غير مشعة في المختبر القلب الميوسين سلسلة كيناز الخفيفة فحوصات كيناز

Kenta Kamikubo; Osamu Tsukamoto; Yuki Uyama-Saito; Ryohei Oya; Tomoya Tsubota; Noboru Fujino; Yoshihiro Asano; Hisakazu Kato; Ken Matsuoka; Seiji Takashima

doi:10.3791/61168

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

تصف هذه الدراسة بروتوكولات الطرق غير الإشعاعية ، ومقايسة الكشف عن ADP المضيئة بيولوجيا و SDS-PAGE لتقارب الفوسفات ، لتحديد نشاط كيناز السلسلة الخفيفة للميوسين القلبي (cMLCK) ومستوى الفسفرة في ركيزته ، سلسلة الضوء التنظيمية للميوسين (MLC2v).

Abstract

ينظم كيناز السلسلة الخفيفة التنظيمية للميوسين الخاص بالقلب (cMLCK) بنية وانقباض قسط عضلي القلب عن طريق فسفرة الشكل الإسوي البطيني للسلسلة الخفيفة التنظيمية للميوسين (MLC2v). تنخفض مستويات الفسفرة MLC2v بشكل كبير في القلوب الفاشلة ، مما يشير إلى الأهمية السريرية لتقييم نشاط cMLCK ومستوى فسفرة MLC2v لتوضيح التسبب في قصور القلب. تصف هذه الورقة الطرق غير المشعة لتقييم كل من نشاط مستويات الفسفرة cMLCK و MLC2v. يتم إجراء تفاعلات كيناز في المختبر باستخدام cMLCK المؤتلف مع الكالمودولين المؤتلف و MLC2v في وجود ATP والكالسيوم عند 25 درجة مئوية ، والتي يتبعها إما مقايسة الكشف عن ADP المضيئة بيولوجيا أو SDS-PAGE لتقارب الفوسفات. في الدراسة التمثيلية ، أظهر مقايسة الكشف عن ADP المضيئة بيولوجيا زيادة خطية صارمة للإشارة عند تركيزات cMLCK بين 1.25 نانومتر إلى 25 نانومتر. أظهر تقارب الفوسفات SDS-PAGE أيضا زيادة خطية في MLC2v الفسفرة في نفس نطاق تركيز cMLCK. بعد ذلك ، تم فحص الاعتماد الزمني للتفاعلات عند تركيز 5 نانومتر cMLCK. أظهر اختبار الكشف عن ADP المضيء بيولوجيا زيادة خطية في الإشارة خلال 90 دقيقة من التفاعل. وبالمثل ، أظهر تقارب الفوسفات SDS-PAGE زيادة تعتمد على الوقت في MLC2v الفسفوري. تم تحديد المعلمات البيوكيميائية ل cMLCK ل MLC2v بواسطة مخطط Michaelis-Menten باستخدام مقايسة الكشف عن ADP المضيئة بيولوجيا. كان _{الحد الأقصى} V 1.65 ± 0.10 مول / دقيقة / مول كيناز وكان متوسط K_m حوالي 0.5 ميكرومتر أمريكي عند 25 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم قياس نشاط النوع البري وارتباط p.Pro639Valfs * 15 cMLCK المتحور. اكتشف مقايسة الكشف عن ADP المضيء بيولوجيا وتقارب الفوسفات SDS-PAGE بشكل صحيح عيوبا في نشاط cMLCK وفسفرة MLC2v ، على التوالي. في الختام ، فإن الجمع بين مقايسة الكشف عن ADP المضيء بيولوجيا و SDS-PAGE تقارب الفوسفات هو طريقة بسيطة ودقيقة وآمنة ومنخفضة التكلفة ومرنة لقياس نشاط cMLCK ومستوى الفسفرة ل MLC2v.

Introduction

كيناز السلسلة الخفيفة التنظيمية للميوسين الخاص بالقلب (cMLCK) المشفر بواسطة جين MYLK3 هو الكيناز المسؤول في الغالب عن الحفاظ على فسفرة السلسلة الخفيفة التنظيمية للميوسين البطيني القلبي 2 (MLC2v) ¹^،². من خلال فسفرة MLC2v في Ser-15 ، يعزز cMLCK تنظيم اللقب العضلي^{الساقي 1} ويقوي انقباض القلب²^،³ نتيجة لزيادة تكوين الجسر المتقاطع وبالتالي زيادة صلابة ذراع الذراع للميوسين II⁴. تساهم العيوب في نشاط cMLCK أو انخفاض مستويات فسفرة MLC2v في تطور قصور القلب في النماذج الحيوانية³^،⁵^،⁶. وبالتالي ، يلعب نشاط cMLCK أدوارا حاسمة في انقباض القلب في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية من خلال تنظيم مستوى الفسفرة ل MLC2v.

يتميز اعتلال عضلة القلب التوسعي (DCM) بخلل وظيفي انقباضي وتضخم حجم حجرة البطين الأيسر وهو سبب رئيسي لفشل القلب الاحتقاني وزرع القلب. حتى الآن تم تحديد أكثر من 40 جينا على أنها طفرات مسببة ل^{DCM 7}. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد طفرة MYLK3 جديدة مرتبطة ب DCM (p.Pro639Valfs * 15) تلغي تماما نشاط كيناز بسبب اقتطاع بروتين cMLCK في الجزء الأوسط من مجاله التحفيزي⁸. كما تم الإبلاغ عن حالتين من الطفرات العائلية المرتبطة ب DCM في MYLK3 تظهر نشاطا مكتئبا أو ملغىيا⁹. وبالتالي ، فإن نشاط cMLCK المكتئب أو الملغى في DCM العائلي قد يساهم في تطور المرض عن طريق تقليل مستويات فسفرة MLC2v. كما تنخفض مستويات فسفرة MLC2v بشكل كبير في قلوب البشر الفاشلة حتى بدون طفرات في MYLK3¹⁰^،¹¹. وبالتالي ، يبدو أن انخفاض مستويات الفسفرة MLC2v شائع في قصور القلب البشري ، مما يشير إلى أن تقييم نشاط cMLCK ومستويات الفسفرة MLC2v مهم سريريا. من الضروري شرح كيف تساهم مستويات الفسفرة المنخفضة MLC2v في انقباض القلب المنخفض. وفقا لذلك ، فإن المقايسات التي تقيس نشاط cMLCK ومستويات الفسفرة MLC2v مهمة للغاية لتوضيح التسبب في قصور القلب.

الطريقة الكلاسيكية لقياس نشاط cMLCK هي اختبار قائم على القياس الإشعاعي يحدد دمج [^γ-32P] من ATP المسمى إشعاعيا في MLC2v². ومع ذلك ، نظرا لطبيعتها الخطرة ، فإنها تتطلب اعتبارات خاصة تتعلق بالسلامة والبيئة ، وتكلفة التخلص من النفايات مرتفعة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عمر النصف القصير ل³² يقيد مرونة المقايسة الإشعاعية. للتغلب على هذه العيوب ، تم تطوير تقنيات بديلة لفحص بروتين كيناز غير المشع¹². يقيس مقايسة الكشف عن ADP المضيئة بيولوجيا التي طورتها شركة Promega Corporation ADP الناتجة عن تفاعل بروتين كيناز دون استخدام النظائر المشعة¹³. يظهر نتائج مماثلة للمقايسة الإشعاعية لكينازات البروتين بمستويات متفاوتة من^{النشاط 13}. نظرا لأن مقايسة الكشف عن ADP المضيئة بيولوجيا تقيس ADP الناتج عن تفاعل كيناز ، فقد تم استخدام SDS-PAGE لتقارب الفوسفات بالتوازي مع مقايسة الكشف عن ADP المضيئة بيولوجيا للتحقق مما إذا كان MLC2v مفسفرا بالفعل. تقارب الفوسفات SDS-PAGE هي تقنية الرحلان الكهربائي لتقارب الفوسفات يمكنها اكتشاف التغيرات في حركة بروتينات الركيزة الفسفرة مقارنة بنظيراتها غير الفسفرة¹⁴.

توضح هذه المقالة بروتوكولات لقياس نشاط cMLCK ومستوى الفسفرة لركيزتها ، MLC2v ، باستخدام طرق غير مشعة. بعد إجراء تفاعل كيناز في المختبر ، يتم استخدام كل من مقايسة الكشف عن ADP المضيئة بيولوجيا و SDS-PAGE لتقارب الفوسفات لحساب القيم الكيميائية الحيوية ل MLCK ومستوى الفسفرة ل MCL2v ، على التوالي. بشكل عام ، يعد البروتوكول الذي يجمع بين مقايسات كيناز غير المشعة ذا قيمة لدراسة الكينازات.

Protocol

1. استنساخ وتنقية النوع البري المؤتلف والمتحولة المرتبطة ب DCM

استنساخ كيناز السلسلة الخفيفة للميوسين القلبي المؤتلف في البلازميد
1. تصميم تسلسل مستمر للنيوكليوتيدات لتمثيل البلازميد النهائي.
2. تضخيم جزء من الحمض النووي يرمز MYLK3 البشري (NM_1829493.3) باستخدام طريقة PCR القياسية. التسلسلات التمهيدية هي كما يلي:
  التمهيدي الأمامي: 5 '- CACCATGTCAGGAACCTCCAAGGAGTCTGGGG -3'
  التمهيدي العكسي: 5 '- TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
  درجة حرارة الانصهار 60 درجة مئوية.
  ملاحظة: يعد تسلسل البروز أحادي الشريطة (CACC) ضروريا للربط بمتجه استنساخ TOPO.
3. أدخل بنية متحولة مرتبطة ب DCM عن طريق الطفرات المشتقة من التمهيدي. التسلسلات التمهيدية هي كما يلي:
  التمهيدي الأمامي: 5 '- GTACAAGCCTCGAGAAGCTGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
  التمهيدي العكسي: 5 '- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATGTAGTGCTGGT -3 '
  درجة حرارة الانصهار 60 درجة مئوية.
4. قم بتشغيل جل الاغاروز بنسبة 0.8٪ عند 135 فولت لمدة 20 دقيقة ، وقم بقطع الأربطة المقابلة لمنتجات PCR. ثم استخرج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وتنقيتها باستخدام مجموعة استخراج الجل (انظر المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
5. قم بإجراء تفاعل استنساخ TOPO باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر المواد) وتحويل الإشريكية القولونية (pENTR / cMLCK WT ، ناقل متحور).
6. قم بتأكيد التسلسل الصحيح بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات M13 العالمية التالية. التسلسلات التمهيدية هي كما يلي:
  التمهيدي الأمامي: 5 '- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
  التمهيدي العكسي: 5 '- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
7. قم بدمج علامة FLAG في متجه pENTR / cMLCK وقم بإجراء تفاعل إعادة تركيب LR بين MYLK3 ومتجه وجهة GateWay (على سبيل المثال ، pEF-DEST51) باتباع تعليمات الشركة المصنعة (pEF-DEST51 / FLAG-cMLCK WT ، متحول).
زراعة الخلايا وتعداء الخلايا في خلايا HEK293T
1. زرع طبق 100 مم يحتوي على 7.5 × 10⁶ خلايا HEK293T وزراعة DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.
2. قم بإعداد كاشف Lipofection / مزيج الحمض النووي للتعداء في خلايا HEK293T عن طريق خلط 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في 500 ميكرولتر من MEM (انظر جدول المواد). في الوقت نفسه ، قم بإعداد الخليط بإضافة 20 ميكرولتر من الليبوفيكتامين 2000 في 500 ميكرولتر من MEM.
3. احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم اخلط محلول Lipofectamine-DNA.
4. احتضن لمدة 20 دقيقة في RT ، ثم أضف 1 مل من محلول Lipofectamine-DNA إلى الطبق 100 مم.
  ملاحظة: لتجنب فصل الخلايا ، أضيفي خليط الدهون برفق.
5. احتضان الخلايا المنقولة لمدة تصل إلى 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
تنقية بروتين cMLCK المؤتلف
1. ضع الخلايا المنقولة على الثلج واغسلها 3 مرات باستخدام 5 مل من PBS.
2. قم بإعداد مخزن التحلل المؤقت (50 ملي مولار Tris-HCl ، 0.15 M كلوريد الصوديوم ، 1٪ NP40 ، 0.5 ملي مولار EDTA ، 0.5 ملي مولار EGTA ، وكوكتيل مثبط البروتياز ، الرقم الهيدروجيني = 7.5) واستمر في وضع الثلج.
  ملاحظة: أضف كوكتيل مثبط البروتياز قبل الفحص مباشرة.
3. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتحلل إلى الخلايا ، واستخدم مكشطة لحصاد الخلايا في أنبوب سعة 1.5 مل ، واحتضانه على الجليد لمدة 5 دقائق.
4. جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد سعة 1.5 مل واحتضانها ب 5 ميكرولتر من FLAG-M2 agarose لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
6. جهاز طرد مركزي عند 1,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بإزالة المادة الطافية واغسلها في FLAG-M2 agarose 3x باستخدام مخزن الغسيل (50 ملي مولار Tris-HCl ، 0.15 M كلوريد الصوديوم ، 1٪ NP40 ، 0.5 ملي EDTA ، 0.5 ملي مولار EGTA ، وكوكتيل مثبط البروتياز ، الرقم الهيدروجيني = 7.5).
7. قم بتقطيع البروتينات الملزمة بمحلول الشطف (50 ملي مولار Tris-HCl ، 0.15 M كلوريد الصوديوم ، 1٪ NP40 ، 0.5 ملي مولار EDTA ، 0.5 ملي مولار EGTA ، وكوكتيل مثبط البروتياز ، الرقم الهيدروجيني = 7.5) عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
8. جهاز الطرد المركزي عند 1,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق واستخدم المادة الطافية كبروتينات مؤتلفة تحمل علامة FLAG.

2. استنساخ وتنقية الكالمودولين المؤتلف

استنساخ الكالمودولين المؤتلف في البلازميد
1. تصميم تسلسل مستمر للنيوكليوتيدات لتمثيل البلازميد النهائي.
2. تضخيم جزء من الحمض النووي يرمز الكالمودولين البشري (CALM1) (NM_006888) باستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية. التسلسلات التمهيدية هي كما يلي:
  التمهيدي الأمامي: 5 '- CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAGAGATT -3'
  التمهيدي العكسي: 5'- TCATTTTGCAGTCATCATCTGTACGAATTC -3'.
  درجة حرارة الانصهار 60 درجة مئوية.
  ملاحظة: التتابعات المتدلية أحادية الشريطة (CACC) ضرورية للربط بمتجه استنساخ TOPO.
3. قم بتشغيل جل الاغاروز بنسبة 0.8٪ عند 135 فولت لمدة 20 دقيقة ، وقم بقص الأربطة المقابلة لمنتجات PCR من الجل. ثم استخرج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وتنقيتها باستخدام مجموعة استخراج الجل (انظر المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
4. قم بإجراء تفاعل استنساخ TOPO باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر المواد) وقم بتحويله إلى بكتريا قولونية (pENTR / Calmodulin).
5. تأكد من التسلسل الصحيح بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات M13 العالمية التالية. التمهيدي المتتسلسل هي كما يلي:
  التمهيدي الأمامي: 5 '- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
  التمهيدي العكسي: 5 '- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
6. قم بإجراء تفاعل إعادة تركيب LR بين الكالمودولين ومتجه وجهة GateWay (pEF-DEST17) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
7. يتحول إلى BL21 (DE3) بكتريا قولونية مختصة كيميائيا.
زراعة الخلايا وتحريض التعبير
1. تلقيح 5 مل من وسط LB الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين بمستعمرة من الإشريكية القولونية المحولة ورجها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
2. نقل إلى 200 مل من وسط LB الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين واحتضانه عند 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة البصرية للثقافة (600 نانومتر) إلى 0.5.
3. يضاف الأرابينوز إلى التركيز النهائي 0.2٪ والزراعة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
4. جهاز طرد مركزي عند 5,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية.
5. في 10 مل من BugBuster Master Mix الذي يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA وقم بتدويره عند RT لمدة 20 دقيقة.
6. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
7. تم تحميل المادة الطافية الناتجة التي تحتوي على بروتين الكالمودولين الموسوم بعلامة N-terminus His-Tag على عمود من راتنج التقارب TALON متوازن مع مخزن مؤقت ملزم لكروماتوغرافيا أيون معدنية ثابتة.
8. قم بإزالة بروتين الكالمودولين المرتبط بعلامة His مع مخزن الشطف (50 ملي مولار فوسفات الصوديوم [الرقم الهيدروجيني = 8.0] ، 0.3 M كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ CHAPS ، و 0.15 M إيميدازول) ، ثم إعادة التدوير والتركيز عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 × جم عند 4 درجات مئوية باستخدام مرشح الطرد المركزي.
9. تم تعديل تركيز البروتين إلى 10 ميكرومتر وظل المحلول عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. في اختبار كيناز المختبر

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد لمنع تفاعل كيناز من المضي قدما. بالإضافة إلى ذلك ، يتم خلط محاليل MLCK والركيزة بشكل منفصل لتجنب رد فعل سريع للغاية.

قم بإعداد الحلول التالية واستمر في وضع الثلج:
10x عازلة كيناز (200 ملي مولار HEPES ، 10 ملي كلوريد_{المنظومات 2} ، 50 ملي ملي كلوريد₂ ، 0.1٪ توين 20 ، درجة الحموضة = 7.5)
100 ملي ديت
10 ملي متر ATP
500 نانومتر كالمودولين
100 نانومتر الموسومة بعلامة cMLCK
24 ميكرومتر من MLC2v الموسومة
ملاحظة: يتم تخفيف البروتينات المؤتلفة باستخدام 1x kinase buffer وفقا للتركيزات المشار إليها.
قم بإعداد 100 ميكرولتر من محلول cMLCK الرئيسي على الثلج في أنابيب سعة 1.5 مل باستخدام المكونات التالية:
10 ميكرولتر من محلول كيناز 10x
20 ميكرولتر من 100 نانومتر cMLCK
20 ميكرولتر من 5 ميكرومتر كالمودولين
8 ميكرولتر من 100 ملي DTT
42 ميكرولتر من H₂O
ملاحظة: يتم تخفيف كل عينة بمحلول كيناز 10x والماء المقطر وحفظها على الجليد.
قم بإعداد 30 ميكرولتر من محلول الركيزة في أنبوب PCR المكون من 8 شرائط على الجليد عند كل تركيز MLC2v كما هو موضح في الجدول 1. التركيزات النهائية ل MLC2v هي 0 و 0.25 و 0.5 و 1 و 2 و 4 و 8 و 12 ميكرومتر.
ملاحظة: يتم تخفيف MLC2v المؤتلف بمحلول كيناز 10x وماء مقطر. يتم ضبط حجم محلول الركيزة إلى 30 ميكرولتر عن طريق إضافة الماء للحصول على تركيز MLC2v المناسب.
أضف 10 ميكرولتر من محلول MLCK الرئيسي لتحقيق حجم محلول تفاعل نهائي يبلغ 40 ميكرولتر. التركيز النهائي لكل مكون في تفاعل كيناز هو 20 ملي مولار HEPES ، 1 ملي مولار كلوريد_{المكالسيوم 2} ، 5 ملي مولار كلوريد_{المغنيد 2} ، 0.01٪ توين 20 ، 2 ملي مولار DTT ، 150 ميكرومتر ATP ، 5 نانومتر cMLCK ، 250 نانومتر كالمودولين ، و 0 ، 0.25 ، 0.5 ، 1 ، 2 ، 4 ، 8 ، أو 12 ميكرومتر MLC2v (الرقم الهيدروجيني = 7.5).
تخلط جيدا وتدور.
احتضان عينات التفاعل عند 25 درجة مئوية للوقت المحدد.
بعد الحضانة ، قم بقياس نشاط كيناز عن طريق تقارب الفوسفات SDS-PAGE أو مقايسة الكشف عن ADP المضيء الحيوي.

4. تقارب الفوسفات SDS-PAGE

ملاحظة: تم إجراء SDS-PAGE لتقارب الفوسفات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

صب الجل لتقارب الفوسفات SDS-PAGE.
1. امزج محاليل جل التراص على النحو التالي: 12٪ بالوزن / حجم الأكريلاميد ، 0.1٪ بالوزن / حجم SDS ، 125 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 6.8) ، 0.1٪ بالوزن / حجم بيرسلفات الأمونيوم ، و 0.5٪ حجم / حجم N ، N ، N '، N'- رباعي ميثيل إيثيلين ديامين.
2. امزج محاليل الجل المحللة على النحو التالي: 12٪ بالوزن / حجم الأكريلاميد ، 30 ميكرومتر من الأكريلاميد فوس-تاغ ، 60 ميكرومتر من MnCl₂ ، 0.1٪ بالوزن / حجم SDS ، 375 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 8.8) ، 0.05٪ بالوزن / حجم بيرسولفات الأمونيوم ، و 0.25٪ حجم / حجم N ، N ، N '، N'- رباعي ميثيل إيثيلين ديامين.
تحضير عينة للرحلان الكهربائي.
1. أضف واخلط 1 ملي مولار MnCl₂ إلى العينة من تفاعل كيناز في المختبر.
إجراء الرحلان الكهربائي والنشاف الغربي.
1. قم بتشغيل الجل عند 150 فولت لمدة 80 دقيقة في المخزن المؤقت للتشغيل (0.1٪ بالوزن / حجم SDS ، و 25 ملي مولار تريس ، و 192 ملي جلايسين).
2. بعد الرحلان الكهربائي ، انقع الجل في المخزن المؤقت لنقل EDTA (+) (10 ملي مولار EDTA ، 50 ملي تريس ، 380 ملي مولار جلايسين ، 0.000375٪ بالوزن / حجم SDS ، و 20٪ بالوزن / حجم الإيثانول) لمدة 10 دقائق ثم في مخزن النقل لمدة 10 دقائق.
3. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF عند 15 فولت لمدة 30 دقيقة في المخزن المؤقت للنقل.
4. هز الغشاء باستمرار بالحليب الجاف الخالي من الدسم لمدة 30 دقيقة في RT. بعد الحظر ، اغسل الغشاء 3x باستخدام TTBS (50 ملي تريس ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.001٪ توين).
5. انقع الغشاء بالجسم المضاد الأساسي (anti-MLC2v ، 1: 4,000 ؛ Abcam ab92721) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
6. اغسل الغشاء 3x باستخدام TTBS (50 ملي تريس ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، و 0.001٪ توين).
7. انقع الغشاء بالجسم المضاد الثانوي (مضاد للأرانب المقترن ب HRP 1: 8,000 ؛ Cappel ، # 55696) لمدة 1 ساعة في RT.
8. اغسل الغشاء 3x باستخدام TTBS.
كشف وتحليل البروتينات على الغشاء.
1. أضف كاشف الكشف عن ECL (كاشف التلألؤ الكيميائي المحسن) إلى الغشاء لمدة 1 دقيقة في RT.
2. اكتشف البروتينات الموجودة على الغشاء باستخدام LAS-4000 في الوقت الأمثل.
3. حدد كمية MLC2v الفسفوري وغير الفسفري ، مع طرح قياس كثافة الخلفية باستخدام برنامج ImageQuant TL.

5. فحص الكشف عن ADP المضيء الحيوي

ملاحظة: تم إجراء مقايسة الكشف عن ADP المضيء بيولوجيا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

أوقف تفاعل كيناز بإضافة 40 ميكرولتر من كاشف استنفاد ATP إلى محلول تفاعل مقايسة الكيناز. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة في RT.
أضف 80 ميكرولتر من كاشف الكشف عن ADP. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة في RT.
قم بقياس التلألؤ باستخدام مقياس الإضاءة بحد أقصى مقترح لوقت التكامل يبلغ 0.5 ثانية لكل بئر.
قم بتحويل شدة التلألؤ إلى تركيز ADP باستخدام منحنى المعايرة.
احسب كمية الفوسفات المستخدمة في فسفرة MLC2v.
ملاحظة: يتم قياس إجمالي ADP الناتج أثناء تفاعل كيناز كما هو موضح أعلاه. يتم قياس ADP في الخلفية ، بما في ذلك الفسفرة الذاتية cMLCK ، بناء على تفاعل بدون MLC2v ، ويتم تقييم كمية ADP المستخدمة في فسفرة MLC2v عن طريق طرح ADP في الخلفية من إجمالي ADP.

6. تحليل البيانات

ملاءمة البيانات مع معادلة Michalis-Menten باستخدام برنامج تحليل البيانات المناسب. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± انحراف معياري.

النتائج

الطريقة الكلاسيكية لقياس نشاط كيناز هي اختبار قائم على القياس الإشعاعي يحدد كمية الفوسفات المليء بالإشعاع المدمج في ركيزة كيناز. بالنسبة للطريقة المعروضة هنا ، تم تطوير مقايسة كيناز cMLCK غير المشعة في المختبر باستخدام cMLCK من النوع البري المنقى (الشكل 1 أ) ?...

Discussion

أجريت هذه الدراسة لتقييم ما إذا كان من الممكن استخدام الجمع بين الطرق غير المشعة ومقايسة الكشف عن ADP المضيء بيولوجيا وSDS-PAGE لتقارب الفوسفات لتحديد نشاط cMLCK. من الضروري إجراء تفاعلات كيناز تحت درجة الحرارة المثلى ووقت رد الفعل. زيادة أي من هذه ستعزز تفاعل الإنزيم بسرعة وبق?...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JSPS KAKENHI Grant Number JP17K09578 و JP18H04050.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% acrylamide/Bis solution	Bio-Rad	1610156	Store at 4ºC
acrylamide	Bio-Rad	1610156	Store at 4ºC
Amicon Ultra-15	Merck	UFC901008
ammonium persulfate	Wako	019-03435
ampicillin sodium	Wako	014-23302	Store at -20ºC
BugBuster	Milipore	71456-4	Store at 4ºC
CaCl2	Wako	031-00435
CHAPS	Dojindo	349-04722	Store at 4ºC
chemiluminescence imaging analyzer TriStar2	CBERTHOLD TECHNOLOGIES	LB942-A
dithiothreitol	Wako	047-08973	Store at -20ºC
ECL (Enhanced Chemi Luminescence) reagent	GE Healthcare	RPN2106	Mix reagent 1 and reagent 2 in equal amounts
EDTA	DOJINDO	345-01865
Ethanol	Wako	057-00456
FBS	Sigma-Aldrich	172012-500ML	Store at -20ºC
FLAG agarose	Merck	A2220	Store at -20ºC
FLAG peptide	Merck	F3290-4MG	Store at 4ºC
GateWay pEF-DEST51 Vector	Invitrogen	12285011	Store at -20ºC
glycine	Sigma-Aldrich	12-1210-5
HEPES	Dojindo	342-01375
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma-Aldrich	13021-500ML
Imiadasole	Wako	095-00015
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256-25G	Store at -20ºC
LAS-4000	GE Healthcare	28955810
LB	Merck	WM841485 824
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Manganase (II) Chloride Tetrahydrate	Wako	134-15302
MgCl2	nacalai-tesque	20909-42
N, N, N’, N’- tetramethylethylenediamin	Wako	110-18-9
NaCl	Wako	191-01665
OneShot BL21 AI	Invitrogen	44-0184	Store at -80ºC
OptiMEM	gibco	31985-070	Store at 4ºC
PBS	NISSUI PHARMACEUTICAL	5913	Store at 4ºC
penicillin streptmycin	gibco	15140-122	Store at -20ºC
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020	Store at -20ºC
Phos-tag Acrylamide	Wako	AAL-107	Store at 4ºC
Promega ADP-Glo	Promega	V9104	Store at -20ºC
protease inhibitor cock-tail	nacalai-tesque	25955-11
PVDF membrane	Merck	IPVH00010	Pore size : 0.45 μm
QIAEX II Gel Extraction Kit (150)	QIAGEN	20021
SDS	Wako	191-07145
sodium phosphate	Wako	192-02815
TALON affinity resin	TaKaRa	635504	Store at 4ºC
Tris	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
Tween 20	Wako	167-11515	Store at 4ºC
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-500
Ultra Pure ATP, 100mM	Promega	V703B-C	Store at -20ºC
Urea	Sigma-Aldrich	U0631-1KG

References

Seguchi, O., et al. A cardiac myosin light chain kinase regulates sarcomere assembly in the vertebrate heart. The Journal of Clinical Investigation. 117 (10), 2812-2824 (2007).
Chan, J. Y., et al. Identification of cardiac-specific myosin light chain kinase. Circulation Research. 102 (5), 571-580 (2008).
Scruggs, S. B., et al. Ablation of ventricular myosin regulatory light chain phosphorylation in mice causes cardiac dysfunction in situ and affects neighboring myofilament protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 284 (8), 5097-5106 (2009).
Sheikh, F., et al. Mouse and computational models link Mlc2v dephosphorylation to altered myosin kinetics in early cardiac disease. Journal of Clinical Investigation. 122 (4), 1209-1221 (2012).
Ding, P., et al. Cardiac myosin light chain kinase is necessary for myosin regulatory light chain phosphorylation and cardiac performance in vivo. Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40819-40829 (2010).
Warren, S. A., et al. Myosin light chain phosphorylation is critical for adaptation to cardiac stress. Circulation. 126 (22), 2575-2588 (2012).
Pinto, Y. M., et al. Proposal for a revised definition of dilated cardiomyopathy, hypokinetic non-dilated cardiomyopathy, and its implications for clinical practice: a position statement of the ESC working group on myocardial and pericardial diseases. European Heart Journal. 37 (23), 1850-1858 (2016).
Hodatsu, A., et al. Impact of cardiac myosin light chain kinase gene mutation on development of dilated cardiomyopathy. ESC Heart Failure. 6 (2), 406-415 (2019).
Tobita, T., et al. Identification of MYLK3 mutations in familial dilated cardiomyopathy. Scientific Reports. 7 (1), 17495 (2017).
Van Der Velden, J., et al. Myosin light chain composition in non-failing donor and end-stage failing human ventricular myocardium. Advances in Experimental Medicine and Biology. 538, 3-15 (2004).
Morano, I. Tuning the human heart molecular motors by myosin light chairs. Journal of Molecular Medicine. 77 (7), 544-555 (1999).
Fan, F., Wood, K. V. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 5 (1), 127-136 (2007).
Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the Luminescent ADP-Glo Assay to a Standard Radiometric Assay for Measurement of Protein Kinase Activity. ASSAY and Drug Development Technologies. 7 (6), 615-622 (2009).
Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Koike, T. Separation and detection of large phosphoproteins using phos-tag sds-page. Nature Protocols. 4 (10), 1513-1521 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CMLCK MLC2v ADP SDS PAGE CMLCK

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: