Radyoaktif Olmayan İn Vitro Kardiyak Miyozin Hafif Zincir Kinaz Testleri

Bu çalışma, kardiyak miyozin hafif zincir kinazın (cMLCK) kinaz aktivitesini ve substratı miyozin düzenleyici hafif zincirinin (MLC2v) fosforilasyon seviyesini belirlemek için radyometrik olmayan yöntemler, bir biyolüminesan ADP tespit testi ve bir fosfat afinitesi SDS-PAGE için protokolleri açıklamaktadır.

Kardiyak spesifik miyozin düzenleyici hafif zincir kinaz (cMLCK), miyozin düzenleyici hafif zincirinin (MLC2v) ventriküler izoformunu fosforile ederek kardiyak sarkomer yapısını ve kontraktilitesini düzenler. MLC2v fosforilasyon seviyeleri, başarısız kalplerde önemli ölçüde azalır, bu da kalp yetmezliğinin patogenezini aydınlatmak için cMLCK aktivitesini ve MLC2v'nin fosforilasyon seviyesini değerlendirmenin klinik önemini gösterir. Bu makale, hem cMLCK aktivitesini hem de MLC2v fosforilasyon seviyelerini değerlendirmek için radyoaktif olmayan yöntemleri açıklamaktadır. İn vitro kinaz reaksiyonları, 25 ° C'de ATP ve kalsiyum varlığında rekombinant kalmodulin ve MLC2v ile rekombinant cMLCK kullanılarak gerçekleştirilir, bunu bir biyolüminesan ADP tespit testi veya bir fosfat afinitesi SDS-PAGE izler. Temsili çalışmada, biyolüminesan ADP tespit testi, 1.25 nM ila 25 nM arasındaki cMLCK konsantrasyonlarında sinyalin katı bir doğrusal artışını gösterdi. Fosfat afinitesi SDS-PAGE ayrıca aynı cMLCK konsantrasyon aralığında fosforile MLC2v'de doğrusal bir artış gösterdi. Daha sonra, reaksiyonların zamana bağımlılığı 5 nM cMLCK konsantrasyonunda incelendi. Bir biyolüminesan ADP tespit testi, reaksiyonun 90 dakikası boyunca sinyalde doğrusal bir artış gösterdi. Benzer şekilde, fosfat afinitesi SDS-PAGE, fosforile MLC2v'de zamana bağlı bir artış gösterdi. MLC2v için cMLCK'nin biyokimyasal parametreleri, biyolüminesan ADP tespit testi kullanılarak bir Michaelis-Menten grafiği ile belirlendi. V_max 1.65 ± 0.10 mol / dak / mol kinaz idi ve ortalama K_m 25 ° C'de 0.5 USA μM civarındaydı. Daha sonra, vahşi tip aktivitesi ve dilate kardiyomiyopati ile ilişkili p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK ölçüldü. Biyolüminesan ADP tespit testi ve fosfat afinitesi SDS-PAGE, sırasıyla cMLCK aktivitesi ve MLC2v fosforilasyonundaki kusurları doğru bir şekilde tespit etti. Sonuç olarak, biyolüminesan ADP tespit testi ve fosfat afinitesi SDS-PAGE'nin bir kombinasyonu, cMLCK aktivitesini ve MLC2v'nin fosforilasyon seviyesini ölçmek için basit, doğru, güvenli, düşük maliyetli ve esnek bir yöntemdir.

MYLK3 geni tarafından kodlanan kardiyak spesifik miyozin düzenleyici hafif zincir kinaz (cMLCK), kardiyak ventriküler miyozin düzenleyici hafif zincir 2'nin (MLC2v⁾ fosforilasyonunun sürdürülmesinden ağırlıklı olarak sorumlu olan kinazdır1,2. cMLCK, MLC2v'yi Ser-15'te fosforile ederek, sarkomer organizasyonu^1'i teşvik eder ve çapraz köprü oluşumunun artmasının ve dolayısıyla miyozin II^4'ün kaldıraç kolu sertliğinde bir artışın bir sonucu olarak kardiyak kasılma ^2,3'ü güçlendirir. cMLCK aktivitesindeki kusurlar veya düşük MLC2v fosforilasyon seviyeleri, hayvan modellerinde kalp yetmezliğinin gelişmesine katkıda bulunur ^3,5,6. Bu nedenle, cMLCK aktivitesi, MLC2v'nin fosforilasyon seviyesini düzenleyerek hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda kardiyak kasılmada kritik roller oynar.

Dilate kardiyomiyopati (DCM) sistolik disfonksiyon ve genişlemiş sol ventrikül odacık boyutu ile karakterizedir ve konjestif kalp yetmezliği ve kalp transplantasyonlarının önemli bir nedenidir. Şimdiye kadar 40'tan fazla gen, DCM'ye neden olan mutasyonlar olarak tanımlanmıştır⁷. Son zamanlarda, katalitik alanının⁸ orta kısmında cMLCK proteininin kesilmesi nedeniyle kinaz aktivitesini tamamen ortadan kaldıran yeni bir DCM ile ilişkili MYLK3 mutasyonu (p.Pro639Valfs*15) tanımlanmıştır. MYLK3'te depresif veya ortadan kalkmış cMLCK aktivitesini gösteren iki ailesel DCM ile ilişkili mutasyon vakası da bildirilmiştir⁹. Bu nedenle, ailesel DCM'de baskılanmış veya ortadan kaldırılmış cMLCK aktivitesi, MLC2v fosforilasyon seviyelerini azaltarak hastalığın gelişimine katkıda bulunabilir. MLC2v fosforilasyon seviyeleri, MYLK3^10,11'de mutasyonlar olmasa bile, başarısız insan kalplerinde de önemli ölçüde azalır. Bu nedenle, MLC2v fosforilasyon seviyelerinin azalması insan kalp yetmezliğinde yaygın görünmektedir, bu da cMLCK aktivitesinin ve MLC2v fosforilasyon seviyelerinin değerlendirilmesinin klinik olarak önemli olduğunu göstermektedir. Azalmış MLC2v fosforilasyon seviyelerinin depresif kardiyak kasılmaya nasıl katkıda bulunduğunu açıklamak gerekir. Bu doğrultuda, cMLCK aktivitesi ve MLC2v fosforilasyon düzeylerini ölçen deneyler, kalp yetersizliği patogenezinin aydınlatılmasında son derece önemlidir.

cMLCK aktivitesini ölçmek için klasik yöntem, radyoaktif olarak etiketlenmiş ATP'den [^γ-32P]'nin MLC2v^2'ye dahil edilmesini ölçen radyometrik tabanlı bir testtir. Bununla birlikte, tehlikeli doğası nedeniyle özel güvenlik ve çevresel hususlar gerektirir ve atık bertaraf maliyeti yüksektir. Ek olarak,^32'nin kısa yarı ömrü, radyometrik testin esnekliğini kısıtlar. Bu dezavantajların üstesinden gelmek için alternatif radyometrik olmayan protein kinaz test teknikleri geliştirilmiştir¹². Promega Corporation tarafından geliştirilen biyolüminesan ADP tespit testi, radyoizotoplar¹³ kullanmadan protein kinaz reaksiyonu tarafından üretilen ADP'yi ölçer. Farklı aktivite seviyelerine sahip protein kinazlar için radyometrik test ile karşılaştırılabilir sonuçlar gösterir¹³. Biyolüminesan ADP algılama testi, bir kinaz reaksiyonu tarafından üretilen ADP'yi ölçtüğü için, MLC2v'nin gerçekten fosforile olup olmadığını doğrulamak için biyolüminesan ADP algılama testine paralel olarak fosfat afinitesi SDS-PAGE kullanıldı. Fosfat afinitesi SDS-PAGE, fosforile edilmemiş muadillerine kıyasla fosforile substrat proteinlerinin hareketliliğindeki değişiklikleri tespit edebilen bir fosfat afinite elektroforezi tekniğidir¹⁴.

Bu makale, radyoaktif olmayan yöntemler kullanarak cMLCK'nin aktivitesini ve substratı MLC2v'nin fosforilasyon seviyesini ölçmek için protokolleri açıklamaktadır. Bir in vitro kinaz reaksiyonu gerçekleştirildikten sonra, sırasıyla MLCK'nin biyokimyasal değerlerini ve MCL2v'nin fosforilasyon seviyesini hesaplamak için hem biyolüminesan ADP algılama testi hem de fosfat afinitesi SDS-PAGE kullanılır. Genel olarak, iki radyoaktif olmayan kinaz tahlilini birleştiren bir protokol, kinazların incelenmesi için değerlidir.

1. Rekombinant vahşi tip ve DCM ile ilişkili mutant cMLCK'nin klonlanması ve saflaştırılması

1. Rekombinant kardiyak miyozin hafif zincir kinazının plazmide klonlanması
   1. Son plazmidi temsil etmek için sürekli bir nükleotid dizisi tasarlayın.
   2. Standart bir PCR yöntemi kullanarak insan MYLK3'ü (NM_1829493.3 ) kodlayan bir DNA parçasını çoğaltın. Astar dizileri aşağıdaki gibidir:
      İleri astar: 5'- CACCATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGTCTGGGG -3'
      Ters astar: 5'- TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
      Erime sıcaklığı 60 °C'dir.
      NOT: Tek sarmallı çıkıntı dizisi (CACC), TOPO klonlama vektörüne bağlanmak için gereklidir.
   3. Primer türetilmiş mutajenez ile DCM ile ilişkili bir mutant yapıyı tanıtın. Astar dizileri aşağıdaki gibidir:
      İleri astar: 5'- GTACAAGCCTCGAGAGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
      Ters astar: 5'- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATGTAGTGCTGGT -3'
      Erime sıcaklığı 60 °C'dir.
   4. 20 dakika boyunca 135 V'ta %0,8'lik bir agaroz jeli çalıştırın ve PCR ürünlerine karşılık gelen bantları kesin. Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek bir jel ekstraksiyon kiti ( Malzemelere bakın) kullanarak PCR ürünlerini çıkarın ve saflaştırın.
   5. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir TOPO klonlama reaksiyonu gerçekleştirin ( Malzemelere bakın) ve Escherichia coli'yi dönüştürün (pENTR/cMLCK WT, mutant vektör).
   6. Aşağıdaki evrensel M13 primerlerini kullanarak PCR ile doğru sırayı onaylayın. Astar dizileri aşağıdaki gibidir:
      İleri astar: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Ters astar: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   7. pENTR/cMLCK vektörüne bir FLAG etiketi ekleyin ve üreticinin talimatlarını (pEF-DEST51/FLAG-cMLCK WT, mutant) izleyerek MYLK3 ile bir GateWay hedef vektörü (yani pEF-DEST51) arasında bir LR rekombinasyon reaksiyonu gerçekleştirin.
2. Hücre kültürü ve HEK293T hücrelere transfeksiyon
   1. 100 mm'lik bir tabağı 7.5 x 10⁶ HEK293T hücreli tohumlayın ve% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM ile kültürleyin. 37 ° C'de% 5 CO₂ içinde 24 saat inkübe edin.
   2. 10 μg plazmit DNA'yı 500 μL MEM içinde karıştırarak HEK293T hücrelere transfeksiyon için Lipofeksiyon reaktifi / DNA karışımını hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Aynı zamanda 500 μL MEM içerisine 20 μL Lipofectamine 2000 ilave ederek karışımı hazırlayınız.
   3. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin, ardından Lipofektamin-DNA çözeltisini karıştırın.
   4. RT'de 20 dakika inkübe edin, ardından 100 mm'lik tabağa 1 mL Lipofektamin-DNA solüsyonu ekleyin.
      NOT: Hücrelerin ayrılmasını önlemek için, lipofeksiyon karışımını yavaşça ekleyin.
   5. Transfekte edilmiş hücreleri% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 48 saate kadar inkübe edin.
3. Rekombinant cMLCK proteininin saflaştırılması
   1. Transfekte edilmiş hücreleri buzun üzerine yerleştirin ve 3x'i 5 mL PBS ile yıkayın.
   2. Lizis tamponu hazırlayın (50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, %1 NP40, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM EGTA ve proteaz inhibitörü kokteyli, pH = 7.5) ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Proteaz inhibitörü kokteylini testten hemen önce ekleyin.
   3. Hücrelere 1 mL lizis tamponu ekleyin, hücreleri 1.5 mL'lik bir tüpe toplamak için bir kazıyıcı kullanın ve 5 dakika buz üzerinde inkübe edin.
   4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı 1,5 mL'lik yeni bir tüpte toplayın ve 5 μL FLAG-M2 agaroz ile 4 °C'de 1 saat inkübe edin.
   6. 4 ° C'de 1 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin, daha sonra süpernatanı çıkarın ve yıkama tamponu (50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1% NP40, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM EGTA ve proteaz inhibitör kokteyli, pH = 7.5) kullanarak FLAG-M2 agaroz 3x'te yıkayın.
   7. Bağlayıcı proteinleri elüsyon tamponu (50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, %1 NP40, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM EGTA ve proteaz inhibitör kokteyli, pH = 7.5) ile 4 °C'de 30 dakika boyunca elute edin.
   8. 3 dakika boyunca 4 ° C'de 1.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı rekombinant FLAG etiketli proteinler olarak kullanın.

2. Rekombinant kalmodulinin klonlanması ve saflaştırılması

1. Rekombinant kalmodulinin plazmide klonlanması
   1. Son plazmidi temsil etmek için sürekli bir nükleotid dizisi tasarlayın.
   2. Standart bir PCR yöntemi kullanarak insan kalmodulinini (CALM1) (NM_006888) kodlayan bir DNA fragmanını amplifiye edin. Astar dizileri aşağıdaki gibidir:
      İleri astar: 5'- CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATT -3'
      Ters astar: 5'- TCATTTTGCAGTCATCATCTGTACGAATTC -3'.
      Erime sıcaklığı 60 °C'dir.
      NOT: Tek sarmallı çıkıntı dizileri (CACC), TOPO klonlama vektörüne bağlanmak için gereklidir.
   3. 20 dakika boyunca 135 V'ta% 0.8'lik bir agaroz jeli çalıştırın ve PCR ürünlerine karşılık gelen bantları jelden kesin. Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek bir jel ekstraksiyon kiti ( Malzemelere bakın) kullanarak PCR ürünlerini çıkarın ve saflaştırın.
   4. Üreticinin talimatlarına göre TOPO klonlama reaksiyonunu gerçekleştirin ( Malzemelere bakın) ve E. coli'ye (pENTR/Calmodulin) dönüştürün.
   5. Aşağıdaki evrensel M13 primerlerini kullanarak PCR ile doğru sırayı onaylayın. Sıralanan astar aşağıdaki gibidir:
      İleri astar: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Ters astar: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   6. Üreticinin talimatlarını izleyerek kalmodulin ile bir GateWay hedef vektörü (pEF-DEST17) arasındaki LR rekombinasyon reaksiyonunu gerçekleştirin.
   7. BL21 (DE3) kimyasal olarak yetkin E. coli'ye dönüştürün.
2. Hücre kültürü ve ekspresyon indüksiyonu
   1. 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB besiyerini transforme E. coli'den bir koloni ile aşılayın ve gece boyunca 37 °C'de çalkalayın.
   2. 100 μg / mL ampisilin içeren 200 mL LB ortamına aktarın ve kültür optik yoğunluğu (600 nm) 0.5'e ulaşana kadar 37 ° C'de inkübe edin.
   3. % 0.2'lik bir nihai konsantrasyona arabinoz ekleyin ve 37 ° C'de 3 saat boyunca kültürleyin.
   4. 5.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
   5. EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli içeren 10 mL BugBuster Master Mix'i askıya alın ve RT'de 20 dakika döndürün.
   6. 16.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   7. N-terminali His etiketli kalmodulin proteinini içeren elde edilen süpernatant, hareketsizleştirilmiş metal iyon kromatografisi bağlayıcı tamponu ile dengelenmiş bir TALON Afinite Reçinesi sütununa yüklendi.
   8. Bağlı His etiketli kalmodulin proteinini elüsyon tamponu (50 mM sodyum fosfat [pH = 8.0], 0.3 M NaCl, %0.1 HAPS ve 0.15 M imidazol) ile elute edin, ardından santrifüj filtre kullanarak 4 ° C'de 5.000 x g'da santrifüjleme ile yeniden biriktirin ve konsantre edin.
   9. Protein konsantrasyonu 10 μM'ye ayarlandı ve çözelti kullanıma kadar -80 °C'de tutuldu.

3. İn vitro kinaz testi

NOT: Kinaz reaksiyonunun ilerlemesini önlemek için tüm adımlar buz üzerinde gerçekleştirilir. Ek olarak, aşırı hızlı bir reaksiyonu önlemek için MLCK ve substrat çözeltileri ayrı ayrı karıştırılır.

1. Aşağıdaki çözeltileri hazırlayın ve buz üzerinde tutun:
   10x kinaz tamponu (200 mM HEPES, 10 mM CaCl₂, 50 mM MgCl₂, %0.1 Tween 20, pH = 7.5)
   100 mM DTT
   10 mM ATP
   500 nM kalmodulin
   100 nM BAYRAK etiketli cMLCK
   24 μM His etiketli MLC2v
   NOT: Rekombinant proteinler, belirtilen konsantrasyonlara göre 1x kinaz tamponu kullanılarak seyreltilir.
2. Aşağıdaki malzemeleri kullanarak 1,5 mL'lik tüplerde buz üzerinde 100 μL cMLCK ana solüsyonu hazırlayın:
   10 μL 10x kinaz tamponu
   20 μL 100 nM cMLCK
   20 μL 5 μM kalmodulin
   8 μL 100 mM DTT
   42 μL H₂O
   NOT: Her numune 10x kinaz tamponu ve damıtılmış su ile seyreltilir ve buz üzerinde tutulur.
3. Tablo 30'de açıklandığı gibi her MLC8v konsantrasyonunda buz üzerinde 8 şeritli PCR tüpünde 1 μL substrat çözeltisi hazırlayın. Nihai MLC2v konsantrasyonları 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 ve 12 μM'dir.
   NOT: Rekombinant His etiketli MLC2v, 10x kinaz tamponu ve damıtılmış su ile seyreltilir. Substrat çözeltisinin hacmi, uygun MLC2v konsantrasyonunu elde etmek için su ilave edilerek 30 μL'ye ayarlanır.
4. 40 μL'lik bir nihai reaksiyon çözeltisi hacmi elde etmek için 10 μL MLCK ana çözeltisi ekleyin. Kinaz reaksiyonundaki her bir bileşenin nihai konsantrasyonu 20 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂,% 0.01 Tween 20, 2 mM DTT, 150 μM ATP, 5 nM cMLCK, 250 nM kalmodulin ve 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 veya 12 μM MLC2v (pH = 7.5).
5. İyice karıştırın ve döndürün.
6. Reaksiyon numunelerini belirtilen süre boyunca 25 °C'de inkübe edin.
7. İnkübasyondan sonra, fosfat afinitesi SDS-PAGE veya biyolüminesan ADP tespit testi ile kinaz aktivitesini ölçün.

4. Fosfat afinitesi SDS-PAGE

NOT: Fosfat afinitesi SDS-PAGE, üreticinin protokolüne göre gerçekleştirilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu).

1. Fosfat afinitesi SDS-PAGE için jeli dökün.
   1. İstifleme jeli çözeltilerini aşağıdaki gibi karıştırın: ağırlıkça %12 akrilamid, ağırlıkça %0.1 SDS, 125 mM Tris-HCl (pH = 6.8), ağırlıkça %0.1/hacim amonyum persülfat ve %0.5 hacim/hacim N, N, N', N'- tetrametiletilendiamin.
   2. Çözünen jel çözeltilerini aşağıdaki gibi karıştırın: ağırlıkça %12/hacim akrilamid, 30 μM Fos-tag akrilamid, 60 μM MnCl₂, ağırlıkça %0,1/hacim SDS, 375 mM Tris-HCl (pH = 8,8), ağırlıkça %0,05/hacim amonyum persülfat ve %0,25 hacim/hacim N, N, N', N'- tetrametiletilendiamin.
2. Elektroforez için numune hazırlayın.
   1. İn vitro kinaz reaksiyonundan numuneye 1 mM_MnCl2 ekleyin ve karıştırın.
3. Elektroforez ve Western blotting yapın.
   1. Jeli çalışma tamponunda 80 dakika boyunca 150 V'ta çalıştırın (ağırlıkça %0.1 / hacim SDS, 25 mM Tris ve 192 mM glisin).
   2. Elektroforezden sonra, jeli EDTA (+) transfer tamponunda (10 mM EDTA, 50 mM Tris, 380 mM glisin, ağırlıkça %0.000375 SDS ve %20 ağırlıkça/hacim etanol) 10 dakika ve ardından 10 dakika transfer tamponunda bekletin.
   3. Proteinleri transfer tamponunda 30 dakika boyunca 15 V'ta PVDF membranına aktarın.
   4. RT'de zarı 30 dakika boyunca yağsız kuru sütle sürekli olarak sallayın. Blokajdan sonra, membranı 3x TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl,% 0.001 Tween) ile yıkayın.
   5. Membranı birincil antikorla ıslatın (anti-MLC2v, 1:4.000; Abcam ab92721) gece boyunca 4 °C'de.
   6. Membranı 3x TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl ve %0.001 Tween) ile yıkayın.
   7. Membranı ikincil antikorla ıslatın (HRP'ye bağlı keçi tavşan önleyici 1: 8.000; Cappel, #55696) RT'de 1 saat boyunca.
   8. Membranı 3x TTBS ile yıkayın.
4. Zar üzerindeki proteinleri tespit edin ve analiz edin.
   1. RT'de 1 dakika boyunca membrana ECL (Gelişmiş Chemi Lüminesans reaktifi) algılama reaktifi ekleyin.
   2. En uygun zamanda bir LAS-4000 kullanarak zar üzerindeki proteinleri tespit edin.
   3. ImageQuant TL yazılımını kullanarak arka plan dansitometrisini çıkararak fosforile edilmiş ve fosforile edilmemiş MLC2v'yi ölçün.

5. Biyolüminesan ADP tespit deneyi

NOT: Biyolüminesan ADP algılama testi, üreticinin protokolüne göre gerçekleştirilmiştir.

1. Kinaz tahlil reaksiyonu çözeltisine 40 μL ATP tükenme reaktifi ekleyerek kinaz reaksiyonunu durdurun. İyice karıştırın ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
2. 80 μL ADP algılama reaktifi ekleyin. İyice karıştırın ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
3. Lüminesansı, kuyu başına önerilen maksimum entegrasyon süresi 0,5 s'lik bir luminometre kullanarak ölçün.
4. Bir kalibrasyon eğrisi kullanarak lüminesans yoğunluğunu ADP konsantrasyonuna dönüştürün.
5. MLC2v fosforilasyonu için kullanılan fosfat miktarını hesaplayın.
   NOT: Kinaz reaksiyonu sırasında üretilen toplam ADP, yukarıda tarif edildiği gibi ölçülür. cMLCK otofosforilasyonu da dahil olmak üzere arka plan ADP'si, MLC2v içermeyen bir reaksiyona dayalı olarak ölçülür ve MLC2v fosforilasyonu için kullanılan ADP miktarı, toplam ADP'den arka plan ADP'sinin çıkarılmasıyla değerlendirilir.

6. Veri Analizi

1. Uygun veri analizi yazılımını kullanarak verileri Michalis-Menten denklemine uygun hale getirin. Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir.

Kinaz aktivitesini ölçmek için klasik yöntem, kinaz substratına dahil edilen radyoaktif işaretli fosfatın miktarını belirleyen radyometrik tabanlı bir testtir. Burada sunulan yöntem için, saflaştırılmış vahşi tip cMLCK (Şekil 1A), MLC2v ve kalmodulin kullanılarak radyoaktif olmayan, in vitro cMLCK kinaz testi geliştirildi (Şekil 1B) ve bir biyolüminesan ADP tespit testi kullanılarak kinaz aktivitesi belir...

Bu çalışma, cMLCK'nin aktivitesini belirlemek için radyoaktif olmayan yöntemlerin, biyolüminesan ADP tespit testinin ve fosfat afinitesi SDS-PAGE'nin kombinasyonunun başarılı bir şekilde kullanılıp kullanılamayacağını değerlendirmek için yapılmıştır. Kinaz reaksiyonlarının optimum sıcaklık ve reaksiyon süresi altında gerçekleştirilmesi esastır. Bunlardan herhangi birinin arttırılması, enzim reaksiyonunu hızlı ve güçlü bir şekilde teşvik edecektir....

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI Hibe Numarası JP17K09578 ve JP18H04050 tarafından desteklenmiştir.