A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
מחקר זה מתאר פרוטוקולים לשיטות לא רדיומטריות, בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט ו-SDS-PAGE עם זיקה לפוספט, כדי לקבוע את פעילות הקינאז של קינאז שרשרת קלה של מיוזין לב (cMLCK) ואת רמת הזרחן של המצע שלו, שרשרת קלה רגולטורית של מיוזין (MLC2v).
קינאז שרשרת קלה מווסת מיוזין ספציפי ללב (cMLCK) מווסת את מבנה סרקומר הלב והתכווצות על ידי זרחון האיזופורם החדר של שרשרת האור הרגולטורית של המיוזין (MLC2v). רמות הזרחן של MLC2v מופחתות באופן משמעותי בלבבות כושלים, מה שמעיד על החשיבות הקלינית של הערכת הפעילות של cMLCK ורמת הזרחן של MLC2v כדי להבהיר את הפתוגנזה של אי ספיקת לב. מאמר זה מתאר שיטות לא רדיואקטיביות להערכת הפעילות של רמות זרחון cMLCK ו-MLC2v. תגובות קינאז במבחנה מבוצעות באמצעות cMLCK רקומביננטי עם קלמודולין רקומביננטי ו-MLC2v בנוכחות ATP וסידן ב-25 מעלות צלזיוס, שאחריהן בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט או SDS-PAGE בעל זיקה לפוספט. במחקר המייצג, בדיקת זיהוי ה-ADP הביו-לומינסנט הראתה עלייה ליניארית קפדנית של האות בריכוזי cMLCK בין 1.25 ננומטר ל-25 ננומטר. זיקה לפוספט SDS-PAGE הראתה גם עלייה ליניארית של MLC2v זרחני באותו טווח ריכוז cMLCK. לאחר מכן, נבדקה תלות הזמן של התגובות בריכוז של 5 ננומטר cMLCK. בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט הראתה עלייה ליניארית באות במהלך 90 דקות של התגובה. באופן דומה, SDS-PAGE בעל זיקה לפוספט הראה עלייה תלוית זמן של MLC2v זרחני. הפרמטרים הביוכימיים של cMLCK עבור MLC2v נקבעו על ידי תרשים מיכאליס-מנטן באמצעות מבחן זיהוי ADP ביולומינסנצי. ה-Vהמקסימלי היה 1.65 ±-0.10 מול/דקה/מול קינאז וה-K m הממוצע היה בסביבות 0.5 מיקרומטר ארה"ב ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, נמדדה הפעילות של סוג הבר ו-p.Pro639Valfs*15 cMLCK המוטנטי הקשור לקרדיומיופתיה מורחבת. מבחן זיהוי ה-ADP הביו-לומינסנט ו-SDS-PAGE עם זיקה לפוספט זיהו נכון פגמים בפעילות cMLCK ובזרחון MLC2v, בהתאמה. לסיכום, שילוב של מבחן זיהוי ADP ביולומינסנט ו-SDS-PAGE עם זיקה לפוספט הוא שיטה פשוטה, מדויקת, בטוחה, בעלות נמוכה וגמישה למדידת פעילות cMLCK ורמת הזרחן של MLC2v.
קינאז השרשרת הקלה הרגולטורית של המיוזין הספציפי ללב (cMLCK) המקודד על ידי הגן MYLK3 הוא הקינאז האחראי בעיקר לשמירה על הזרחן של שרשרת האור הרגולטורית של מיוזין חדר הלב 2 (MLC2v)1,2. על ידי זרחון MLC2v ב-Ser-15, cMLCK מקדם את ארגון סרקומר1 ומגביר את התכווצות הלב 2,3 כתוצאה מהגברת היווצרות גשרים צולבים ולכן עלייה בנוקשות זרוע המנוף של מיוזין II4. פגמים בפעילות cMLCK או רמות מופחתות של זרחון MLC2v תורמים להתפתחות אי ספיקת לב במודלים של בעלי חיים 3,5,6. לפיכך, פעילות cMLCK ממלאת תפקידים קריטיים בהתכווצות הלב במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד על ידי ויסות רמת הזרחן של MLC2v.
קרדיומיופתיה מורחבת (DCM) מאופיינת בתפקוד סיסטולי וגודל חדר שמאל מוגדל ומהווה גורם עיקרי לאי ספיקת לב והשתלות לב. עד כה זוהו יותר מ-40 גנים כמוטציות הגורמות ל-DCM7. לאחרונה זוהתה מוטציה חדשה ב-MYLK3 הקשורה ל-DCM (p.Pro639Valfs*15) המבטלת לחלוטין את פעילות הקינאז עקב חיתוך של חלבון cMLCK בחלק האמצעי של התחום הקטליטי שלו8. דווח גם על שני מקרים של מוטציות משפחתיות הקשורות ל-DCM ב-MYLK3 המראות פעילות מדוכאת או מבוטלת של cMLCK9. לפיכך, פעילות cMLCK מדוכאת או מבוטלת ב-DCM משפחתי עשויה לתרום להתפתחות המחלה על ידי הפחתת רמות הזרחן של MLC2v. רמות הזרחן של MLC2v מופחתות באופן משמעותי גם בלבבות אנושיים כושלים גם ללא מוטציות ב-MYLK310,11. לפיכך, נראה כי הפחתת רמות הזרחן של MLC2v שכיחה באי ספיקת לב אנושית, מה שמצביע על כך שהערכת פעילות cMLCK ורמות זרחון MLC2v חשובה מבחינה קלינית. יש צורך להסביר כיצד רמות הזרחן המופחתות של MLC2v תורמות להתכווצות לב מדוכאת. בהתאם לכך, מבחנים המודדים את פעילות cMLCK ורמות זרחון MLC2v חשובים ביותר להבהרת הפתוגנזה של אי ספיקת לב.
השיטה הקלאסית למדידת פעילות cMLCK היא בדיקה מבוססת רדיומטריה המכמתת את השילוב של [γ-32P] מ-ATP המסומן רדיואקטיבי ב-MLC2v2. עם זאת, בשל אופיו המסוכן הוא דורש שיקולים בטיחותיים וסביבתיים מיוחדים, ועלות פינוי הפסולת גבוהה. בנוסף, זמן מחצית החיים הקצר של32 מגביל את הגמישות של הבדיקה הרדיומטרית. כדי להתגבר על חסרונות אלה, פותחו טכניקות חלופיות לבדיקת חלבון קינאז לא רדיומטרי12. בדיקת זיהוי ה-ADP הביולוגית שפותחה על ידי תאגיד פרומגה מודדת ADP שנוצר על ידי תגובת החלבון קינאז ללא שימוש ברדיואיזוטופים13. הוא מראה תוצאות דומות לבדיקה הרדיומטרית עבור חלבון קינאזות עם רמות פעילות שונות13. מכיוון שבדיקת זיהוי ה-ADP הביו-לומינסנט מודדת ADP המיוצר על ידי תגובת קינאז, נעשה שימוש ב-SDS-PAGE במקביל לבדיקת זיהוי ADP ביו-לומינסנט כדי לאמת אם MLC2v אכן זרחני. Phosphate-affinity SDS-PAGE היא טכניקת אלקטרופורזה של זיקה לפוספט שיכולה לזהות שינויים בניידות של חלבוני סובסטרט זרחניים בהשוואה לעמיתיהם הלא זרחניים14.
מאמר זה מתאר פרוטוקולים למדידת הפעילות של cMLCK ורמת הזרחן של המצע שלו, MLC2v, בשיטות לא-רדיואקטיביות. לאחר ביצוע תגובת קינאז במבחנה, הן בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט והן SDS-PAGE עם זיקה לפוספט משמשים לחישוב הערכים הביוכימיים של MLCK ורמת הזרחן של MCL2v, בהתאמה. בסך הכל, פרוטוקול המשלב את שתי בדיקות הקינאז הלא רדיואקטיביות הוא בעל ערך לחקר קינאזות.
1. שיבוט וטיהור של סוג בר רקומביננטי ומוטציה cMLCK הקשורה ל-DCM
2. שיבוט וטיהור של קלמודולין רקומביננטי
3. בדיקת קינאז במבחנה
הערה: כל השלבים מבוצעים על קרח כדי למנוע את המשך תגובת הקינאז. בנוסף, תמיסות ה-MLCK והמצע מעורבבות בנפרד כדי למנוע תגובה מהירה מדי.
4. זיקת פוספט SDS-PAGE
הערה: זיקת פוספט SDS-PAGE בוצעה על פי פרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).
5. בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט
הערה: בדיקת זיהוי ה-ADP הביו-לומינסנט בוצעה על פי פרוטוקול היצרן.
6. ניתוח נתונים
השיטה הקלאסית למדידת פעילות קינאז היא בדיקה מבוססת רדיומטריה המכמתת את הפוספט המסומן ברדיו המשולב במצע הקינאז. עבור השיטה המוצגת כאן, פותחה בדיקת קינאז cMLCK לא רדיואקטיבית במבחנה באמצעות cMLCK מסוג בר מטוהר (איור 1A), MLC2v וקלמודולין (איור 1B), ופ...
המחקר הנוכחי נערך כדי להעריך האם ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של שיטות לא רדיואקטיביות, בדיקת זיהוי ADP ביולומינסנט ו-SDS-PAGE עם זיקה לפוספט כדי לקבוע את הפעילות של cMLCK. חיוני לבצע את תגובות הקינאז בטמפרטורה ובזמן התגובה האופטימליים. הגדלת כל אחד מאלה תקדם במהירות ובעוצמה את תג?...
למחברים אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק JSPS KAKENHI מספר JP17K09578 ו-JP18H04050.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
30% acrylamide/Bis solution | Bio-Rad | 1610156 | Store at 4ºC |
acrylamide | Bio-Rad | 1610156 | Store at 4ºC |
Amicon Ultra-15 | Merck | UFC901008 | |
ammonium persulfate | Wako | 019-03435 | |
ampicillin sodium | Wako | 014-23302 | Store at -20ºC |
BugBuster | Milipore | 71456-4 | Store at 4ºC |
CaCl2 | Wako | 031-00435 | |
CHAPS | Dojindo | 349-04722 | Store at 4ºC |
chemiluminescence imaging analyzer TriStar2 | CBERTHOLD TECHNOLOGIES | LB942-A | |
dithiothreitol | Wako | 047-08973 | Store at -20ºC |
ECL (Enhanced Chemi Luminescence) reagent | GE Healthcare | RPN2106 | Mix reagent 1 and reagent 2 in equal amounts |
EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
Ethanol | Wako | 057-00456 | |
FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | Store at -20ºC |
FLAG agarose | Merck | A2220 | Store at -20ºC |
FLAG peptide | Merck | F3290-4MG | Store at 4ºC |
GateWay pEF-DEST51 Vector | Invitrogen | 12285011 | Store at -20ºC |
glycine | Sigma-Aldrich | 12-1210-5 | |
HEPES | Dojindo | 342-01375 | |
Igepal CA-630 (NP40) | Sigma-Aldrich | 13021-500ML | |
Imiadasole | Wako | 095-00015 | |
L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256-25G | Store at -20ºC |
LAS-4000 | GE Healthcare | 28955810 | |
LB | Merck | WM841485 824 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
Manganase (II) Chloride Tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
MgCl2 | nacalai-tesque | 20909-42 | |
N, N, N’, N’- tetramethylethylenediamin | Wako | 110-18-9 | |
NaCl | Wako | 191-01665 | |
OneShot BL21 AI | Invitrogen | 44-0184 | Store at -80ºC |
OptiMEM | gibco | 31985-070 | Store at 4ºC |
PBS | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | Store at 4ºC |
penicillin streptmycin | gibco | 15140-122 | Store at -20ºC |
pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | Store at -20ºC |
Phos-tag Acrylamide | Wako | AAL-107 | Store at 4ºC |
Promega ADP-Glo | Promega | V9104 | Store at -20ºC |
protease inhibitor cock-tail | nacalai-tesque | 25955-11 | |
PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | Pore size : 0.45 μm |
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | |
SDS | Wako | 191-07145 | |
sodium phosphate | Wako | 192-02815 | |
TALON affinity resin | TaKaRa | 635504 | Store at 4ºC |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
Tween 20 | Wako | 167-11515 | Store at 4ºC |
Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultra Pure ATP, 100mM | Promega | V703B-C | Store at -20ºC |
Urea | Sigma-Aldrich | U0631-1KG |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved