Lavaggio broncoalveolare e iniezione di acido oleico nei suini come modello a doppio colpo per la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS)

Esistono diversi e complessi modelli animali per studiare la fisiopatologia della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). Il lavaggio broncoalveolare e il danno polmonare indotto dall'iniezione di acido oleico sono adatti come nuovo modello animale a doppio colpo per lo studio della sindrome da distress respiratorio acuto.

Il trattamento dell'ARDS continua a rappresentare una grande sfida per i medici di terapia intensiva nel 21° secolo, con tassi di mortalità che raggiungono ancora il 50% nei casi più gravi. Sono necessari ulteriori sforzi di ricerca per comprendere meglio la complessa fisiopatologia di questa malattia. Esistono diversi modelli animali ben consolidati per indurre lesioni polmonari acute, ma nessuno è stato in grado di imitare adeguatamente i complessi meccanismi patologici dell'ARDS. Il fattore più cruciale per lo sviluppo di questa condizione è il danno all'unità capillare alveolare. La combinazione di due modelli di lesioni polmonari ben consolidati ci consente di imitare in modo più dettagliato il meccanismo patologico sottostante. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) porta alla deplezione del tensioattivo e al collasso alveolare. L'instillazione ripetuta di volumi di liquidi provoca successiva ipossiemia. La deplezione del tensioattivo è un fattore chiave dell'ARDS nell'uomo. Il BAL è spesso combinato con altri approcci di lesione polmonare, ma non ancora con un secondo colpo seguito da iniezione di acido oleico (OAI). L'iniezione di acido oleico porta a un grave alterato scambio gassoso, a un deterioramento della meccanica polmonare e alla rottura della barriera alveolo-capillare. L'OAI imita la maggior parte degli effetti attesi dell'ARDS, consistenti in un'infiammazione prolungata del tessuto polmonare con un aumento della perdita alveolare e della compromissione dello scambio gassoso. Uno svantaggio della combinazione di diversi modelli è la difficoltà di determinare l'influenza sulla lesione polmonare causata dal solo BAL, dall'OAI da solo o da entrambi insieme. Il modello presentato in questo rapporto rappresenta la combinazione di BAL e OAI come un nuovo modello di lesione polmonare a doppio colpo. Questo nuovo modello è facile da implementare e rappresenta un'alternativa per studiare in futuro diversi approcci terapeutici nell'ARDS.

La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è una malattia che consiste in un alterato scambio di gas e infiltrazione polmonare, che spesso necessita di terapia intensiva. La mortalità per ARDS grave rimane elevata (fino al 50%) in tutto il mondo, nonostante quasi 50 anni di ricerche approfondite¹. L'ARDS è definita dalla Definizione di Berlino, che include criteri diagnostici come la tempistica, l'imaging del torace, l'origine dell'edema e l'ipossiemia². Per classificare meglio i pazienti con diversi livelli di gravità dell'ARDS, vengono definiti tre diversi gradi di ipossiemia: lieve (200 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 300 mmHg), moderata (100 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 200 mmHg) e grave (PaO₂/FIO₂ ≤ 100 mmHg)². Diversi modelli animali con particolare attenzione al danno polmonare sono ampiamente utilizzati e accettati per esaminare i cambiamenti fisiopatologici e i diversi approcci terapeutici nell'ARDS³.

Sono noti modelli animali che utilizzano endotossine (ad esempio, infusione endovenosa di batteri, legatura cecale e puntura per imitare una lesione polmonare indotta da sepsi), modelli di ischemia/riperfusione, modelli ARDS fumo/ustione, infusione di acido oleico e modelli di lavaggio broncoalveolare³. Ogni modello rappresenta solo alcuni cambiamenti fisiopatologici con vantaggi e svantaggi per i risultati dello studio³. Questo non riflette la complessità della malattia ARDS. La combinazione di due modelli collaudati consente di trarre conclusioni migliori sulla fisiopatologia dell'ARDS. Nel modello presentato, abbiamo combinato il lavaggio broncoalveolare e l'infusione di acido oleico per imitare la complessità dell'ARDS umano. L'acido oleico è un acido grasso insaturo e agisce direttamente sull'unità alveolo-capillare dei polmoni innescando l'attivazione dei recettori immunitari innati causando successivamente l'accumulo di neutrofili, la produzione di citochine proinfiammatorie e la morte cellulare ^4,5. L'infusione di acido oleico induce grave ipossiemia, aumento della pressione arteriosa polmonare e accumulo di acqua polmonare extravascolare. Spesso si verificano ipotensione e depressione miocardica dovute a insufficienza ventricolare destra. L'induzione del danno polmonare mediante lavaggio broncoalveolare ripetuto (BAL) con soluzione elettrolitica bilanciata riduce la concentrazione lipidica del tensioattivo alveolare³. I tensioattivi diminuiscono la tensione superficiale alveolare e prevengono il collasso alveolare. Il BAL provoca ipossiemia immediata e un aumento della differenza di ossigeno alveolo-arteriosa³. L'ARDS umana è anche associata alla deplezione del tensioattivo³. Gli svantaggi di questo modello combinato sono la necessità di accesso venoso centrale, intubazione e anestesia generale. Inoltre, la discutibile rilevanza meccanicistica (ad esempio, l'infusione di acido oleico) per gli aspetti traduzionali rimane poco chiara. Almeno, è difficile determinare quale parte della lesione polmonare (BAL vs. OAI, o entrambi insieme) contribuisca al danno polmonare. I vantaggi di questo modello sono la sua utilizzabilità in animali di grandi dimensioni con monitoraggio familiare e strumentazione simile a quella dei pazienti umani (non sono necessarie attrezzature speciali), la buona riproduzione dei principali aspetti dell'ARDS e la possibilità di studiare l'ARDS isolata senza infiammazione sistemica (ad esempio, modelli di endotossine). Nel seguente articolo, forniamo una descrizione dettagliata del danno polmonare a doppio colpo (BAL e OAI) nei suini e forniamo dati rappresentativi per caratterizzare la stabilità delle compromissioni nella funzione polmonare.

Tutti gli esperimenti sugli animali qui descritti sono stati approvati dal comitato istituzionale e statale per la cura degli animali (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Coblenza, Germania; numero di approvazione G18-1-044) e sono stati condotti in conformità con le linee guida della Società Europea e Tedesca di Scienze degli Animali da Laboratorio.

1. Anestesia, intubazione e ventilazione meccanica

1. Trattenere il cibo per 6 ore prima dell'anestesia per ridurre il rischio di aspirazione, ma consentire il libero accesso all'acqua per ridurre lo stress.
2. Iniettare una combinazione di ketamina (4 mg∙^kg-1) e azaperone (8 mg∙^kg-1) per via intramuscolare per sedazione mentre l'animale è nel box dell'animale.
3. Stabilire una linea venosa con un catetere venoso periferico comune (20 G) in una vena auricolare dopo la disinfezione locale con alcol.
4. Inizia a monitorare la saturazione periferica di ossigeno (SpO₂) agganciando il sensore a una delle orecchie o alla coda dell'animale.
5. Iniettare fentanil (4 μg∙^kg-1), propofol (3 mg∙^kg-1) e atracurio (0,5 mg∙^kg-1) per l'induzione dell'anestesia.
6. Posizionare il maiale in posizione supina sulla barella.
7. Ventilare il maiale con una maschera adatta ad animali con una pressione inspiratoria di picco inferiore a 20 cmH₂O, una PEEP di 5 cmH₂O, una frequenza di 14-16 /min e una FiO₂ di 1,0.
8. Iniziare un'infusione continua con una soluzione elettrolitica bilanciata (5 mL∙^kg-1∙^h-1), propofol (8-12 mg∙^kg-1∙^h-1) e fentanil (0,1-0,2 mg∙^kg-1∙^h-1) per mantenere l'anestesia.
9. Per l'intubazione, utilizzare un comune tubo endotracheale adatto all'animale (ad esempio, peso di 25-30 kg, tubo endotracheale ID 6-7) armato con introduttore di tubo endotracheale e un comune laringoscopio con Macintosh Blade 4. Sono necessarie due persone.
   1. Persona 1: Estrarre la lingua con una mano e premere il muso verso il basso con l'altra.
   2. Persona 2: Inserire il laringoscopio e farlo avanzare come al solito fino a visualizzare l'epiglottide.
10. Tirare il laringoscopio verso l'alto per visualizzare le corde vocali. A volte l'epiglottide si "attacca" al palatino molle. In tal caso, mobilizzarlo con la punta del tubo.
11. Inserire il tubo attraverso le corde vocali ed estrarre l'introduttore.
12. Blocca il palloncino del tubo.
13. Collegare il tubo al ventilatore e verificare il corretto posizionamento con capnografia e auscultazione.
14. Avviare la ventilazione meccanica (volume corrente 6-8 mL/kg, PEEP 5 cmH₂O, FiO₂ 0,4, frequenza per mantenere l'etCO₂ tra 35 e 45 mmHg).

2. Strumentazione

1. Ritrarre le zampe posteriori con bende per cateterizzare i vasi necessari. Sono necessari una linea arteriosa, una guaina introduttrice arteriosa, una linea venosa centrale e una guaina introduttrice venosa per il posizionamento del catetere arterioso polmonare.
2. Disinfettare generosamente la zona femorale con disinfezione alcolica. A seconda degli esami previsti, viene utilizzato un approccio più o meno asettico.
3. Preparare i cateteri sciacquandoli con soluzione fisiologica.
4. Posizionare la sonda ecografica sul legamento inguinale ed eseguire la scansione dei vasi femorali.
5. Ruotare la sonda di 90° per visualizzare completamente l'arteria femorale sull'asse lungo. Se necessario, è anche possibile in diverse circostanze utilizzare la vista dell'asse corto per visualizzare completamente l'arteria femorale.
6. Incannulare l'arteria femorale sotto visualizzazione ecografica in linea con l'ago dell'introduttore impostato nella tecnica di Seldinger. Quando il sangue pulsante fuoriesce, introdurre il filo guida e ritrarre l'ago.
7. Visualizzare la vena femorale e incannulare la vena sotto la visualizzazione ecografica in linea e l'aspirazione continua con l'ago del set introduttore. Quando il sangue venoso è aspirabile, scollegare la siringa e inserire il filo guida. Ritrarre l'ago.
8. Controllare la posizione dei fili con gli ultrasuoni.
9. Inserire la linea arteriosa e venosa sui fili guida posizionati.
10. Ripetere la punteggiatura arteriosa e venosa sull'altro lato e inserire le guaine dell'introduttore secondo la tecnica di Seldinger come descritto sopra.
11. Collegare la linea arteriosa e la linea venosa a un trasduttore.
12. Posizionare entrambi i trasduttori all'altezza del cuore e aprire i rubinetti a tre vie di entrambi i trasduttori verso l'atmosfera per calibrare il sistema a zero.
    NOTA: È necessario evitare bolle d'aria e macchie di sangue nel sistema per generare valori plausibili.
13. Passare l'infusione di propofol e fentanil a una delle porte della linea venosa centrale.
14. Calibrare la sonda per misurazioni ultraveloci di pO₂ e inserirla attraverso la guaina dell'introduttore arterioso.
    NOTA: La misurazione del pO₂ con la sonda per la misurazione ultraveloce del pO₂ non è obbligatoria, ma aiuta a visualizzare le variazioni in tempo reale del pO₂.

3. Inserimento del catetere arterioso polmonare

1. Controllare che il palloncino del catetere arterioso polmonare (PAC) non sia danneggiato.
2. Collegare al trasduttore e calibrarlo.
3. Inserire il PAC attraverso la guaina dell'introduttore (palloncino sgonfio).
4. Quando il PAC è passato attraverso la guaina introduttrice (15-20 cm), gonfiare il palloncino.
5. Far avanzare il PAC e monitorare le forme d'onda tipiche (vasi venosi, atrio destro, ventricolo destro, arteria polmonare, pressione di incuneamento capillare polmonare). Sgonfiare il palloncino e controllare se il sangue può essere aspirato attraverso tutte le porte del PAC.

4. Induzione del danno polmonare: primo colpo da lavaggio broncoalveolare

1. Preparare una soluzione elettrolitica bilanciata sterile (ad es. Sterofundin) riscaldata a 40 °C.
   NOTA: Per evitare l'inquinamento polmonare, viene utilizzata una soluzione elettrolitica bilanciata sterile.
2. Cambiare il FiO₂ da 0,4 a 1,0 in 10 minuti prima di eseguire il lavaggio broncoalveolare.
3. Avviare la misurazione ultraveloce di pO₂.
4. Preparare la noradrenalina per l'infusione continua e per l'iniezione in bolo (se la pressione arteriosa media < 60 mmHg). Collegare la pompa a siringa per noradrenalina a una delle porte del catetere venoso centrale senza avviarlo.
5. Riempire 30 mL∙^kg-1 dalla soluzione elettrolitica bilanciata sterile riscaldata in un imbuto. Verificare che l'imbuto possa essere collegato al tubo endotracheale.
6. Scollegare il tubo senza perdita di PEEP durante l'inspirazione del ventilatore.
7. Collegare l'imbuto al tubo endotracheale.
8. Sollevare manualmente l'imbuto di 1 m sopra l'animale.
9. Aprire il tappo e instillare l'intera quantità della soluzione elettrolitica bilanciata riscaldata dall'imbuto nel tubo endotracheale per 30 s utilizzando la pressione idrostatica.
10. Dopo 30 s, rimuovere la soluzione infusa abbassando l'imbuto 1 metro sotto l'animale e scaricare il liquido di lavaggio passivamente. Ricollegare l'animale al ventilatore per l'ossigenazione.
11. Raccogliere il liquido di lavaggio rimosso e annotare la quantità. È necessario per calcolare la clearance del liquido alveolare.
    NOTA: Non riutilizzare la soluzione elettrolitica bilanciata dopo un lavaggio per massimizzare il lavaggio del tensioattivo.
12. Aspirare i resti della soluzione nel tubo utilizzando cateteri di aspirazione.
13. Monitorare attentamente l'emodinamica dopo il lavaggio broncoalveolare e tenere a portata di mano la noradrenalina. Se necessario, somministrare noradrenalina in bolo o in infusione continua per stabilizzare la pressione sanguigna (confrontare con il passaggio 4.4).
14. Ripetere l'infusione di 30 mL∙^kg-1 di soluzione elettrolitica bilanciata come descritto nei passaggi 4.5-4.13 fino a quando il rapporto PaO₂/FiO₂ è inferiore a 250 mmHg. Possono essere necessarie da quattro a cinque ripetizioni del lavaggio broncoalveolare.
15. Se il rapporto PaO₂/FiO₂ è inferiore a 250 mmHg, iniziare con l'induzione del danno polmonare mediante iniezione di acido oleico. Non modificare le impostazioni del ventilatore durante questa procedura.

5. Induzione di danno polmonare: secondo colpo mediante iniezione di acido oleico

1. Preparare la soluzione di acido oleico: 0,1 mL∙^kg-1 di acido oleico in una siringa da 20 mL e collegarla a un rubinetto a 3 vie. Prelevare 2 mL di sangue in un'altra siringa da 20 mL. Aggiungere soluzione fisiologica a un volume totale di 20 mL in entrambe le siringhe e collegare la seconda siringa anche al rubinetto a 3 vie.
   ATTENZIONE: Utilizzare guanti e protezione per gli occhi quando si lavora con l'acido oleico.
2. Preparare la noradrenalina per l'infusione continua e per l'iniezione in bolo (se la pressione arteriosa media < 60 mmHg). Collegare la pompa a siringa per noradrenalina a una delle porte del catetere venoso centrale senza avviarlo.
3. Continuare a monitorare la misurazione ultraveloce di pO₂ che sta ancora misurando. FiO₂ è ancora 1.0.
4. Collegare il rubinetto a 3 vie alla porta prossimale del PAC.
5. Miscelare accuratamente l'acido oleico e la miscela di sangue/soluzione salina spostando ripetutamente la soluzione da una siringa all'altra e viceversa tramite il rubinetto a tre vie e continuare a mescolare continuamente. Quando si tratta di un'emulsione omogenea, iniettare 2 mL di emulsione e continuare a mescolare.
   NOTA: Se la miscelazione si interrompe, l'emulsione può separarsi in una parte lipofila e una idrofila.
6. Monitorare attentamente l'emodinamica dopo l'iniezione di acido oleico e tenere a portata di mano la noradrenalina. Se necessario, somministrare noradrenalina in bolo o in infusione continua per stabilizzare la pressione sanguigna (confrontare con il passaggio 5.2).
   NOTA: Sii vigile; Gli animali possono morire durante questa procedura.
7. Ripetere l'iniezione di 2 mL di soluzione ogni 3 minuti fino a quando il rapporto PaO₂/FiO₂ è inferiore a 150 mmHg.
8. Se la siringa è vuota prima che il rapporto PaO₂/FiO₂ sia compreso tra 100 e 200 mmHg, preparare altre 2 siringhe come descritto al punto 5.1. Ripetere i passaggi 5,5-5,8 fino a quando il rapporto PaO₂/FiO₂ non scende tra 100 e 200 mmHg.
   NOTA: Di solito è necessaria una siringa da mezza a piena di acido oleico e la miscela di sangue e soluzione salina.
9. Se il rapporto PaO₂/FiO₂ è compreso tra 100 e 200 mmHg, attendere 30 minuti e ricontrollare. Se è costantemente inferiore a 200 mmHg, iniziare l'esperimento/trattamento; In caso contrario, preparare altre 2 siringhe come descritto al punto 5.1 e ripetere i passaggi 5.5-5.9.
   NOTA: Dopo l'induzione del danno polmonare come descritto, la compromissione della funzione polmonare può rimanere stabile o deteriorarsi o addirittura migliorare entro certi limiti.

6. Fine dell'esperimento ed eutanasia

1. Iniettare 0,5 mg di fentanil in aggiunta all'anestesia continua e attendere 5 minuti. Iniettare 200 mg di propofol e 40 mmol di cloruro di potassio per uccidere l'animale in anestesia profonda.

Il rapporto PaO₂/FiO₂ diminuisce dopo il lavaggio broncoalveolare e l'applicazione frazionata di acido oleico (Figura 1). Poiché non è chiaro prevedere l'impatto del lavaggio broncoalveolare (ad esempio, l'impatto della dose frazionata di acido oleico) sul rapporto PaO₂/FiO₂, si raccomanda di monitorare il rapporto PaO₂/FiO₂ mentre induce il danno polmonare. La misurazione ultraveloce del pO...

Il metodo a doppio colpo descritto per causare una grave lesione polmonare nei suini è adatto per studiare diverse opzioni di trattamento nell'ARDS. Il modello a doppio colpo imita due elementi centrali del meccanismo patologico dell'ARDS: la perdita dell'unità alveolo-capillare e la rottura della barriera endoteliale⁷. A causa dei due risultati, è importante disporre di un protocollo di studio con valori target predefiniti (ad esempio, rapporto PaO₂...

Tutti gli autori non rivelano alcun conflitto di interessi finanziario o di altro tipo.

Gli autori ringraziano Dagmar Dirvonskis per l'eccellente supporto tecnico.