disminuyen la tensión superficial alveolar y previenen el colapso alveolar. El LBA causa hipoxemia inmediata y aumento de la diferencia de oxígeno alveolar-arterial³. El SDRA humano también se asocia con el agotamiento del surfactante³. Las desventajas de este modelo combinado son la necesidad de acceso venoso central, intubación y anestesia general. Además, la cuestionable relevancia mecanicista (por ejemplo, la infusión de ácido oleico) para los aspectos traslacionales sigue sin estar clara. Al menos, es difícil determinar qué parte de la lesión pulmonar (BAL vs. OAI, o ambas juntas) contribuye al daño pulmonar. Las ventajas de este modelo son su usabilidad en animales grandes con una monitorización e instrumentación familiares similares a los pacientes humanos (no se requiere equipo especial), la buena reproducción de los principales aspectos del SDRA y la posibilidad de estudiar el SDRA aislado sin inflamación sistémica (por ejemplo, modelos de endotoxinas). En el siguiente artículo, damos una descripción detallada de la lesión pulmonar de doble golpe (BAL y OAI) en cerdos y proporcionamos datos representativos para caracterizar la estabilidad de los compromisos en la función pulmonar.

Todos los experimentos con animales descritos aquí han sido aprobados por el comité institucional y estatal de cuidado animal (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Alemania; número de aprobación G18-1-044) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Sociedad Europea y Alemana de Ciencias de Animales de Laboratorio.

1. Anestesia, intubación y ventilación mecánica

1. Suspenda los alimentos durante 6 horas antes de la anestesia para reducir el riesgo de aspiración, pero permita el libre acceso al agua para reducir el estrés.
2. Inyecte una combinación de ketamina (4 mg∙^kg-1) y azaperona (8 mg∙^kg-1) por vía intramuscular para la sedación mientras el animal está en la caja del animal.
3. Establecer una línea venosa con un catéter venoso periférico común (20 G) en una vena del oído después de la desinfección local con alcohol.
4. Comience a controlar la saturación periférica de oxígeno (SpO₂) sujetando el sensor a una de las orejas o a la cola del animal.
5. Inyectar fentanilo (4 μg∙^kg-1), propofol (3 mg∙^kg-1) y atracurio (0,5 mg∙^kg-1) para la inducción de la anestesia.
6. Coloque al cerdo en posición supina en la camilla.
7. Ventilar al cerdo con una mascarilla adecuada para animales con una presión inspiratoria máxima inferior a 20_cmH2O, una PEEP de 5_cmH2O, una frecuencia de 14-16 /min y una_FiO2 de 1,0.
8. Inicie una infusión continua con solución equilibrada de electrolitos (5 mL∙^kg-1∙^h-1), propofol (8-12 mg∙^kg-1∙^h-1) y fentanilo (0.1-0.2 mg∙^kg-1∙^h-1) para mantener la anestesia.
9. Para la intubación, utilice un tubo endotraqueal común adecuado para el animal (por ejemplo, peso de 25-30 kg, tubo endotraqueal ID 6-7) armado con un introductor de tubo endotraqueal y un laringoscopio común con una cuchilla Macintosh 4. Son necesarias dos personas.
   1. Persona 1: Saca la lengua con una mano y presiona el hocico hacia abajo con la otra.
   2. Persona 2: Insertar el laringoscopio y avanzarlo como de costumbre hasta visualizar la epiglotis.
10. Tire del laringoscopio hacia arriba para visualizar las cuerdas vocales. A veces la epiglotis se "pega" al palatino blando. Si es así, muévalo con la punta del tubo.
11. Inserte el tubo a través de las cuerdas vocales y extraiga el introductor.
12. Bloquea el globo del tubo.
13. Conecte el tubo al ventilador y verifique la posición correcta con capnografía y auscultación.
14. Arranque de la ventilación mecánica (volumen corriente 6-8 mL/kg, PEEP 5 cmH₂O, FiO₂ 0,4, frecuencia para mantener etCO₂ entre 35 – 45 mmHg).

2. Instrumentación

1. Retraiga las patas traseras con vendajes para cateterizar los vasos necesarios. Es necesario un catéter arterial, una vaina introductora arterial, una vía venosa central y una vaina introductora venosa para la colocación del catéter de la arteria pulmonar.
2. Desinfectar generosamente la zona femoral con desinfección alcohólica. Dependiendo de los exámenes planificados, se utiliza un enfoque más o menos aséptico.
3. Prepare los catéteres enjuagándolos con solución salina.
4. Coloque la sonda de ultrasonido en el ligamento inguinal y escanee los vasos femorales.
5. Gire la sonda 90° para visualizar completamente la arteria femoral en el eje largo. Si es necesario, también es posible utilizar la vista de eje corto en diferentes circunstancias para visualizar completamente la arteria femoral.
6. Cánula de la arteria femoral bajo visualización ecográfica en línea con la aguja del introductor establecido en la técnica de Seldinger. Cuando la sangre brillante pulsante fluya, introduzca la guía y retraiga la aguja.
7. Visualización de la vena femoral y cánula de la vena mediante visualización ecográfica en línea y aspiración continua con la aguja del set introductor. Cuando la sangre venosa sea aspirable, desconecte la jeringa e inserte la guía. Retraiga la aguja.
8. Compruebe la posición de los cables con ecografía.
9. Inserte la línea arterial y la venosa sobre las guías colocadas.
10. Repita la puntuación arterial y venosa en el otro lado e inserte las vainas introductoras según la técnica de Seldinger como se describió anteriormente.
11. Conecte la línea arterial y la línea venosa a un transductor.
12. Coloque ambos transductores a nivel del corazón y abra las llaves de paso de tres vías de ambos transductores a la atmósfera para calibrar el sistema a cero.
    NOTA: Es necesario evitar las burbujas de aire y las manchas de sangre en el sistema para generar valores plausibles.
13. Cambiar la infusión de propofol y fentanilo a uno de los puertos de la vía venosa central.
14. Calibre la sonda para mediciones ultrarrápidas de pO₂ e insértela a través de la vaina introductora arterial.
    NOTA: La medición de_pO2 con la sonda para la medición ultrarrápida de_pO2 no es obligatoria, pero ayuda a visualizar los cambios en tiempo real en_pO2.

3. Inserción del catéter de la arteria pulmonar

1. Revise el balón del catéter de la arteria pulmonar (PAC, por sus siglas en inglés) para ver si está dañado.
2. Conéctelo al transductor y calibre.
3. Inserte el PAC a través de la vaina introductora (globo desinflado).
4. Cuando el PAC haya pasado a través de la vaina introductora (15-20 cm), infle el globo.
5. Avance de la PAC y controle las formas de onda típicas (vasos venosos, aurícula derecha, ventrículo derecho, arteria pulmonar, presión en cuña capilar pulmonar). Desinfle el globo y verifique si la sangre se puede aspirar a través de todos los puertos del PAC.

4. Inducción de lesión pulmonar: primer golpe por lavado broncoalveolar

1. Prepare una solución electrolítica balanceada estéril (por ejemplo, esterofundina) calentada a 40 °C.
   NOTA: Se utiliza una solución de electrolitos balanceada estéril para evitar la contaminación pulmonar.
2. Cambie la FiO₂ de 0,4 a 1,0 durante 10 minutos antes de realizar el lavado broncoalveolar.
3. Inicie la medición ultrarrápida de pO₂.
4. Prepare norepinefrina para perfusión continua y para inyección en bolo (si la presión arterial media < 60 mmHg). Conecte la bomba de jeringa de norepinefrina a uno de los puertos del catéter venoso central sin ponerlo en marcha.
5. Llene 30 mL∙^kg-1 de la solución de electrolito balanceada estéril calentada en un embudo. Compruebe que el embudo se puede conectar al tubo endotraqueal.
6. Desconecte el tubo sin pérdida de PEEP en la inspiración del ventilador.
7. Conecte el embudo al tubo endotraqueal.
8. Levante el embudo 1 m por encima del animal manualmente.
9. Abra la tapa y estimente la cantidad total de la solución de electrolito balanceada calentada desde el embudo hasta el tubo endotraqueal durante 30 s utilizando la presión hidrostática.
10. Después de 30 s, retire la solución infundida bajando el embudo 1 metro por debajo del animal y drene el líquido de lavado de forma pasiva. Vuelva a conectar el animal al ventilador para la oxigenación.
11. Recoja el líquido de lavado extraído y anote la cantidad. Es necesario para calcular el aclaramiento del líquido alveolar.
    NOTA: No reutilice la solución de electrolito balanceada después de un lavado para maximizar el lavado del surfactante.
12. Aspire los restos de la solución en el tubo mediante el uso de catéteres de succión.
13. Vigile de cerca la hemodinámica después del lavado broncoalveolar y tenga a mano norepinefrina. Si es necesario, administre norepinefrina en forma de bolo o infusión continua para estabilizar la presión arterial (comparar con el paso 4.4).
14. Repita la infusión de 30 mL∙^kg-1 de solución de electrolito balanceada como se describe en los pasos 4.5-4.13 hasta que la relación PaO₂/FiO₂ sea inferior a 250 mmHg. Pueden ser necesarias de cuatro a cinco repeticiones del lavado broncoalveolar.
15. Si la relación_PaO2/_FiO2 es inferior a 250 mmHg, se debe comenzar con la inducción de lesión pulmonar mediante la inyección de ácido oleico. No cambie la configuración del ventilador durante este procedimiento.

5. Inducción de lesión pulmonar: segundo golpe por inyección de ácido oleico

1. Prepare la solución de ácido oleico: 0,1 mL∙^kg-1 de ácido oleico en una jeringa de 20 mL y conéctela a una llave de paso de 3 vías. Tome 2 mL de sangre en otra jeringa de 20 mL. Agregue solución salina hasta un volumen total de 20 mL en ambas jeringas y conecte la segunda jeringa también a la llave de paso de 3 vías.
   PRECAUCIÓN: Utilice guantes y protección ocular cuando trabaje con ácido oleico.
2. Prepare norepinefrina para perfusión continua y para inyección en bolo (si la presión arterial media < 60 mmHg). Conecte la bomba de jeringa de norepinefrina a uno de los puertos del catéter venoso central sin ponerlo en marcha.
3. Continúe monitoreando la medición ultrarrápida de pO₂ que aún se está midiendo. FiO₂ sigue siendo 1.0.
4. Conecte la llave de paso de 3 vías al puerto proximal del PAC.
5. Mezcle bien el ácido oleico y la mezcla de sangre/solución salina cambiando repetidamente la solución de una jeringa a la otra y viceversa a través de la llave de paso de tres vías y siga mezclando todo el tiempo. Cuando se trate de una emulsión homogénea, inyectar 2 mL de la emulsión y seguir mezclando.
   NOTA: Si la mezcla se detiene, la emulsión puede separarse en una parte lipofílica y otra hidrofílica.
6. Vigile de cerca la hemodinámica después de la inyección de ácido oleico y tenga a mano la norepinefrina. Si es necesario, administre norepinefrina en forma de bolo o infusión continua para estabilizar la presión arterial (comparar con el paso 5.2).
   NOTA: Esté atento; Los animales pueden morir durante este procedimiento.
7. Repetir la inyección de 2 mL de la solución cada 3 min hasta que la relación PaO₂/FiO₂ esté por debajo de 150 mmHg.
8. Si la jeringa está vacía antes de que la relación PaO₂/FiO₂ esté entre 100 y 200 mmHg, prepare 2 jeringas más como se describe en el paso 5.1. Repita los pasos 5,5-5,8 hasta que la relación PaO₂/FiO₂ caiga entre 100 y 200 mmHg.
   NOTA: Por lo general, se requiere una jeringa de medio a completo del ácido oleico y la mezcla de sangre / solución salina.
9. Si la relación PaO₂/FiO₂ está entre 100 y 200 mmHg, espere 30 min y vuelva a comprobarlo. Si está constantemente por debajo de 200 mmHg, inicie el experimento/tratamiento; De lo contrario, prepare 2 jeringas más como se describe en el paso 5.1 y repita los pasos 5.5-5.9.
   NOTA: Después de la inducción de la lesión pulmonar como se describe, el deterioro de la función pulmonar puede permanecer estable o deteriorarse o incluso mejorar dentro de ciertos límites.

6. Fin del experimento y eutanasia

1. Inyecte 0,5 mg de fentanilo adicionalmente a la anestesia continua y espere 5 min. Inyecte 200 mg de propofol y 40 mmol de cloruro de potasio para matar al animal con anestesia profunda.

La relación_PaO2/_FiO2 disminuye tras el lavado broncoalveolar y la aplicación fraccionada de ácido oleico (Figura 1). Debido a que no está claro predecir el impacto del lavado broncoalveolar (p. ej., el impacto de la dosis fraccionada de ácido oleico) en la relación PaO₂/FiO₂, se recomienda controlar la relación PaO₂/FiO₂ mientras se induce la lesión pulmonar. La medición ultrarrápida...

El método descrito de doble golpe para causar una lesión pulmonar grave en cerdos es adecuado para estudiar diferentes opciones de tratamiento en el SDRA. El modelo de doble golpe imita dos elementos centrales del mecanismo patológico del SDRA: la pérdida de la unidad alveolar-capilar y la ruptura de la barrera endotelial⁷. Debido a los dos aciertos, es importante contar con un protocolo de estudio con valores objetivo predefinidos (por ejemplo, relación PaO<...

Todos los autores no revelan ningún conflicto de intereses financieros o de cualquier otro tipo.

Los autores quieren agradecer a Dagmar Dirvonskis por su excelente soporte técnico.