猪支气管肺泡灌洗和油酸注射作为急性呼吸窘迫综合征 （ARDS） 的双重打击模型

存在不同的复杂动物模型来研究急性呼吸窘迫综合征 （ARDS） 的病理生理学。支气管肺泡灌洗和油酸注射诱导的肺损伤适合作为研究急性呼吸窘迫综合征的新型双打击动物模型。

在 21 世纪，ARDS 的治疗继续对重症监护医生构成重大挑战，严重病例的死亡率仍高达 50%。需要进一步的研究工作来更好地了解这种疾病的复杂病理生理学。有不同的成熟动物模型可以诱导急性肺损伤，但没有一个能够充分模拟 ARDS 的复杂病理机制。这种情况发展的最关键因素是对肺泡毛细血管单位的损害。两种成熟的肺损伤模型的结合使我们能够更详细地模拟潜在的发病机制。支气管肺泡灌洗液 （BAL） 导致表面活性剂耗竭和肺泡塌陷。反复滴注液体量会导致随后的低氧血症。表面活性剂消耗是人类 ARDS 的一个关键因素。BAL 通常与其他肺损伤方法结合使用，但尚未与第二次打击后进行油酸注射 （OAI） 相结合。油酸注射导致气体交换严重受损、肺力学恶化和肺泡毛细血管屏障破坏。OAI 模拟了 ARDS 的大部分预期效果，包括肺组织炎症延长、肺泡渗漏和气体交换障碍增加。不同模型组合的一个缺点是难以确定单独使用 BAL、单独使用 OAI 或两者一起对肺损伤的影响。本报告中介绍的模型代表了 BAL 和 OAI 的组合作为一种新的双重打击肺损伤模型。这种新模型易于实施，是未来研究 ARDS 不同治疗方法的替代方案。

急性呼吸窘迫综合征 （ARDS） 是一种由气体交换受损和肺浸润组成的疾病，通常需要重症监护治疗。尽管进行了近 50 年的广泛研究，但全球严重 ARDS 的死亡率仍然很高（高达 50%）¹。ARDS 由柏林定义定义，包括诊断标准为时间、胸部影像学、水肿和低氧血症的来源²。为了更好地对具有不同严重程度的 ARDS 患者进行分类，定义了三种不同程度的低氧血症：轻度（200 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 300 mmHg）、中度（100 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 200 mmHg）和重度（PaO₂/FIO₂ ≤ 100 mmHg）²。以肺损伤为重点的不同动物模型被广泛使用和接受，以检查 ARDS³ 的病理生理变化和不同的治疗方法。

使用内毒素的动物模型（例如，静脉输注细菌、盲肠结扎和穿刺以模拟败血症引起的肺损伤）、缺血/再灌注模型、烟雾/烧伤 ARDS 模型、油酸输注和支气管肺泡灌洗模型是已知的³.每个模型仅代表少数病理生理变化，对研究结果有优点和缺点³.这并不能反映 ARDS 疾病的复杂性。两种经过验证的模型相结合，可以更好地得出关于 ARDS 病理生理学的结论。在所提出的模型中，我们将支气管肺泡灌洗和油酸输注相结合，以模拟人类 ARDS 的复杂性。油酸是一种不饱和脂肪酸，通过触发先天免疫受体的激活直接作用于肺的肺泡毛细血管单位，随后导致中性粒细胞积累、促炎细胞因子产生和细胞死亡 ^4,5。油酸输注会诱发严重的低氧血症、肺动脉压升高和血管外肺水的积累。右心室衰竭引起的低血压和心肌抑制常发生。用平衡电解质溶液重复支气管肺泡灌洗 （BAL） 诱导肺损伤可降低肺泡表面活性剂脂质浓度³。表面活性剂可降低肺泡表面张力并防止肺泡塌陷。BAL 导致速效性低氧血症和肺泡-动脉氧差增加³。人 ARDS 也与表面活性剂³ 的消耗有关。这种组合模型的缺点是需要中心静脉通路、插管和全身麻醉。此外，与转化方面的机制相关性 （例如，油酸输注） 仍不清楚。至少，很难确定肺损伤的哪一部分（BAL 与 OAI，或两者一起）导致肺损伤。该模型的优点是它在大型动物中的可用性，具有类似于人类患者的熟悉监测和仪器（不需要特殊设备），ARDS 主要方面的良好再现以及研究孤立性 ARDS 而没有全身炎症的可能性（例如，内毒素模型）。在下面的文章中，我们详细描述了猪的双重打击 （BAL 和 OAI） 肺损伤，并提供了具有代表性的数据来表征肺功能损害的稳定性。

此处描述的所有动物实验均已获得机构和国家动物护理委员会（Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz， Koblenz， Germany;批准号 G18-1-044）的批准，并按照欧洲和德国实验动物科学学会的指导方针进行。

1. 麻醉、插管和机械通气

1. 麻醉前禁食 6 小时以降低误吸风险，但允许自由饮水以减轻压力。
2. 当动物在动物箱中时，肌肉注射氯胺酮 （4 mg∙^kg-1） 和氮杂哌酮 （8 mg∙^kg-1） 的组合以进行镇静。
3. 用酒精局部消毒后，用通用外周静脉导管 （20 G） 在耳静脉中建立静脉管。
4. 通过将传感器夹在动物的一只耳朵或尾巴上，开始监测外周血氧饱和度 （SpO₂）。
5. 注射芬太尼 （4 μg∙^kg-1）、异丙酚 （3 mg∙^kg-1） 和阿曲库铵 （0.5 mg∙^kg-1） 用于麻醉诱导。
6. 将猪仰卧在担架上。
7. 用适合吸气峰值压力低于 20 cmH₂O、PEEP 为 5 cmH₂O、频率为 14-16 /min 和 FiO₂ 为 1.0 的动物的面罩给猪通风。
8. 开始连续输注平衡电解质溶液 （5 mL∙^kg-1∙^h-1）、异丙酚 （8-12 mg∙^kg-1∙^h-1） 和芬太尼 （0.1-0.2 mg∙^kg-1∙^h-1） 以维持麻醉。
9. 对于插管，使用适合动物的普通气管插管（例如，体重 25-30 kg，气管插管 ID 6-7），配备气管插管导引器和带有 Macintosh Blade 4 的普通喉镜。需要两个人。
   1. 人物 1：一只手拉出舌头，另一只手向下压鼻子。
   2. 人物 2：插入喉镜并像往常一样推进，直到可以看到会厌。
10. 向上拉喉镜以观察声带。有时会厌“粘”在柔软的腭上。如果是这样，请用管子的尖端移动它。
11. 将管子插入声带并拉出导引器。
12. 堵塞管子的球囊。
13. 将管子连接到呼吸机，并通过二氧化碳图和听诊检查正确定位。
14. 开始机械通气（潮气量 6-8 mL/kg，PEEP 5 cmH₂O，FiO₂ 0.4，将 etCO₂ 保持在 35 – 45 mmHg 之间的频率）。

2. 仪表

1. 用绷带缩回后腿，以便为必要的血管插管。用于肺动脉导管放置的动脉导管、动脉导引器鞘、中心静脉线和静脉导引器鞘是必要的。
2. 用酒精消毒对股骨区域进行大量消毒。根据计划的检查，或多或少使用无菌方法。
3. 用生理盐水冲洗导管，准备导管。
4. 将超声探头放在腹股沟韧带上并扫描股血管。
5. 将探头旋转 90°，以在长轴上完全可视化股动脉。如有必要，也可以在不同情况下使用短轴视图来完全可视化股动脉。
6. 在 Seldinger 技术中设置的导引针在线超声可视化下插管股动脉。当脉动明亮的血液流出时，引入导丝并缩回针头。
7. 在在线超声可视化和用导引器套装的针头连续抽吸下可视化股静脉并插管静脉。当可以抽吸静脉血时，断开注射器并插入导丝。缩回针头。
8. 用超声波检查电线的位置。
9. 将动脉和静脉线插入放置的导丝上。
10. 如上所述，在另一侧重复动脉和静脉标点符号，并根据 Seldinger 的技术插入导引鞘。
11. 将动脉线和静脉线分别连接到换能器。
12. 将两个传感器置于心脏水平，并将两个传感器的三通旋塞阀切换到向大气打开的位置，以将系统校准为零。
    注意：必须避免系统中出现任何气泡和血迹，以生成合理的值。
13. 将异丙酚和芬太尼输注至中心静脉管路的一个端口。
14. 校准探头以进行超快 pO₂ 测量，并将其插入动脉导引器护套。
    注意_{：使用探头} 进行超快 pO₂ 测量不是强制性的，但有助于可视化 pO₂ 的实时变化。

3. 插入肺动脉导管

1. 检查肺动脉导管 （PAC） 的球囊是否损坏。
2. 连接到传感器并校准它。
3. 将 PAC 插入导引器护套（球囊放气）。
4. 当 PAC 穿过导引鞘 （15-20 cm） 时，给球囊充气。
5. 推进 PAC 并监测典型波形（静脉血管、右心房、右心室、肺动脉、肺毛细血管楔压）。给球囊放气并检查血液是否可以通过 PAC 的所有端口抽吸。

4. 肺损伤的诱发：支气管肺泡灌洗液的首发打击

1. 准备加热至 40 °C 的无菌平衡电解质溶液（例如，Sterofundin）。
   注：使用无菌平衡电解质溶液以避免肺部污染。
2. 在进行支气管肺泡灌洗之前，在 10 分钟内将 FiO₂ 从 0.4 更改为 1.0。
3. 开始超快 pO₂ 测量。
4. 准备去甲肾上腺素用于连续输注和推注（如果平均动脉压< 60 mmHg）。将去甲肾上腺素注射泵连接到中心静脉导管的一个端口，而无需启动它。
5. 将 30 mL∙^kg-1 从加热的无菌平衡电解质溶液中填充到漏斗中。检查漏斗是否可以连接到气管插管。
6. 断开管子，呼吸机吸气时没有 PEEP 损失。
7. 将漏斗连接到气管插管。
8. 手动将漏斗抬高到动物上方 1 m。
9. 打开盖子，利用静水压力在 30 秒内将漏斗中全部加热的平衡电解质溶液滴入气管插管中。
10. 30 秒后，通过将漏斗降低到动物下方 1 米处取出注入的溶液，然后被动排出灌洗液。将动物重新连接到呼吸机以进行氧合。
11. 收集去除的灌洗液并记下量。需要计算肺泡液清除率。
    注意：灌洗后不要重复使用平衡电解质溶液，以最大限度地冲洗表面活性剂。
12. 使用抽吸导管吸出管中剩余的溶液。
13. 密切监测支气管肺泡灌洗后的血流动力学，并随身携带去甲肾上腺素。如有必要，推注去甲肾上腺素或持续输注以稳定血压（与步骤 4.4 相比）。
14. 如步骤 4.5-4.13 所述重复输注 30 mL∙^kg-1 平衡电解质溶液，直到 PaO₂/FiO₂ 比率低于 250 mmHg。可能需要重复 4 到 5 次支气管肺泡灌洗。
15. 如果 PaO₂/FiO₂ 比值低于 250 mmHg，则从油酸注射诱导肺损伤开始。在此过程中，请勿更改呼吸机设置。

5. 肺损伤的诱导：油酸注射液的二次打击

1. 准备油酸溶液：在 20 mL 注射器中加入 0.1 mL∙^kg-1 油酸，并将其连接到 3 通旋塞阀。在另一个 20 mL 注射器中取 2 mL 血液。在两个注射器中加入盐水至总体积为 20 mL，并将第二个注射器也连接到 3 通旋塞阀。
   注意： 使用油酸时，请使用手套和护目镜。
2. 准备去甲肾上腺素用于连续输注和推注（如果平均动脉压< 60 mmHg）。将去甲肾上腺素注射泵连接到中心静脉导管的一个端口，而无需启动它。
3. 继续监测仍在测量的超快 pO₂ 测量。FiO₂ 仍然是 1.0。
4. 将 3 向旋塞阀连接到 PAC 的近端端口。
5. 通过三通旋塞阀将溶液从一个注射器反复移动到另一个注射器，反之亦然，将油酸和血液/盐水混合物彻底混合，并始终保持混合。当它是均匀的乳液时，注入 2 mL 乳液并继续混合。
   注：如果混合停止，乳液可能会分离成亲脂性和亲水性部分。
6. 密切监测注射油酸后的血流动力学，并随身携带去甲肾上腺素。如有必要，推注去甲肾上腺素或持续输注以稳定血压（与步骤 5.2 相比）。
   注意：保持警惕;动物可能会在此过程中死亡。
7. 每 3 分钟重复注射 2 mL 溶液，直到 PaO₂/FiO₂ 比率低于 150 mmHg。
8. 如果在 PaO₂/FiO₂ 比率介于 100 和 200 mmHg 之间之前注射器是空的，请按照步骤 5.1 中的说明再准备 2 个注射器。重复步骤 5.5-5.8，直到 PaO₂/FiO₂ 比率下降到 100 到 200 mmHg 之间。
   注意：通常需要半满的油酸和血液/盐水混合物注射器。
9. 如果 PaO₂/FiO₂ 比值在 100 到 200 mmHg 之间，请等待 30 分钟，然后再次检查。如果一直低于 200 mmHg，则开始实验/治疗;否则，按照步骤 5.1 中的说明再准备 2 个注射器，然后重复步骤 5.5-5.9。
   注意：如前所述诱发肺损伤后，肺功能损害可以保持稳定或恶化，甚至在一定范围内改善。

6. 实验结束和安乐死

1. 在持续麻醉中额外注射 0.5 mg 芬太尼并等待 5 分钟。注射 200 mg 异丙酚和 40 mmol 氯化钾，在深度麻醉中杀死动物。

支气管肺泡灌洗和分次施用油酸后，PaO₂/FiO₂ 比率降低（图 1）。由于尚不清楚预测支气管肺泡灌洗对 PaO₂/FiO₂ 比值的影响（例如，分次油酸剂量的影响），因此建议在诱发肺损伤时监测 PaO₂/FiO₂ 比值。超快的 pO₂ 测量允许实时监测 PaO₂ ，并且已经得到充分认可⁶.双重打...

所描述的导致猪严重肺损伤的双击方法适用于研究 ARDS 的不同治疗方案。double-hit 模型模拟了 ARDS 病理机制的两个核心要素：肺泡毛细血管单位的缺失和内皮屏障的破坏⁷。由于两次命中，重要的是要有一个具有预定义目标值（例如，PaO₂/FiO₂ 比值）的研究方案。

这种双重打击方法的主要缺点是难以确定肺损伤的程度?...

所有作者均未披露任何财务或任何其他利益冲突。

作者要感谢 Dagmar Dirvonskis 提供的出色技术支持。