Ensaios de quinase de cadeia leve de miosina cardíaca in vitro não radioativos

Este estudo descreve protocolos para métodos não radiométricos, um ensaio de detecção de ADP bioluminescente e um SDS-PAGE de afinidade com fosfato, para determinar a atividade quinase da miosina quinase da cadeia leve cardíaca (cMLCK) e o nível de fosforilação de seu substrato, cadeia leve reguladora da miosina (MLC2v).

A quinase de cadeia leve reguladora da miosina específica do coração (cMLCK) regula a estrutura e a contratilidade do sarcômero cardíaco fosforilando a isoforma ventricular da cadeia leve reguladora da miosina (MLC2v). Os níveis de fosforilação de MLC2v são significativamente reduzidos em corações com insuficiência cardíaca, indicando a importância clínica de avaliar a atividade de cMLCK e o nível de fosforilação de MLC2v para elucidar a patogênese da insuficiência cardíaca. Este artigo descreve métodos não radioativos para avaliar a atividade dos níveis de fosforilação de cMLCK e MLC2v. As reações de quinase in vitro são realizadas usando cMLCK recombinante com calmodulina recombinante e MLC2v na presença de ATP e cálcio a 25 ° C, que são seguidas por um ensaio de detecção de ADP bioluminescente ou um SDS-PAGE de afinidade com fosfato. No estudo representativo, o ensaio de detecção de ADP bioluminescente mostrou um aumento linear estrito do sinal em concentrações de cMLCK entre 1,25 nM e 25 nM. O SDS-PAGE de afinidade com fosfato também mostrou um aumento linear de MLC2v fosforilada na mesma faixa de concentração de cMLCK. Em seguida, a dependência temporal das reações foi examinada na concentração de 5 nM cMLCK. Um ensaio de detecção de ADP bioluminescente mostrou um aumento linear no sinal durante 90 min da reação. Da mesma forma, SDS-PAGE de afinidade com fosfato mostrou um aumento dependente do tempo de MLC2v fosforilado. Os parâmetros bioquímicos de cMLCK para MLC2v foram determinados por um gráfico de Michaelis-Menten usando o ensaio de detecção de ADP bioluminescente. O V_max foi de 1,65 ± 0,10 mol / min / mol quinase e o K_m médio foi de cerca de 0,5 USA μM a 25 ° C. Em seguida, a atividade do tipo selvagem e o cMLCK mutante p.Pro639Valfs*15 associado à cardiomiopatia dilatada foram medidos. O ensaio de detecção de ADP bioluminescente e o SDS-PAGE de afinidade fosfato detectaram corretamente defeitos na atividade de cMLCK e na fosforilação de MLC2v, respectivamente. Em conclusão, uma combinação do ensaio de detecção de ADP bioluminescente e o SDS-PAGE de afinidade com fosfato é um método simples, preciso, seguro, de baixo custo e flexível para medir a atividade de cMLCK e o nível de fosforilação de MLC2v.

A quinase de cadeia leve reguladora da miosina cardio-específica (cMLCK) codificada pelo gene MYLK3 é a quinase predominantemente responsável pela manutenção da fosforilação da cadeia leve reguladora da miosina ventricular cardíaca 2 (MLC2v)^1,2. Ao fosforilar MLC2v em Ser-15, cMLCK promove a organização do sarcômero¹ e potencializa a contratilidade cardíaca ^2,3 como resultado do aumento da formação de pontes cruzadas e, portanto, um aumento na rigidez do braço de alavanca da miosina II⁴. Defeitos na atividade de cMLCK ou níveis reduzidos de fosforilação de MLC2v contribuem para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca em modelos animais ^3,5,6. Assim, a atividade do cMLCK desempenha papéis críticos na contratilidade cardíaca em condições fisiológicas e patológicas, regulando o nível de fosforilação de MLC2v.

A cardiomiopatia dilatada (CMD) é caracterizada por disfunção sistólica e aumento do tamanho da câmara ventricular esquerda e é uma das principais causas de insuficiência cardíaca congestiva e transplantes cardíacos. Até agora, mais de 40 genes foram identificados como mutações causadoras de DCM⁷. Recentemente, foi identificada uma nova mutação MYLK3 associada ao DCM (p.Pro639Valfs*15) que abole completamente a atividade da quinase devido ao truncamento da proteína cMLCK na porção média de seu domínio catalítico⁸. Dois casos de mutações familiares associadas à DCM em MYLK3 mostrando atividade cMLCK deprimida ou abolida também foram relatados⁹. Assim, a atividade de cMLCK deprimida ou abolida na DCM familiar pode contribuir para o desenvolvimento da doença, diminuindo os níveis de fosforilação de MLC2v. Os níveis de fosforilação de MLC2v também são significativamente reduzidos em corações humanos com falha, mesmo sem mutações em MYLK3^10,11. Assim, a redução dos níveis de fosforilação de MLC2v parece ser comum na insuficiência cardíaca humana, indicando que a avaliação da atividade de cMLCK e dos níveis de fosforilação de MLC2v é clinicamente importante. É necessário explicar como os níveis reduzidos de fosforilação de MLC2v contribuem para a contratilação cardíaca deprimida. Assim, ensaios que medem a atividade de cMLCK e os níveis de fosforilação de MLC2v são extremamente importantes para elucidar a patogênese da insuficiência cardíaca.

O método clássico para medir a atividade de cMLCK é um ensaio baseado em radiometria que quantifica a incorporação de [^γ-32P] de ATP marcado radioativamente em MLC2v². No entanto, devido à sua natureza perigosa, requer considerações especiais de segurança e meio ambiente, e o custo do descarte de resíduos é alto. Além disso, a meia-vida curta de³² Prestricts a flexibilidade do ensaio radiométrico. Para superar essas desvantagens, técnicas alternativas de ensaio de proteína quinase não radiométrica foram desenvolvidas¹². O ensaio de detecção de ADP bioluminescente desenvolvido pela Promega Corporation mede o ADP gerado pela reação da proteína quinase sem o uso de radioisótopos¹³. Mostra resultados comparáveis ao ensaio radiométrico para proteínas quinases com níveis variados de atividade¹³. Como o ensaio de detecção de ADP bioluminescente mede o ADP produzido por uma reação de quinase, o SDS-PAGE de afinidade fosfato em paralelo com o ensaio de detecção de ADP bioluminescente foi usado para verificar se o MLC2v é realmente fosforilado. SDS-PAGE de afinidade com fosfato é uma técnica de eletroforese de afinidade com fosfato que pode detectar alterações na mobilidade de proteínas de substrato fosforiladas em comparação com suas contrapartes não fosforiladas¹⁴.

Este artigo descreve protocolos para medir a atividade de cMLCK e o nível de fosforilação de seu substrato, MLC2v, usando métodos não radioativos. Após a realização de uma reação de quinase in vitro, tanto o ensaio de detecção de ADP bioluminescente quanto o SDS-PAGE de afinidade fosfato são empregados para calcular os valores bioquímicos de MLCK e o nível de fosforilação de MCL2v, respectivamente. No geral, um protocolo que combina os dois ensaios de quinase não radioativa é valioso para o estudo de quinases.

1. Clonagem e purificação de cMLCK mutante do tipo selvagem recombinante e associado ao DCM

1. Clonagem de miosina quinase de cadeia leve cardíaca recombinante em plasmídeo
   1. Projete uma sequência contínua de nucleotídeos para representar o plasmídeo final.
   2. Amplificar um fragmento de ADN que codifica MYLK3 humano (NM_1829493.3) utilizando um método de PCR padrão. As sequências de primers são as seguintes:
      Primer dianteiro: 5'- CACCATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGTCTGGGG -3'
      Primer reverso: 5'- TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
      A temperatura de fusão é de 60 °C.
      NOTA: A sequência de saliência de fita simples (CACC) é necessária para se ligar ao vetor de clonagem TOPO.
   3. Introduza uma construção mutante associada ao DCM por mutagênese derivada de primer. As sequências de primers são as seguintes:
      Primer para frente: 5'- GTACAAGCCTCGAGAGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
      Primer reverso: 5'- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATGTAGTGCTGGT -3'
      A temperatura de fusão é de 60 °C.
   4. Execute um gel de agarose a 0,8% a 135 V por 20 min e corte as bandas correspondentes aos produtos de PCR. Em seguida, extraia e purifique os produtos de PCR usando um kit de extração de gel (consulte Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
   5. Execute uma reação de clonagem TOPO seguindo as instruções do fabricante (consulte Materiais) e transforme Escherichia coli (pENTR/cMLCK WT, vetor mutante).
   6. Confirme a sequência correta por PCR usando os seguintes primers M13 universais. As sequências de primers são as seguintes:
      Primer dianteiro: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Primer reverso: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   7. Incorpore uma etiqueta FLAG no vetor pENTR/cMLCK e execute uma reação de recombinação LR entre MYLK3 e um vetor de destino GateWay (ou seja, pEF-DEST51) seguindo as instruções do fabricante (pEF-DEST51/FLAG-cMLCK WT, mutante).
2. Cultura celular e transfecção em células HEK293T
   1. Semeie uma placa de 100 mm com 7,5 x 10⁶ HEK293T células e cultive com DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar a 37 °C em 5% de CO₂ durante 24 h.
   2. Prepare a mistura de reagente/DNA de lipofecção para transfecção em células HEK293T misturando 10 μg de DNA de plasmídeo em 500 μL de MEM (ver Tabela de Materiais). Ao mesmo tempo, prepare a mistura adicionando 20 μL de Lipofectamine 2000 em 500 μL de MEM.
   3. Incube por 5 min em temperatura ambiente (RT) e, em seguida, misture a solução de DNA de lipofectamina.
   4. Incubar durante 20 min à RT e, em seguida, adicionar 1 ml da solução de Lipofectamine-DNA à placa de 100 mm.
      NOTA: Para evitar o descolamento das células, adicione a mistura de lipofecção suavemente.
   5. Incubar as células transfectadas por até 48 h a 37 °C com 5% de CO₂.
3. Purificação da proteína cMLCK recombinante
   1. Coloque as células transfectadas no gelo e lave 3x com 5 mL de PBS.
   2. Prepare o tampão de lise (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1% NP40, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA e coquetel inibidor de protease, pH = 7,5) e mantenha no gelo.
      NOTA: Adicione o coquetel de inibidores de protease imediatamente antes do ensaio.
   3. Adicione 1 mL de tampão de lise às células, use um raspador para colher as células em um tubo de 1,5 mL e incube no gelo por 5 min.
   4. Centrifugue a 20.000 x g por 5 min a 4 °C.
   5. Colete o sobrenadante em um novo tubo de 1,5 mL e incube com 5 μL de agarose FLAG-M2 por 1 h a 4 ° C.
   6. Centrifugue a 1.000 x g por 1 min a 4 ° C, remova o sobrenadante e lave em agarose FLAG-M2 3x usando tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1% NP40, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA e coquetel inibidor de protease, pH = 7,5).
   7. Eluir as proteínas de ligação com tampão de eluição (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1% NP40, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA e coquetel inibidor de protease, pH = 7,5) a 4 ° C por 30 min.
   8. Centrifugue a 1.000 x g a 4 ° C por 3 min e use o sobrenadante como as proteínas recombinantes marcadas com FLAG.

2. Clonagem e purificação de calmodulina recombinante

1. Clonagem de calmodulina recombinante no plasmídeo
   1. Projete uma sequência contínua de nucleotídeos para representar o plasmídeo final.
   2. Amplificar um fragmento de ADN que codifica a calmodulina humana (CALM1) (NM_006888) utilizando um método de PCR normalizado. As sequências de primers são as seguintes:
      Primer dianteiro: 5'- CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATT -3'
      Primer reverso: 5'- TCATTTTGCAGTCATCATCTGTACGAATTC -3'.
      A temperatura de fusão é de 60 °C.
      NOTA: As sequências de saliência de fita simples (CACC) são necessárias para a ligação ao vetor de clonagem TOPO.
   3. Execute um gel de agarose a 0,8% a 135 V por 20 min e corte as bandas correspondentes aos produtos de PCR do gel. Em seguida, extraia e purifique os produtos de PCR usando um kit de extração de gel (consulte Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
   4. Execute a reação de clonagem TOPO seguindo as instruções do fabricante (ver Materiais) e transforme em E. coli (pENTR/Calmodulin).
   5. Confirme a sequência correta por PCR usando os seguintes primers M13 universais. Os primers sequenciados são os seguintes:
      Primer dianteiro: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Primer reverso: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   6. Execute a reação de recombinação LR entre a calmodulina e um vetor de destino GateWay (pEF-DEST17) seguindo as instruções do fabricante.
   7. Transforme-se em E. coli quimicamente competente BL21 (DE3).
2. Cultura celular e indução de expressão
   1. Inocular 5 ml de meio LB contendo 100 μg/ml de ampicilina com uma colónia da E. coli transformada e agitar durante a noite a 37 °C.
   2. Transferir para 200 ml de meio LB contendo 100 μg/ml de ampicilina e incubar a 37 °C até que a densidade ótica da cultura (600 nm) atinja 0,5.
   3. Adicionar arabinose a uma concentração final de 0,2% e cultivar durante 3 h a 37 °C.
   4. Centrifugue a 5.000 x g a 4 °C por 10 min e remova o sobrenadante.
   5. Suspenda em 10 mL de BugBuster Master Mix contendo coquetel inibidor de protease sem EDTA e gire em RT por 20 min.
   6. Centrifugue a 16.000 x g a 4 °C por 10 min.
   7. O sobrenadante resultante contendo a proteína calmodulina marcada com His N-terminal foi carregado em uma coluna de resina de afinidade TALON equilibrada com tampão de ligação de cromatografia de íons metálicos imobilizados.
   8. Eluir a proteína calmodulina marcada com His ligada com tampão de eluição (fosfato de sódio 50 mM [pH = 8,0], NaCl 0,3 M, CHAPS 0,1% e imidazol 0,15 M), depois redobrar e concentrar por centrifugação a 5.000 x g a 4 ° C usando um filtro centrífugo.
   9. A concentração de proteína foi ajustada para 10 μM e a solução mantida a -80 °C até o uso.

3. Ensaio de quinase in vitro

NOTA: Todas as etapas são executadas no gelo para evitar que a reação da quinase prossiga. Além disso, as soluções MLCK e substrato são misturadas separadamente para evitar uma reação excessivamente rápida.

1. Prepare as seguintes soluções e mantenha no gelo:
   10x tampão quinase (200 mM HEPES, 10 mM CaCl₂, 50 mM MgCl₂, 0,1% Tween 20, pH = 7,5)
   100 mM TDT
   10 mM ATP
   Calmodulina 500 nM
   100 nM cMLCK marcado com FLAG
   24 μM His-tagged MLC2v
   NOTA: As proteínas recombinantes são diluídas usando tampão quinase 1x de acordo com as concentrações indicadas.
2. Prepare 100 μL da solução principal cMLCK em gelo em tubos de 1,5 mL usando os seguintes ingredientes:
   10 μL de tampão quinase 10x
   20 μL de 100 nM cMLCK
   20 μL de calmodulina 5 μM
   8 μL de 100 mM DTT
   42 μL de H₂O
   NOTA: Cada amostra é diluída com tampão quinase 10x e água destilada e mantida em gelo.
3. Prepare 30 μL de solução de substrato no tubo de PCR de 8 tiras em gelo em cada concentração de MLC2v, conforme descrito na Tabela 1. As concentrações finais de MLC2v são 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 e 12 μM.
   NOTA: O MLC2v recombinante marcado com His é diluído com tampão quinase 10x e água destilada. O volume da solução de substrato é ajustado para 30 μL adicionando água para obter a concentração apropriada de MLC2v.
4. Adicione 10 μL da solução mestre MLCK para obter um volume final de solução de reação de 40 μL. A concentração final de cada componente na reação de quinase é 20 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,01% Tween 20, 2 mM DTT, 150 μM ATP, 5 nM cMLCK, 250 nM calmodulina e 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 ou 12 μM MLC2v (pH = 7,5).
5. Misture bem e gire para baixo.
6. Incubar as amostras de reação a 25 °C durante o tempo indicado.
7. Após a incubação, meça a atividade da quinase por SDS-PAGE de afinidade com fosfato ou ensaio de detecção de ADP bioluminescente.

4. SDS-PAGE de afinidade com fosfato

NOTA: O SDS-PAGE com afinidade de fosfato foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais).

1. Despeje o gel para SDS-PAGE de afinidade com fosfato.
   1. Misture as soluções de gel de empilhamento da seguinte forma: 12% em peso/vol de acrilamida, 0,1% em peso/vol SDS, 125 mM Tris-HCl (pH = 6,8), 0,1% em peso/vol de persulfato de amônio e 0,5% vol/vol N, N, N', N'- tetrametiletilenodiamina.
   2. Misture as soluções de gel de resolução da seguinte forma: 12% em peso / vol de acrilamida, 30 μM de acrilamida Phos-tag, 60 μM MnCl₂, 0,1% em peso / vol SDS, 375 mM Tris-HCl (pH = 8,8), 0,05% em peso / vol de persulfato de amônio e 0,25% vol / vol N, N, N', N'- tetrametiletilenodiamina.
2. Prepare a amostra para eletroforese.
   1. Adicione e misture 1 mM de MnCl₂ à amostra da reação in vitro de quinase.
3. Realize eletroforese e Western blotting.
   1. Execute o gel a 150 V por 80 min em tampão de corrida (0,1% em peso / vol SDS, 25 mM Tris e 192 mM de glicina).
   2. Após a eletroforese, mergulhe o gel em tampão de transferência EDTA (+) (EDTA 10 mM, Tris 50 mM, glicina 380 mM, SDS 0,000375% em peso / vol e etanol 20% peso / vol) por 10 min e depois em tampão de transferência por 10 min.
   3. Transfira proteínas para a membrana de PVDF a 15 V por 30 min em tampão de transferência.
   4. Agite a membrana continuamente com leite em pó desnatado por 30 min em RT. Após o bloqueio, lave a membrana 3x com TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,001% Tween).
   5. Mergulhe a membrana com o anticorpo primário (anti-MLC2v, 1:4.000; Abcam ab92721) durante a noite a 4 °C.
   6. Lave a membrana 3x com TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl e 0,001% Tween).
   7. Mergulhe a membrana com o anticorpo secundário (anti-coelho de cabra acoplado a HRP 1:8.000; Cappel, # 55696) por 1 h em RT.
   8. Lave a membrana 3x com TTBS.
4. Detecte e analise proteínas na membrana.
   1. Adicione o reagente de detecção ECL (reagente de luminescência de Chemi aprimorado) à membrana por 1 min em RT.
   2. Detecte as proteínas na membrana usando um LAS-4000 no momento ideal.
   3. Quantifique o MLC2v fosforilado e não fosforilado, subtraindo a densitometria de fundo usando o software ImageQuant TL.

5. Ensaio de detecção de ADP bioluminescente

NOTA: O ensaio de detecção de ADP bioluminescente foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante.

1. Pare a reação de quinase adicionando 40 μL de reagente de depleção de ATP na solução de reação de ensaio de quinase. Misture bem e incube por 30 min em RT.
2. Adicione 80 μL de reagente de detecção de ADP. Misture bem e incube por 30 min em RT.
3. Meça a luminescência usando um luminômetro com um tempo máximo de integração sugerido de 0,5 s por poço.
4. Converta a intensidade de luminescência em concentração de ADP usando uma curva de calibração.
5. Calcular a quantidade de fosfatos utilizada para a fosforilação de MLC2v.
   NOTA: O ADP total produzido durante a reação de quinase é medido conforme descrito acima. O ADP de fundo, incluindo a autofosforilação de cMLCK, é medido com base em uma reação sem MLC2v, e a quantidade de ADP usada para fosforilação de MLC2v é avaliada subtraindo o ADP de fundo do ADP total.

6. Análise de dados

1. Ajuste os dados à equação de Michalis-Menten usando o software de análise de dados apropriado. Os dados são expressos como média ± desvio padrão.

O método clássico para medir a atividade da quinase é um ensaio baseado em radiometria que quantifica o fosfato radiomarcado incorporado ao substrato da quinase. Para o método aqui apresentado, foi desenvolvido um ensaio de quinase cMLCK in vitro não radioativo usando cMLCK do tipo selvagem purificado ( Figura 1A ), MLC2v e calmodulina ( Figura 1B ), e a atividade da quinase foi determinada usando um ensaio de detecção de...

O presente estudo foi realizado para avaliar se a combinação de métodos não radioativos, o ensaio de detecção de ADP bioluminescente e o SDS-PAGE de afinidade fosfato poderiam ser usados com sucesso para determinar a atividade de cMLCK. É essencial realizar as reações de quinase sob a temperatura e o tempo de reação ideais. O aumento de qualquer um deles promoverá rápida e fortemente a reação enzimática. No presente estudo, a reação in vitro de quinase foi realizada com...

Os autores não têm nada a divulgar.

Este trabalho foi apoiado em parte pela JSPS KAKENHI Grant Number JP17K09578 e JP18H04050.