מבחני קינאז שרשרת קלה של מיוזין לב לא רדיואקטיבי במבחנה

מחקר זה מתאר פרוטוקולים לשיטות לא רדיומטריות, בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט ו-SDS-PAGE עם זיקה לפוספט, כדי לקבוע את פעילות הקינאז של קינאז שרשרת קלה של מיוזין לב (cMLCK) ואת רמת הזרחן של המצע שלו, שרשרת קלה רגולטורית של מיוזין (MLC2v).

קינאז שרשרת קלה מווסת מיוזין ספציפי ללב (cMLCK) מווסת את מבנה סרקומר הלב והתכווצות על ידי זרחון האיזופורם החדר של שרשרת האור הרגולטורית של המיוזין (MLC2v). רמות הזרחן של MLC2v מופחתות באופן משמעותי בלבבות כושלים, מה שמעיד על החשיבות הקלינית של הערכת הפעילות של cMLCK ורמת הזרחן של MLC2v כדי להבהיר את הפתוגנזה של אי ספיקת לב. מאמר זה מתאר שיטות לא רדיואקטיביות להערכת הפעילות של רמות זרחון cMLCK ו-MLC2v. תגובות קינאז במבחנה מבוצעות באמצעות cMLCK רקומביננטי עם קלמודולין רקומביננטי ו-MLC2v בנוכחות ATP וסידן ב-25 מעלות צלזיוס, שאחריהן בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט או SDS-PAGE בעל זיקה לפוספט. במחקר המייצג, בדיקת זיהוי ה-ADP הביו-לומינסנט הראתה עלייה ליניארית קפדנית של האות בריכוזי cMLCK בין 1.25 ננומטר ל-25 ננומטר. זיקה לפוספט SDS-PAGE הראתה גם עלייה ליניארית של MLC2v זרחני באותו טווח ריכוז cMLCK. לאחר מכן, נבדקה תלות הזמן של התגובות בריכוז של 5 ננומטר cMLCK. בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט הראתה עלייה ליניארית באות במהלך 90 דקות של התגובה. באופן דומה, SDS-PAGE בעל זיקה לפוספט הראה עלייה תלוית זמן של MLC2v זרחני. הפרמטרים הביוכימיים של cMLCK עבור MLC2v נקבעו על ידי תרשים מיכאליס-מנטן באמצעות מבחן זיהוי ADP ביולומינסנצי. ה-V_{המקסימלי} היה 1.65 ±-0.10 מול/דקה/מול קינאז וה-K m _{הממוצע היה} בסביבות 0.5 מיקרומטר ארה"ב ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, נמדדה הפעילות של סוג הבר ו-p.Pro639Valfs*15 cMLCK המוטנטי הקשור לקרדיומיופתיה מורחבת. מבחן זיהוי ה-ADP הביו-לומינסנט ו-SDS-PAGE עם זיקה לפוספט זיהו נכון פגמים בפעילות cMLCK ובזרחון MLC2v, בהתאמה. לסיכום, שילוב של מבחן זיהוי ADP ביולומינסנט ו-SDS-PAGE עם זיקה לפוספט הוא שיטה פשוטה, מדויקת, בטוחה, בעלות נמוכה וגמישה למדידת פעילות cMLCK ורמת הזרחן של MLC2v.

קינאז השרשרת הקלה הרגולטורית של המיוזין הספציפי ללב (cMLCK) המקודד על ידי הגן MYLK3 הוא הקינאז האחראי בעיקר לשמירה על הזרחן של שרשרת האור הרגולטורית של מיוזין חדר הלב 2 (MLC2v)^1,2. על ידי זרחון MLC2v ב-Ser-15, cMLCK מקדם את ארגון סרקומר¹ ומגביר את התכווצות הלב ^2,3 כתוצאה מהגברת היווצרות גשרים צולבים ולכן עלייה בנוקשות זרוע המנוף של מיוזין II⁴. פגמים בפעילות cMLCK או רמות מופחתות של זרחון MLC2v תורמים להתפתחות אי ספיקת לב במודלים של בעלי חיים ^3,5,6. לפיכך, פעילות cMLCK ממלאת תפקידים קריטיים בהתכווצות הלב במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד על ידי ויסות רמת הזרחן של MLC2v.

קרדיומיופתיה מורחבת (DCM) מאופיינת בתפקוד סיסטולי וגודל חדר שמאל מוגדל ומהווה גורם עיקרי לאי ספיקת לב והשתלות לב. עד כה זוהו יותר מ-40 גנים כמוטציות הגורמות ל-DCM⁷. לאחרונה זוהתה מוטציה חדשה ב-MYLK3 הקשורה ל-DCM (p.Pro639Valfs*15) המבטלת לחלוטין את פעילות הקינאז עקב חיתוך של חלבון cMLCK בחלק האמצעי של התחום הקטליטי שלו⁸. דווח גם על שני מקרים של מוטציות משפחתיות הקשורות ל-DCM ב-MYLK3 המראות פעילות מדוכאת או מבוטלת של cMLCK⁹. לפיכך, פעילות cMLCK מדוכאת או מבוטלת ב-DCM משפחתי עשויה לתרום להתפתחות המחלה על ידי הפחתת רמות הזרחן של MLC2v. רמות הזרחן של MLC2v מופחתות באופן משמעותי גם בלבבות אנושיים כושלים גם ללא מוטציות ב-MYLK3^10,11. לפיכך, נראה כי הפחתת רמות הזרחן של MLC2v שכיחה באי ספיקת לב אנושית, מה שמצביע על כך שהערכת פעילות cMLCK ורמות זרחון MLC2v חשובה מבחינה קלינית. יש צורך להסביר כיצד רמות הזרחן המופחתות של MLC2v תורמות להתכווצות לב מדוכאת. בהתאם לכך, מבחנים המודדים את פעילות cMLCK ורמות זרחון MLC2v חשובים ביותר להבהרת הפתוגנזה של אי ספיקת לב.

השיטה הקלאסית למדידת פעילות cMLCK היא בדיקה מבוססת רדיומטריה המכמתת את השילוב של [^γ-32P] מ-ATP המסומן רדיואקטיבי ב-MLC2v². עם זאת, בשל אופיו המסוכן הוא דורש שיקולים בטיחותיים וסביבתיים מיוחדים, ועלות פינוי הפסולת גבוהה. בנוסף, זמן מחצית החיים הקצר של³² מגביל את הגמישות של הבדיקה הרדיומטרית. כדי להתגבר על חסרונות אלה, פותחו טכניקות חלופיות לבדיקת חלבון קינאז לא רדיומטרי¹². בדיקת זיהוי ה-ADP הביולוגית שפותחה על ידי תאגיד פרומגה מודדת ADP שנוצר על ידי תגובת החלבון קינאז ללא שימוש ברדיואיזוטופים¹³. הוא מראה תוצאות דומות לבדיקה הרדיומטרית עבור חלבון קינאזות עם רמות פעילות שונות¹³. מכיוון שבדיקת זיהוי ה-ADP הביו-לומינסנט מודדת ADP המיוצר על ידי תגובת קינאז, נעשה שימוש ב-SDS-PAGE במקביל לבדיקת זיהוי ADP ביו-לומינסנט כדי לאמת אם MLC2v אכן זרחני. Phosphate-affinity SDS-PAGE היא טכניקת אלקטרופורזה של זיקה לפוספט שיכולה לזהות שינויים בניידות של חלבוני סובסטרט זרחניים בהשוואה לעמיתיהם הלא זרחניים¹⁴.

מאמר זה מתאר פרוטוקולים למדידת הפעילות של cMLCK ורמת הזרחן של המצע שלו, MLC2v, בשיטות לא-רדיואקטיביות. לאחר ביצוע תגובת קינאז במבחנה, הן בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט והן SDS-PAGE עם זיקה לפוספט משמשים לחישוב הערכים הביוכימיים של MLCK ורמת הזרחן של MCL2v, בהתאמה. בסך הכל, פרוטוקול המשלב את שתי בדיקות הקינאז הלא רדיואקטיביות הוא בעל ערך לחקר קינאזות.

1. שיבוט וטיהור של סוג בר רקומביננטי ומוטציה cMLCK הקשורה ל-DCM

1. שיבוט של קינאז שרשרת קלה של מיוזין לב רקומביננטי לפלסמיד
   1. תכנן רצף נוקלאוטידים רציף כדי לייצג את הפלסמיד הסופי.
   2. הגבירו מקטע DNA המקודד MYLK3 אנושי (NM_1829493.3) בשיטת PCR סטנדרטית. רצפי הפריימר הם כדלקמן:
      פריימר קדימה: 5'- CACCATGTCAGGAACCTCTCCAAGGAGAGTCTGGGG -3'
      פריימר הפוך: 5'- TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
      טמפרטורת ההיתוך היא 60 מעלות צלזיוס.
      הערה: רצף התלייה החד-גדילי (CACC) הכרחי כדי להתחבר לווקטור השיבוט של TOPO.
   3. להציג מבנה מוטנטי הקשור ל-DCM על ידי מוטגנזה הנגזרת מפריימר. רצפי הפריימר הם כדלקמן:
      פריימר קדימה: 5 '- GTACAAGCCTCGAGAGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
      פריימר הפוך: 5 '- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATAGTGCTGGT -3'
      טמפרטורת ההיתוך היא 60 מעלות צלזיוס.
   4. הפעל ג'ל אגרוז 0.8% ב -135 וולט למשך 20 דקות, וחתוך את הרצועות המתאימות למוצרי ה- PCR. לאחר מכן חלץ וטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת מיצוי ג'ל (ראה חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
   5. בצע תגובת שיבוט TOPO בהתאם להוראות היצרן (ראה חומרים) והפוך Escherichia coli (pENTR/cMLCK WT, וקטור מוטנטי).
   6. אשר את הרצף הנכון על ידי PCR באמצעות הפריימרים האוניברסליים הבאים של M13. רצפי הפריימר הם כדלקמן:
      פריימר קדימה: 5 '- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      פריימר הפוך: 5 '- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   7. שלב תג FLAG בווקטור pENTR/cMLCK ובצע תגובת רקומבינציה של LR בין MYLK3 לווקטור יעד GateWay (כלומר, pEF-DEST51) בהתאם להוראות היצרן (pEF-DEST51/FLAG-cMLCK WT, מוטנט).
2. תרבית תאים וטרנספקציה לתאי HEK293T
   1. זרע צלחת 100 מ"מ עם 7.5 x 10⁶ תאים HEK293T ותרבית עם DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂ למשך 24 שעות.
   2. הכן את תערובת ריאגנט/DNA של ליפופקציה להעברה לתאי HEK293T על ידי ערבוב של 10 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ב-500 מיקרוליטר של MEM (ראה טבלת חומרים). במקביל, הכינו את התערובת על ידי הוספת 20 מיקרוליטר ליפופקטמין 2000 ב -500 מיקרוליטר MEM.
   3. יש לדגור למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן לערבב את תמיסת הליפופקטמין-DNA.
   4. יש לדגור למשך 20 דקות ב-RT, ואז להוסיף 1 מ"ל של תמיסת ליפופקטמין-DNA לצלחת 100 מ"מ.
      הערה: כדי להימנע מניתוק התאים, הוסיפו את תערובת הליפופקציה בעדינות.
   5. דגרו על התאים המועברים עד 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
3. טיהור חלבון cMLCK רקומביננטי
   1. מניחים את התאים המועברים על קרח ושוטפים פי 3 עם 5 מ"ל PBS.
   2. הכן מאגר ליזה (50 מ"מ Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1% NP40, 0.5 מ"מ EDTA, 0.5 מ"מ EGTA וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH = 7.5) ושמור על קרח.
      הערה: הוסף את קוקטייל מעכב הפרוטאז ממש לפני הבדיקה.
   3. הוסף 1 מ"ל של מאגר ליזה לתאים, השתמש במגרד כדי לקצור תאים לתוך צינור של 1.5 מ"ל ודגירה על קרח למשך 5 דקות.
   4. צנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   5. אוספים סופרנטנט בצינור חדש של 1.5 מ"ל ודוגרים עם 5 מיקרוליטר של אגרוז FLAG-M2 למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס.
   6. צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט ושטוף ב-FLAG-M2 agarose 3x באמצעות מאגר כביסה (50 מ"מ Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1% NP40, 0.5 מ"מ EDTA, 0.5 מ"מ EGTA וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH = 7.5).
   7. יש לסלק את חלבוני הקישור עם מאגר פליטה (50 מ"מ Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1% NP40, 0.5 מ"מ EDTA, 0.5 מ"מ EGTA וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH = 7.5) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   8. צנטריפוגה ב-1,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות והשתמש בסופרנטנט כחלבונים רקומביננטיים המתויגים ב-FLAG.

2. שיבוט וטיהור של קלמודולין רקומביננטי

1. שיבוט של קלמודולין רקומביננטי לפלסמיד
   1. תכנן רצף נוקלאוטידים רציף כדי לייצג את הפלסמיד הסופי.
   2. הגבירו מקטע DNA המקודד קלמודולין אנושי (CALM1) (NM_006888) בשיטת PCR סטנדרטית. רצפי הפריימר הם כדלקמן:
      פריימר קדימה: 5'- CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATT -3'
      פריימר הפוך: 5'- TCATTTTGCAGTCATCATCTGTACGAATTC -3'.
      טמפרטורת ההיתוך היא 60 מעלות צלזיוס.
      הערה: רצפי התלייה החד-גדיליים (CACC) נחוצים לקשירה לווקטור השיבוט של TOPO.
   3. הפעל ג'ל אגרוז 0.8% ב-135 וולט למשך 20 דקות, וחתוך את הרצועות המתאימות למוצרי ה-PCR מהג'ל. לאחר מכן חלץ וטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת מיצוי ג'ל (ראה חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
   4. בצע את תגובת השיבוט של TOPO בהתאם להוראות היצרן (ראה חומרים) והפוך ל-E. coli (pENTR/Calmodulin).
   5. אשר את הרצף הנכון על ידי PCR באמצעות הפריימרים האוניברסליים הבאים של M13. רצף הפריימר הוא כדלקמן:
      פריימר קדימה: 5 '- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      פריימר הפוך: 5 '- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   6. בצע את תגובת הרקומבינציה של LR בין הקלמודולין לווקטור היעד של GateWay (pEF-DEST17) בהתאם להוראות היצרן.
   7. הפוך ל-BL21 (DE3) בעל יכולת כימית של E. coli.
2. תרבית תאים והשראת ביטוי
   1. יש לחסן 5 מ"ל של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין עם מושבה מ-E. coli שעבר טרנספורמציה ולנער למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
   2. מעבירים ל-200 מ"ל של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס עד שהצפיפות האופטית של התרבית (600 ננומטר) מגיעה ל-0.5.
   3. הוסף ארבינוז לריכוז סופי של 0.2% ותרבית למשך 3 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
   4. צנטריפוגה ב-5,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והסר את הסופרנטנט.
   5. השעו ב-10 מ"ל של BugBuster Master Mix המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA וסובבו ב-RT למשך 20 דקות.
   6. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   7. הסופרנטנט שנוצר המכיל את חלבון הקלמודולין המתויג N-terminus His-Tagged נטען על עמודה של שרף TALON Affinity מאוזן עם מאגר קשירת כרומטוגרפיה של יוני מתכת משותק.
   8. יש לסלק את חלבון הקלמודולין הקשור עם מאגר פליטה (50 מ"מ נתרן פוספט [pH = 8.0], 0.3 M NaCl, 0.1% CHAPS ו-0.15 M אימידזול), ואז לחדש ולרכז על ידי צנטריפוגה ב-5,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות מסנן צנטריפוגלי.
   9. ריכוז החלבון הותאם ל-10 מיקרומטר והתמיסה נשמרה על -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

3. בדיקת קינאז במבחנה

הערה: כל השלבים מבוצעים על קרח כדי למנוע את המשך תגובת הקינאז. בנוסף, תמיסות ה-MLCK והמצע מעורבבות בנפרד כדי למנוע תגובה מהירה מדי.

1. הכינו את הפתרונות הבאים והמשיכו על הקרח:
   מאגר קינאז 10x (200 מ"מ HEPES, 10 מ"מ CaCl₂, 50 מ"מ MgCl₂, 0.1% טווין 20, pH = 7.5)
   100 מ"מ DTT
   10 מ"מ ATP
   קלמודולין 500 ננומטר
   cMLCK 100 nM מתויג דגל
   24 μM MLC2v מתויג HIS
   הערה: חלבונים רקומביננטיים מדוללים באמצעות מאגר קינאז 1x בהתאם לריכוזים המצוינים.
2. הכינו 100 מיקרוליטר מתמיסת המאסטר cMLCK על קרח בצינורות של 1.5 מ"ל באמצעות המרכיבים הבאים:
   10 μL של מאגר קינאז 10x
   20 μL של 100 nM cMLCK
   20 μL של 5 μM calmodulin
   8 μL של 100 mM DTT
   42 מיקרוליטר של H₂O
   הערה: כל דגימה מדוללת עם מאגר קינאז פי 10 ומים מזוקקים ונשמרת על קרח.
3. הכן 30 מיקרוליטר של תמיסת מצע בצינור PCR 8 רצועות על קרח בכל ריכוז MLC2v כמתואר בטבלה 1. הריכוזים הסופיים של MLC2v הם 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 ו-12 מיקרומטר.
   הערה: MLC2v רקומביננטי מתויג His, מדולל עם מאגר קינאז פי 10 ומים מזוקקים. נפח תמיסת המצע מותאם ל-30 מיקרוליטר על ידי הוספת מים כדי להשיג את ריכוז ה-MLC2v המתאים.
4. הוסף 10 μL של תמיסת המאסטר MLCK כדי להשיג נפח פתרון תגובה סופי של 40 μL. הריכוז הסופי של כל רכיב בתגובת הקינאז הוא 20 מ"מ HEPES, 1 מ"מ CaCl₂, 5 מ"מ MgCl₂, 0.01% טווין 20, 2 מ"מ DTT, 150 מיקרומטר ATP, 5 ננומטר cMLCK, 250 ננומטר קלמודולין, ו-0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 או 12 מיקרומטר MLC2v (pH = 7.5).
5. מערבבים היטב ומסובבים.
6. דגרו את דגימות התגובה ב-25 מעלות צלזיוס למשך הזמן המצוין.
7. לאחר הדגירה, מדוד את פעילות הקינאז על ידי בדיקת SDS-PAGE עם זיקה לפוספט או בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט .

4. זיקת פוספט SDS-PAGE

הערה: זיקת פוספט SDS-PAGE בוצעה על פי פרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).

1. יוצקים את הג'ל לזיקת פוספט SDS-PAGE.
   1. מערבבים תמיסות ג'ל לערימה כדלקמן: 12% משקל/נפח אקרילאמיד, 0.1% משקל/נפח SDS, 125 מ"מ Tris-HCl (pH = 6.8), 0.1% משקל/נפח אמוניום פרסולפט, ו-0.5% נפח/נפח N, N, N', N'- טטרמתיל-אתילנדיאמין.
   2. ערבבו תמיסות ג'ל ממיסות כדלקמן: 12% משקל/נפח אקרילאמיד, 30 מיקרומטר אקרילאמיד פוסטאג, 60 מיקרומטר MnCl₂, 0.1% משקל/נפח SDS, 375 מ"מ Tris-HCl (pH = 8.8), 0.05% משקל/נפח אמוניום פרסולפט, ו-0.25% נפח/נפח N, N, N', N'- טטרמתיל-אתילנדיאמין.
2. הכן דגימה לאלקטרופורזה.
   1. מוסיפים ומערבבים 1 מ"מ MnCl₂ לדגימה מתגובת קינאז במבחנה.
3. בצע אלקטרופורזה וכתמים מערביים.
   1. הפעל את הג'ל ב-150 וולט למשך 80 דקות במאגר רץ (0.1% משקל/נפח SDS, 25 מ"מ טריס ו-192 מ"מ גליצין).
   2. לאחר אלקטרופורזה, יש להשרות את הג'ל במאגר העברה EDTA (+) (10 מ"מ EDTA, 50 מ"מ Tris, 380 מ"מ גליצין, 0.000375% משקל/נפח SDS ו-20% משקל/נפח אתנול) למשך 10 דקות ולאחר מכן במאגר העברה למשך 10 דקות.
   3. העבירו חלבונים לקרום PVDF ב-15 וולט למשך 30 דקות במאגר העברה.
   4. נדנד את הממברנה ברציפות עם חלב יבש ללא שומן למשך 30 דקות ב-RT. לאחר החסימה יש לשטוף את הממברנה פי 3 עם TTBS (50 מ"מ Tris, 150 מ"מ NaCl, 0.001% טווין).
   5. יש להשרות את הממברנה עם הנוגדן העיקרי (anti-MLC2v, 1:4,000; Abcam ab92721) בלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   6. שטפו את הממברנה פי 3 עם TTBS (50 מ"מ Tris, 150 מ"מ NaCl ו-0.001% Tween).
   7. יש להשרות את הממברנה עם הנוגדן המשני (HRP-coupled goat anti-rabbit 1:8,000; Cappel, #55696) למשך שעה אחת ב-RT.
   8. שוטפים את הממברנה פי 3 עם TTBS.
4. זיהוי וניתוח חלבונים על הממברנה.
   1. הוסף מגיב זיהוי ECL (מגיב זוהר כימי משופר) לממברנה למשך דקה אחת ב-RT.
   2. זהה את החלבונים על הממברנה באמצעות LAS-4000 בזמן האופטימלי.
   3. כמת את ה-MLC2v הזרחני והלא זרחני, תוך הפחתת צפיפות הרקע באמצעות תוכנת ImageQuant TL.

5. בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט

הערה: בדיקת זיהוי ה-ADP הביו-לומינסנט בוצעה על פי פרוטוקול היצרן.

1. עצור את תגובת הקינאז על ידי הוספת 40 מיקרוליטר של מגיב דלדול ATP לתמיסת תגובת בדיקת הקינאז. מערבבים היטב ודוגרים במשך 30 דקות ב-RT.
2. הוסף 80 μL של מגיב זיהוי ADP. מערבבים היטב ודוגרים במשך 30 דקות ב-RT.
3. מדוד את הזוהר באמצעות לומינומטר עם זמן אינטגרציה מרבי מוצע של 0.5 שניות לבאר.
4. המר את עוצמת הזוהר לריכוז ADP באמצעות עקומת כיול.
5. חשב את כמות הפוספטים המשמשים לזרחון MLC2v.
   הערה: סך ה-ADP המיוצר במהלך תגובת הקינאז נמדד כמתואר לעיל. ADP ברקע, כולל זרחון עצמי של cMLCK, נמדד על סמך תגובה ללא MLC2v, וכמות ה-ADP המשמשת לזרחון MLC2v מוערכת על ידי הפחתת ADP ברקע מסך ה-ADP.

6. ניתוח נתונים

1. התאמת נתונים למשוואת מיכאליס-מנטן באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתאימה. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן.

השיטה הקלאסית למדידת פעילות קינאז היא בדיקה מבוססת רדיומטריה המכמתת את הפוספט המסומן ברדיו המשולב במצע הקינאז. עבור השיטה המוצגת כאן, פותחה בדיקת קינאז cMLCK לא רדיואקטיבית במבחנה באמצעות cMLCK מסוג בר מטוהר (איור 1A), MLC2v וקלמודולין (איור 1B), ופ...

המחקר הנוכחי נערך כדי להעריך האם ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של שיטות לא רדיואקטיביות, בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט ו-SDS-PAGE עם זיקה לפוספט כדי לקבוע את הפעילות של cMLCK. חיוני לבצע את תגובות הקינאז בטמפרטורה ובזמן התגובה האופטימליים. הגדלת כל אחד מאלה תקדם במהירות ובעוצמה את תג?...

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק JSPS KAKENHI מספר JP17K09578 ו-JP18H04050.