Lavagem broncoalveolar e injeção de ácido oleico em suínos como modelo de duplo acerto para síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA)

Existem modelos animais diferentes e complexos para estudar a fisiopatologia da síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). A lavagem broncoalveolar e a lesão pulmonar induzida por injeção de ácido oleico são adequadas como um novo modelo animal de duplo golpe para estudar a síndrome do desconforto respiratório agudo.

O tratamento da SDRA continua a representar grandes desafios para os médicos intensistas no século 21, com taxas de mortalidade ainda chegando a 50% em casos graves. Mais esforços de pesquisa são necessários para entender melhor a complexa fisiopatologia desta doença. Existem diferentes modelos animais bem estabelecidos para induzir lesão pulmonar aguda, mas nenhum foi capaz de mimetizar adequadamente os complexos mecanismos patológicos da SDRA. O fator mais crucial para o desenvolvimento dessa condição é o dano à unidade capilar alveolar. A combinação de dois modelos de lesão pulmonar bem estabelecidos nos permite mimetizar com mais detalhes o mecanismo patológico subjacente. A lavagem broncoalveolar (LBA) leva à depleção do surfactante, bem como ao colapso alveolar. A instilação repetida de volumes de fluido causa hipoxemia subsequente. A depleção de surfactante é um fator chave da SDRA em humanos. A LBA é frequentemente combinada com outras abordagens de lesão pulmonar, mas ainda não com um segundo golpe seguido de injeção de ácido oleico (OAI). A injeção de ácido oleico leva a trocas gasosas gravemente prejudicadas, deterioração da mecânica pulmonar e ruptura da barreira alvéolo-capilar. A OAI imita a maioria dos efeitos esperados da SDRA, consistindo em inflamação prolongada do tecido pulmonar com aumento do vazamento alveolar e comprometimento das trocas gasosas. Uma desvantagem da combinação de diferentes modelos é a dificuldade de determinar a influência na lesão pulmonar causada apenas pelo LBA, OAI isolado ou ambos juntos. O modelo apresentado neste relatório representa a combinação de LBA e OAI como um novo modelo de lesão pulmonar de duplo impacto. Este novo modelo é fácil de implementar e uma alternativa para estudar diferentes abordagens terapêuticas na SDRA no futuro.

A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma doença que consiste em troca gasosa prejudicada e infiltração pulmonar, que muitas vezes necessita de terapia intensiva. A mortalidade da SDRA grave permanece alta (até 50%) em todo o mundo, apesar de quase 50 anos de extensa pesquisa¹. A SDRA é definida pela Definição de Berlim, incluindo critérios diagnósticos como tempo, imagem do tórax, origem do edema e hipoxemia². Para melhor categorizar os pacientes com diferentes níveis de gravidade da SDRA, são definidos três diferentes graus de hipoxemia: leve (200 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 300 mmHg), moderada (100 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 200 mmHg) e grave (PaO₂/FIO₂ ≤ 100 mmHg)². Diferentes modelos animais com foco na lesão pulmonar são amplamente utilizados e aceitos para examinar as alterações fisiopatológicas e diferentes abordagens terapêuticas na SDRA³.

Modelos animais usando endotoxinas (por exemplo, infusão intravenosa de bactérias, ligadura cecal e punção para mimetizar uma lesão pulmonar induzida por sepse), modelos de isquemia/reperfusão, modelos de SDRA de fumaça/queimadura, infusão de ácido oleico e modelos de lavagem broncoalveolar^{são conhecidos 3}. Cada modelo representa apenas algumas alterações fisiopatológicas com vantagens e desvantagens para os resultados do estudo³. Isso não reflete a complexidade da doença da SDRA. A combinação de dois modelos comprovados permite melhores conclusões sobre a fisiopatologia da SDRA. No modelo apresentado, combinamos lavagem broncoalveolar e infusão de ácido oleico para mimetizar a complexidade da SDRA humana. O ácido oleico é um ácido graxo insaturado e atua diretamente na unidade alvéolo-capilar dos pulmões, desencadeando a ativação de receptores imunes inatos, causando acúmulo de neutrófilos, produção de citocinas pró-inflamatórias e morte celular ^4,5. A infusão de ácido oleico induz hipoxemia grave, aumento da pressão arterial pulmonar e acúmulo de água pulmonar extravascular. Freqüentemente, ocorrem hipotensão e depressão miocárdica devido à insuficiência ventricular direita. A indução de lesão pulmonar por lavagem broncoalveolar repetida (LBA) com solução eletrolítica balanceada reduz a concentração lipídica do surfactante alveolar³. Os surfactantes diminuem a tensão superficial alveolar e evitam o colapso alveolar. O LBA causa hipoxemia imediata e aumento da diferença alvéolo-arterial de oxigênio³. A SDRA humana também está associada à depleção do surfactante³. As desvantagens desse modelo combinado são a necessidade de acesso venoso central, intubação e anestesia geral. Além disso, a relevância mecanicista questionável (por exemplo, a infusão de ácido oleico) para aspectos translacionais permanece obscura. Pelo menos, é difícil determinar qual parte da lesão pulmonar (LBA vs. OAI, ou ambas juntas) contribui para o dano pulmonar. As vantagens deste modelo são sua usabilidade em animais de grande porte com monitoramento familiar e instrumentação semelhante a pacientes humanos (sem necessidade de equipamento especial), a boa reprodução dos principais aspectos da SDRA e a possibilidade de estudar SDRA isolada sem inflamação sistêmica (por exemplo, modelos de endotoxinas). No artigo a seguir, damos uma descrição detalhada da lesão pulmonar de duplo golpe (LBA e OAI) em suínos e fornecemos dados representativos para caracterizar a estabilidade dos comprometimentos na função pulmonar.

Todos os experimentos com animais descritos aqui foram aprovados pelo comitê institucional e estadual de cuidados com animais (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Alemanha; número de aprovação G18-1-044) e foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Sociedade Europeia e Alemã de Ciências de Animais de Laboratório.

1. Anestesia, intubação e ventilação mecânica

1. Retenha os alimentos por 6 horas antes da anestesia para reduzir o risco de aspiração, mas permita o livre acesso à água para reduzir o estresse.
2. Injete uma combinação de cetamina (4 mg∙^kg-1) e azaperona (8 mg∙^kg-1) por via intramuscular para sedação enquanto o animal estiver na caixa de animais.
3. Estabeleça uma linha venosa com um cateter venoso periférico comum (20 G) em uma veia da orelha após a desinfecção local com álcool.
4. Comece a monitorar a saturação periférica de oxigênio (SpO₂) prendendo o sensor em uma das orelhas ou na cauda do animal.
5. Injete fentanil (4 μg∙^kg-1), propofol (3 mg∙^kg-1) e atracúrio (0,5 mg∙^kg-1) para indução anestésica.
6. Coloque o porco em decúbito dorsal na maca.
7. Ventile o porco com uma máscara adequada para animais com pico de pressão inspiratória abaixo de 20 cmH₂O, PEEP de 5 cmH₂O, frequência de 14-16 /min e FiO₂ de 1,0.
8. Inicie uma infusão contínua com solução eletrolítica balanceada (5 mL∙^kg-1∙^h-1), propofol (8-12 mg∙^kg-1∙^h-1) e fentanil (0,1-0,2 mg∙^kg-1∙^h-1) para manter a anestesia.
9. Para a intubação, use um tubo endotraqueal comum adequado para o animal (por exemplo, peso de 25-30 kg, tubo endotraqueal ID 6-7) armado com introdutor de tubo endotraqueal e um laringoscópio comum com uma lâmina Macintosh 4. Duas pessoas são necessárias.
   1. Pessoa 1: Puxe a língua para fora com uma mão e pressione o focinho para baixo com a outra.
   2. Pessoa 2: Insira o laringoscópio e avance-o como de costume até que a epiglote possa ser visualizada.
10. Puxe o laringoscópio para cima para visualizar as cordas vocais. Às vezes, a epiglote "gruda" no palatino mole. Em caso afirmativo, mobilize-o com a ponta do tubo.
11. Insira o tubo através das cordas vocais e puxe o introdutor.
12. Bloqueie o balão do tubo.
13. Conecte o tubo ao ventilador e verifique o posicionamento correto com capnografia e ausculta.
14. Inicie a ventilação mecânica (volume corrente 6-8 mL/kg, PEEP 5 cmH₂O, FiO₂ 0,4, frequência para manter etCO₂ entre 35 – 45 mmHg).

2. Instrumentação

1. Retraia as patas traseiras com bandagens para cateterizar os vasos necessários. São necessários um cateter arterial, uma bainha introdutora arterial, um cateter venoso central e uma bainha introdutora venosa para a colocação do cateter de artéria pulmonar.
2. Desinfete generosamente a área femoral com desinfecção alcoólica. Dependendo dos exames planejados, uma abordagem mais ou menos asséptica é usada.
3. Prepare os cateteres lavando-os com solução salina.
4. Coloque a sonda de ultrassom no ligamento inguinal e escaneie os vasos femorais.
5. Gire a sonda 90° para visualizar totalmente a artéria femoral no eixo longo. Se necessário, também é possível, em diferentes circunstâncias, usar a visão de eixo curto para visualizar completamente a artéria femoral.
6. Canular a artéria femoral sob visualização ultrassonográfica em linha com a agulha do introdutor ajustada na técnica de Seldinger. Quando o sangue brilhante pulsante fluir, introduza o fio-guia e retraia a agulha.
7. Visualize a veia femoral e canule a veia sob visualização de ultrassom em linha e aspiração contínua com a agulha do conjunto introdutor. Quando o sangue venoso for aspirável, desconecte a seringa e insira o fio-guia. Retraia a agulha.
8. Verifique a posição dos fios com ultrassom.
9. Insira a linha arterial e venosa sobre os fios-guia colocados.
10. Repita a pontuação arterial e venosa do outro lado e insira as bainhas introdutoras de acordo com a técnica de Seldinger, conforme descrito acima.
11. Conecte a linha arterial e a linha venosa a um transdutor.
12. Posicione ambos os transdutores no nível do coração e abra as torneiras de três vias de ambos os transdutores para a atmosfera para calibrar o sistema para zero.
    NOTA: É necessário evitar bolhas de ar e manchas de sangue no sistema para gerar valores plausíveis.
13. Mude a infusão de propofol e fentanil para uma das portas da linha venosa central.
14. Calibre a sonda para medições ultrarrápidas de pO₂ e insira-a através da bainha do introdutor arterial.
    NOTA: A medição de pO₂ com a sonda para medição ultrarrápida de pO₂ não é obrigatória, mas ajuda a visualizar as mudanças em tempo real em pO₂.

3. Inserção do cateter de artéria pulmonar

1. Verifique se o balão do cateter de artéria pulmonar (CAP) está danificado.
2. Conecte ao transdutor e calibre-o.
3. Insira o CAP através da bainha introdutora (balão desinflado).
4. Quando o CAP tiver passado pela bainha introdutora (15-20 cm), encha o balão.
5. Avance o CAP e monitore as formas de onda típicas (vasos venosos, átrio direito, ventrículo direito, artéria pulmonar, pressão capilar pulmonar). Esvazie o balão e verifique se o sangue pode ser aspirado por todas as portas do CAP.

4. Indução de lesão pulmonar: primeiro golpe por lavagem broncoalveolar

1. Prepare uma solução eletrolítica balanceada estéril (por exemplo, esterofundina) aquecida a 40 °C.
   NOTA: A solução eletrolítica balanceada estéril é usada para evitar a poluição pulmonar.
2. Altere o FiO₂ de 0,4 para 1,0 ao longo de 10 minutos antes de realizar a lavagem broncoalveolar.
3. Inicie a medição ultrarrápida pO₂.
4. Prepare a norepinefrina para infusão contínua e para injeção em bolus (se a pressão arterial média < 60 mmHg). Conecte a bomba de seringa de norepinefrina a uma das portas do cateter venoso central sem iniciá-la.
5. Encha 30 mL∙^kg-1 da solução eletrolítica balanceada estéril aquecida em um funil. Verifique se o funil pode ser conectado ao tubo endotraqueal.
6. Desconecte o tubo sem perda de PEEP na inspiração do ventilador.
7. Conecte o funil ao tubo endotraqueal.
8. Levante o funil 1 m acima do animal manualmente.
9. Abra a tampa e instile toda a quantidade da solução eletrolítica balanceada aquecida do funil no tubo endotraqueal por 30 s usando a pressão hidrostática.
10. Após 30 s, remova a solução infundida abaixando o funil 1 metro abaixo do animal e drene o fluido de lavagem passivamente. Reconecte o animal ao ventilador para oxigenação.
11. Colete o fluido de lavagem removido e anote a quantidade. É necessário calcular a depuração do líquido alveolar.
    NOTA: Não reutilize a solução eletrolítica balanceada após uma lavagem para maximizar a lavagem do surfactante.
12. Aspirar os restos da solução no tubo utilizando cateteres de sucção.
13. Monitore de perto a hemodinâmica após a lavagem broncoalveolar e mantenha a norepinefrina à mão. Se necessário, administre norepinefrina em bolus ou infusão contínua para estabilizar a pressão arterial (compare com a etapa 4.4).
14. Repita a infusão de 30 mL∙^kg-1 de solução eletrolítica balanceada conforme descrito nas etapas 4.5-4.13 até que a relação PaO₂/FiO₂ esteja abaixo de 250 mmHg. Podem ser necessárias quatro a cinco repetições da lavagem broncoalveolar.
15. Se a relação PaO₂/FiO₂ for inferior a 250 mmHg, comece com a indução de lesão pulmonar por injeção de ácido oleico. Não altere as configurações do ventilador durante este procedimento.

5. Indução de lesão pulmonar: segundo golpe por injeção de ácido oleico

1. Prepare a solução de ácido oleico: 0,1 mL∙^kg-1 de ácido oleico em uma seringa de 20 mL e conecte-a a uma torneira de 3 vias. Tome 2 mL de sangue em outra seringa de 20 mL. Adicione solução salina a um volume total de 20 mL em ambas as seringas e conecte a segunda seringa também à torneira de 3 vias.
   CUIDADO: Use luvas e proteção para os olhos ao trabalhar com ácido oleico.
2. Prepare a norepinefrina para infusão contínua e para injeção em bolus (se a pressão arterial média < 60 mmHg). Conecte a bomba de seringa de norepinefrina a uma das portas do cateter venoso central sem iniciá-la.
3. Continue monitorando a medição ultrarrápida de pO₂ que ainda está medindo. FiO₂ ainda é 1.0.
4. Conecte a torneira de 3 vias à porta proximal do PAC.
5. Misturar bem o ácido oleico e a mistura sangue/solução salina deslocando repetidamente a solução de uma seringa para a outra seringa e vice-versa através da torneira de três vias e continuar a misturar sempre. Quando for uma emulsão homogênea, injete 2 mL da emulsão e continue misturando.
   NOTA: Se a mistura parar, a emulsão pode se separar em uma parte lipofílica e uma hidrofílica.
6. Monitore de perto a hemodinâmica após a injeção de ácido oleico e mantenha a norepinefrina à mão. Se necessário, administre norepinefrina em bolus ou infusão contínua para estabilizar a pressão arterial (compare com o passo 5.2).
   NOTA: Esteja vigilante; Os animais podem morrer durante este procedimento.
7. Repita a injeção de 2 mL da solução a cada 3 minutos até que a relação PaO₂/FiO₂ esteja abaixo de 150 mmHg.
8. Se a seringa estiver vazia antes de a relação PaO₂/FiO₂ estar entre 100 e 200 mmHg, prepare mais 2 seringas conforme descrito no passo 5.1. Repita as etapas 5.5-5.8 até que a relação PaO₂/FiO₂ caia entre 100 e 200 mmHg.
   NOTA: Geralmente é necessária uma seringa meio cheia de ácido oleico e a mistura sangue/solução salina.
9. Se a relação PaO₂/FiO₂ estiver entre 100 e 200 mmHg, aguarde 30 min e verifique novamente. Se estiver consistentemente abaixo de 200 mmHg, inicie o experimento/tratamento; caso contrário, prepare mais 2 seringas conforme descrito na etapa 5.1 e repita as etapas 5.5-5.9.
   NOTA: Após a indução da lesão pulmonar conforme descrito, o comprometimento da função pulmonar pode permanecer estável ou deteriorar-se ou até melhorar dentro de certos limites.

6. Fim do experimento e eutanásia

1. Injete 0,5 mg de fentanil adicionalmente à anestesia contínua e aguarde 5 min. Injete 200 mg de propofol e 40 mmol de cloreto de potássio para matar o animal em anestesia profunda.

A relação PaO₂/FiO₂ diminui após lavagem broncoalveolar e aplicação fracionada de ácido oleico (Figura 1). Como não é claro prever o impacto da lavagem broncoalveolar (por exemplo, o impacto da dose fracionada de ácido oleico) na relação PaO₂/FiO₂, recomenda-se monitorar a relação PaO₂/FiO₂ durante a indução da lesão pulmonar. A medição ultrarrápida de pO₂ permite...

O método de duplo golpe descrito para causar uma lesão pulmonar grave em porcos é adequado para estudar diferentes opções de tratamento na SDRA. O modelo de duplo acerto mimetiza dois elementos centrais do mecanismo patológico da SDRA: perda da unidade alvéolo-capilar e ruptura da barreira endotelial⁷. Devido aos dois acertos, é importante ter um protocolo de estudo com valores-alvo predefinidos (por exemplo, relação PaO₂/FiO₂).

Todos os autores não divulgam nenhum conflito de interesse financeiro ou qualquer outro conflito.

Os autores querem agradecer a Dagmar Dirvonskis pelo excelente suporte técnico.