Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase 분석

이 연구는 심장 미오신 경쇄 키나아제(cMLCK)의 키나아제 활성과 그 기질인 미오신 조절 경쇄(MLC2v)의 인산화 수준을 결정하기 위한 비방사성 방법, 생물 발광 ADP 검출 분석 및 인산염 친화성 SDS-PAGE에 대한 프로토콜을 설명합니다.

심장 특이적 미오신 조절 경쇄 키나아제(cMLCK)는 미오신 조절 경쇄(MLC2v)의 심실 동형을 인산화하여 심장 육종 구조와 수축성을 조절합니다. MLC2v 인산화 수준은 고장난 심장에서 현저히 감소하며, 이는 심부전의 발병 기전을 밝히기 위해 cMLCK의 활성과 MLC2v의 인산화 수준을 평가하는 것이 임상적으로 중요하다는 것을 나타냅니다. 이 논문은 cMLCK의 활성과 MLC2v 인산화 수준을 모두 평가하기 위한 비방사성 방법을 설명합니다. 체외 키나아제 반응은 25°C에서 ATP 및 칼슘이 있는 상태에서 재조합 칼모듈린 및 MLC2v와 재조합 cMLCK를 사용하여 수행한 후 생물발광 ADP 검출 분석 또는 인산염 친화성 SDS-PAGE를 수행합니다. 대표적인 연구에서 생물 발광 ADP 검출 분석은 1.25nM에서 25nM 사이의 cMLCK 농도에서 신호의 엄격한 선형 증가를 보여주었습니다. 인산염 친화성 SDS-PAGE는 또한 동일한 cMLCK 농도 범위에서 인산화된 MLC2v의 선형 증가를 보여주었습니다. 다음으로, 반응의 시간 의존성을 5nM cMLCK의 농도에서 조사했습니다. 생물 발광 ADP 검출 분석은 반응의 90분 동안 신호의 선형 증가를 보여주었습니다. 유사하게, 인산염 친화성 SDS-PAGE는 인산화된 MLC2v의 시간에 따른 증가를 보여주었습니다. MLC2v에 대한 cMLCK의 생화학적 매개변수는 생물 발광 ADP 검출 분석을 사용하여 Michaelis-Menten 플롯에 의해 결정되었습니다. V_max 는 1.65 ± 0.10 mol / min / mol kinase이고 평균 K_m 은 25 ° C에서 약 0.5 USA μM이었다. 다음으로, 야생형 및 확장성 심근병증 관련 p.Pro639Valfs*15 돌연변이 cMLCK의 활성을 측정했습니다. 생물 발광 ADP 검출 분석 및 인산염 친화성 SDS-PAGE는 각각 cMLCK 활성 및 MLC2v 인산화의 결함을 올바르게 감지했습니다. 결론적으로, 생물 발광 ADP 검출 분석법과 인산염 친화성 SDS-PAGE의 조합은 cMLCK 활성과 MLC2v의 인산화 수준을 측정하는 간단하고 정확하며 안전하고 저렴하고 유연한 방법입니다.

MYLK3 유전자에 의해 암호화된 심장 특이적 미오신 조절 경쇄 키나아제(cMLCK)는 심장 심실 조절 미오신 조절 경쇄 2(MLC2v)의 인산화를 유지하는 데 주로 책임이 있는 키나아제입니다^1,2. Ser-15에서 MLC2v를 인산화시킴으로써, cMLCK는 교차 다리 형성을 증가시켜 미오신 II⁴의 레버 암 강성을 증가시킴으로써 sarcomere 조직¹을 촉진하고 심장 수축성 ^2,3을 강화합니다. cMLCK 활성의 결함 또는 MLC2v 인산화 수치 감소는 동물 모델에서 심부전 발병에 기여합니다 ^3,5,6. 따라서 cMLCK 활성은 MLC2v의 인산화 수준을 조절함으로써 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 심장 수축성에 중요한 역할을 합니다.

확장성 심근병증(DCM)은 수축기 기능 장애와 좌심실 크기 확대를 특징으로 하며 울혈성 심부전 및 심장 이식의 주요 원인입니다. 지금까지 40개 이상의 유전자가 DCM을 유발하는 돌연변이로 확인되었다⁷. 최근에는 촉매 도메인⁸의 중간 부분에서 cMLCK 단백질의 절단으로 인해 키나아제 활성을 완전히 제거하는 새로운 DCM 관련 MYLK3 돌연변이(p.Pro639Valfs*15)가 확인되었습니다. MYLK3에서 cMLCK 활성이 저하되거나 폐지된 것으로 보이는 가족성 DCM 관련 돌연변이 2건도 보고되었다⁹. 따라서, 가족성 DCM에서 cMLCK 활성이 저하되거나 폐지되면 MLC2v 인산화 수치가 감소하여 질병의 발병에 기여할 수 있습니다. MLC2v 인산화 수준은 MYLK3^10,11에 돌연변이가 없더라도 실패한 인간 심장에서 크게 감소합니다. 따라서 MLC2v 인산화 수준의 감소는 인간 심부전에서 흔한 것으로 보이며, 이는 cMLCK 활성 및 MLC2v 인산화 수준의 평가가 임상적으로 중요하다는 것을 나타냅니다. 감소된 MLC2v 인산화 수준이 어떻게 심장 수축성 저하에 기여하는지 설명할 필요가 있습니다. 따라서 cMLCK 활성과 MLC2v 인산화 수준을 측정하는 분석은 심부전의 발병 기전을 밝히는 데 매우 중요합니다.

cMLCK 활성을 측정하는 고전적인 방법은 방사성으로 표지된 ATP에서 MLC2v²로의 [^γ-32P]의 통합을 정량화하는 방사성 기반 분석법입니다. 그러나 유해성으로 인해 특별한 안전 및 환경 적 고려가 필요하며 폐기물 처리 비용이 높습니다. 또한,³² P의 짧은 반감기는 방사성 분석의 유연성을 제한합니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 대안적인 비방사성 단백질 키나아제 분석 기술이 개발되었습니다¹². Promega Corporation에서 개발한 생물발광 ADP 검출 분석법은 방사성 동위원소를 사용하지 않고 단백질 키나아제 반응에 의해 생성된 ADP를 측정합니다¹³. 이는 다양한 수준의 활성을 가진 단백질 키나아제에 대한 방사성 분석법과 유사한 결과를 보여줍니다¹³. 생물발광 ADP 검출 분석은 키나아제 반응에 의해 생성된 ADP를 측정하기 때문에 MLC2v가 실제로 인산화되는지 여부를 확인하기 위해 생물 발광 ADP 검출 분석과 병행하여 인산염 친화성 SDS-PAGE를 사용했습니다. 인산염 친화성 SDS-PAGE는 인산화되지 않은 기질 단백질과 비교하여 인산화된 기질 단백질의 이동성 변화를 감지할 수 있는 인산염 친화성 전기영동 기술입니다¹⁴.

이 기사에서는 비방사성 방법을 사용하여 cMLCK의 활성과 기판 MLC2v의 인산화 수준을 측정하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. in vitro kinase 반응을 수행한 후 생물발광 ADP 검출 분석법과 인산염 친화성 SDS-PAGE를 모두 사용하여 MLCK의 생화학적 값과 MCL2v의 인산화 수준을 각각 계산합니다. 전반적으로, 두 가지 비방사성 키나아제 분석을 결합한 프로토콜은 키나아제 연구에 유용합니다.

1. 재조합 야생형 및 DCM 관련 돌연변이 cMLCK의 클로닝 및 정제

1. 재조합 심장 미오신 경쇄 키나아제를 플라스미드로 클로닝
   1. 최종 플라스미드를 나타내기 위해 연속 뉴클레오티드 염기서열을 설계합니다.
   2. 표준 PCR 방법을 사용하여 human MYLK3 (NM_1829493.3)를 코딩하는 DNA 단편을 증폭합니다. 프라이머 서열은 다음과 같습니다.
      포워드 프라이머: 5'- CACCATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGTCTGGGG -3'
      리버스 프라이머: 5'- TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
      용융 온도는 60 °C입니다.
      참고: CACC(single-stranded overhang sequence)는 TOPO 클로닝 벡터를 접합하는 데 필요합니다.
   3. 프라이머 유래 돌연변이 유발에 의한 DCM 관련 돌연변이 구조를 도입합니다. 프라이머 서열은 다음과 같습니다.
      앞으로 뇌관: 5'- GTACAAGCCTCGAGAGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
      리버스 프라이머: 5'- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATGTAGTGCTGGT -3'
      용융 온도는 60 °C입니다.
   4. 0.8% 아가로스 겔을 135V에서 20분 동안 실행하고 PCR 산물에 해당하는 밴드를 잘라냅니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트( 재료 참조)를 사용하여 PCR 산물을 추출하고 정제합니다.
   5. 제조업체의 지침( 재료 참조)에 따라 TOPO 클로닝 반응을 수행하고 대장균 (pENTR/cMLCK WT, 돌연변이 벡터)을 형질전환시킵니다.
   6. 다음 범용 M13 프라이머를 사용하여 PCR로 올바른 염기서열을 확인합니다. 프라이머 서열은 다음과 같습니다.
      앞으로 뇌관: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      리버스 프라이머: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   7. FLAG-tag를 pENTR/cMLCK 벡터에 통합하고 제조업체의 지침(pEF-DEST51/FLAG-cMLCK WT, 돌연변이)에 따라 MYLK3 와 GateWay 목적지 벡터(즉, pEF-DEST51) 간의 LR 재조합 반응을 수행합니다.
2. 세포 배양 및 HEK293T 세포로의 transfection
   1. 7.5 x 10⁶ HEK293T 세포가 있는 100mm 접시에 씨를 뿌리고 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM으로 배양합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂ 24 시간 동안 배양합니다.
   2. 500μL의 MEM에 10μg의 플라스미드 DNA를 혼합하여 HEK293T세포에 transfection하기 위한 Lipofection 시약/DNA 혼합물을 준비합니다( 재료 표 참조). 동시에 MEM 500μL에 20μL의 Lipofectamine 2000을 첨가하여 혼합물을 준비합니다.
   3. 실온(RT)에서 5분 동안 배양한 다음 Lipofectamine-DNA 용액을 혼합합니다.
   4. RT에서 20분 동안 배양한 다음 100mm 접시에 Lipofectamine-DNA 용액 1mL를 추가합니다.
      참고: 세포가 분리되지 않도록 lipofection 혼합물을 부드럽게 첨가하십시오.
   5. 형질주입된 세포를 37°C에서 최대 48시간 동안 5%_CO2로 배양합니다.
3. 재조합 cMLCK 단백질의 정제
   1. 형질주입된 세포를 얼음 위에 놓고 PBS 5mL로 3회 세척합니다.
   2. 용해 완충액(50mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, 1% NP40, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA 및 프로테아제 억제제 칵테일, pH = 7.5)을 준비하고 얼음에 보관합니다.
      참고: 분석 직전에 프로테아제 억제제 칵테일을 추가합니다.
   3. 세포에 1mL의 용해 완충액을 추가하고, 스크레이퍼를 사용하여 1.5mL 튜브로 세포를 채취한 다음, 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
   4. 20,000 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리기.
   5. 새로운 1.5 mL 튜브에 상층액을 모으고 4 °C에서 1 시간 동안 5 μL의 FLAG-M2 아가로스로 배양합니다.
   6. 1,000 ° C에서 1 분 동안 4 x g 에서 원심 분리기를 제거한 다음 상층액을 제거하고 세척 완충액 (50 m Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1 % NP40, 0.5 m M EDTA, 0.5 m M EGTA 및 프로테아제 억제제 칵테일, pH = 7.5)을 사용하여 FLAG-M2 아가로 로즈 3 배로 세척합니다.
   7. 결합 단백질을 용출 완충액(50mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, 1% NP40, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA 및 프로테아제 억제제 칵테일, pH = 7.5)으로 4°C에서 30분 동안 용리합니다.
   8. 1,000 x g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리하고 상등액을 재조합 FLAG 태그 단백질로 사용합니다.

2. 재조합 칼모듈린의 클로닝 및 정제

1. 재조합 칼모듈린을 플라스미드로 클로닝
   1. 최종 플라스미드를 나타내기 위해 연속 뉴클레오티드 염기서열을 설계합니다.
   2. 표준 PCR 방법을 사용하여 NM_006888(human calmodulin)을 코딩하는 DNA 단편을 증폭합니다. 프라이머 서열은 다음과 같습니다.
      포워드 프라이머: 5'- CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATT -3'
      리버스 프라이머: 5'- TCATTTTGCAGTCATCATCTGTACGAATTC -3'.
      용융 온도는 60 °C입니다.
      참고: 단일 가닥 오버행 염기서열(CACC)은 TOPO 클로닝 벡터를 연결하는 데 필요합니다.
   3. 0.8% 아가로스 겔을 135V에서 20분 동안 실행하고 PCR 산물에 해당하는 밴드를 겔에서 잘라냅니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트( 재료 참조)를 사용하여 PCR 산물을 추출하고 정제합니다.
   4. 제조업체의 지침( 재료 참조)에 따라 TOPO 클로닝 반응을 수행하고 E. coli (pENTR/Calmodulin)로 형질전환시킵니다.
   5. 다음 범용 M13 프라이머를 사용하여 PCR로 올바른 염기서열을 확인합니다. 시퀀싱된 프라이머는 다음과 같습니다.
      앞으로 뇌관: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      리버스 프라이머: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   6. 제조업체의 지침에 따라 칼모듈린과 GateWay 목적지 벡터(pEF-DEST17) 간의 LR 재조합 반응을 수행합니다.
   7. BL21 (DE3) 화학적으로 적극적인 대장균으로 변형됩니다.
2. 세포 배양 및 발현 유도
   1. 100μg/mL 암피실린을 함유한 LB 배지 5mL에 형질전환된 대장균 의 콜로니를 접종하고 37°C에서 밤새 흔듭니다.
   2. 100μg/mL 암피실린이 포함된 200mL의 LB 배지로 옮기고 배양 광학 밀도(600nm)가 0.5에 도달할 때까지 37°C에서 배양합니다.
   3. 아라비노스를 최종 농도 0.2%에 첨가하고 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
   4. 5,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.
   5. EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일이 함유된 BugBuster Master Mix 10mL에 현탁하고 실온에서 20분 동안 회전합니다.
   6. 16,000 x g , 4°C에서 10분 동안 원심분리기.
   7. N-terminus His-tagged calmodulin 단백질을 포함하는 생성된 상등액을 고정화된 금속 이온 크로마토그래피 결합 완충액과 평형을 이룬 TALON Affinity Resin의 컬럼에 적재했습니다.
   8. 결합된 His-tagged 칼모듈린 단백질을 용리 완충액(50mM sodium phosphate[pH = 8.0], 0.3M NaCl, 0.1% CHAPS 및 0.15M imidazole)으로 용리한 다음 다시 접히고 원심 필터를 사용하여 4°C에서 5,000 x g 의 원심분리로 농축합니다.
   9. 단백질 농도를 10μM로 조정하고 용액을 사용할 때까지 -80°C로 유지했습니다.

3. In vitro kinase 분석

참고: 모든 단계는 키나아제 반응이 진행되는 것을 방지하기 위해 얼음 위에서 수행됩니다. 또한 MLCK 및 기질 용액은 지나치게 빠른 반응을 피하기 위해 별도로 혼합됩니다.

1. 다음 해결 방법을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
   10x 키나아제 완충액(200mM HEPES, 10mM CaCl₂, 50mM MgCl₂, 0.1% 트윈 20, pH = 7.5)
   100 mM DTT
   10mM ATP
   500nM 칼모듈린
   100nM FLAG 태그가 지정된 cMLCK
   24μM His 태그 MLC2v
   참고: 재조합 단백질은 표시된 농도에 따라 1x kinase buffer를 사용하여 희석됩니다.
2. 다음 성분을 사용하여 1.5mL 튜브의 얼음에 100μL의 cMLCK 마스터 용액을 준비합니다.
   10μL의 10x 키나아제 완충액
   20μL의 100nM cMLCK
   20 μL의 5 μM 칼모듈린
   8 μL의 100 mM DTT
   H₂O의 42 μL
   참고: 각 샘플은 10x 키나아제 완충액과 증류수로 희석하여 얼음에 보관합니다.
3. 표 1에 설명된 대로 각 MLC2v 농도의 얼음 위에 8 스트립 PCR 튜브에 30μL의 기질 용액을 준비합니다. 최종 MLC2v 농도는 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 및 12μM입니다.
   참고: 재조합 His-tagged MLC2v는 10x 키나아제 완충액과 증류수로 희석됩니다. 기판 용액의 부피는 적절한 MLC2v 농도를 얻기 위해 물을 첨가하여 30μL로 조정됩니다.
4. 10 μL의 MLCK 마스터 용액을 추가하여 40 μL의 최종 반응 용액 부피를 얻을 수 있습니다. 키나아제 반응에서 각 성분의 최종 농도는 20 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0.01% Tween 20, 2 mM DTT, 150 μM ATP, 5 nM cMLCK, 250 nM calmodulin 및 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 또는 12 μM MLC2v(pH = 7.5)입니다.
5. 잘 섞고 스핀다운하십시오.
6. 표시된 시간 동안 25°C에서 반응 샘플을 배양합니다.
7. 배양 후 인산염 친화성 SDS-PAGE 또는 생물 발광 ADP 검출 분석으로 키나아제 활성을 측정합니다.

4. 인산염 친화성 SDS-PAGE

참고: 인산염 친화성 SDS-PAGE는 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다( 재료 표 참조).

1. 인산염 친화성 SDS-PAGE를 위한 젤을 붓습니다.
   1. 혼합 스태킹 겔 용액 : 12 % 중량 / 부피 아크릴 아미드, 0.1 % 중량 / 부피 SDS, 125 mM 트리스 -HCl (pH = 6.8), 0.1 % 중량 / 부피 과황산 암모늄 및 0.5 % 부피 / 부피 N, N, N', N'- 테트라 메틸 에틸렌 디아민.
   2. 다음과 같이 분해 겔 용액을 혼합하십시오 : 12 % wt / vol 아크릴 아미드, 30 μM Phos-tag 아크릴 아미드, 60 μM MnCl₂, 0.1 % wt / vol SDS, 375 mM Tris-HCl (pH = 8.8), 0.05 % wt / vol 과황산 암모늄 및 0.25 % vol / vol N, N, N', N'- 테트라 메틸 에틸렌 디아민.
2. 전기영동을 위한 시료를 준비합니다.
   1. 시험관 내 키나아제 반응에서 샘플에 1mM MnCl₂ 를 첨가하고 혼합합니다.
3. 전기영동 및 웨스턴 블로팅을 수행합니다.
   1. 러닝 버퍼(0.1% wt/vol SDS, 25mM Tris 및 192mM 글리신)에서 150V에서 80분 동안 젤을 실행합니다.
   2. 전기영동 후 겔을 EDTA(+) 전달 버퍼(10mM EDTA, 50mM Tris, 380mM 글리신, 0.000375% wt/vol SDS 및 20% wt/vol 에탄올)에 10분 동안 담근 다음 전달 버퍼에 10분 동안 담근다.
   3. 전달 버퍼에서 30분 동안 15V에서 PVDF 멤브레인으로 단백질을 전달합니다.
   4. RT에서 30분 동안 무지방 분유로 멤브레인을 계속 흔듭니다. 차단 후 멤브레인을 TTBS(50mM Tris, 150mM NaCl, 0.001% Tween)로 3x 세척합니다.
   5. 1차 항체(anti-MLC2v, 1:4,000; Abcam ab92721) 4°C에서 하룻밤.
   6. TTBS(50mM Tris, 150mM NaCl 및 0.001% Tween)로 멤브레인을 3회 세척합니다.
   7. 멤브레인을 2차 항체(HRP-coupled goat anti-rabbit 1:8,000; Cappel, #55696) RT에서 1시간 동안.
   8. TTBS로 멤브레인을 3번 세척합니다.
4. 멤브레인의 단백질을 검출하고 분석합니다.
   1. RT에서 1분 동안 ECL(Enhanced Chemi Luminescence reagent) 검출 시약을 멤브레인에 추가합니다.
   2. 최적의 시간에 LAS-4000을 사용하여 멤브레인의 단백질을 검출합니다.
   3. ImageQuant TL 소프트웨어를 사용하여 인산화 및 비인산화 MLC2v를 정량화하고 배경 밀도 측정을 뺍니다.

5. 생물 발광 ADP 검출 분석

참고: 생물발광 ADP 검출 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. kinase assay 반응 용액에 40μL의 ATP 고갈 시약을 첨가하여 kinase 반응을 중지합니다. 잘 섞어 RT에서 30분 동안 배양합니다.
2. 80μL의 ADP 검출 시약을 추가합니다. 잘 섞어 RT에서 30분 동안 배양합니다.
3. 웰당 제안된 최대 통합 시간이 0.5초인 광도계를 사용하여 발광을 측정합니다.
4. 검량선을 사용하여 발광 강도를 ADP 농도로 변환합니다.
5. MLC2v 인산화에 사용되는 인산염의 양을 계산합니다.
   참고: 키나아제 반응 중에 생성된 총 ADP는 위에서 설명한 대로 측정됩니다. cMLCK 자가인산화를 포함한 백그라운드 ADP는 MLC2v가 없는 반응을 기반으로 측정되며, MLC2v 인산화에 사용되는 ADP의 양은 총 ADP에서 백그라운드 ADP를 빼서 평가합니다.

6. 데이터 분석

1. 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 Michalis-Menten 방정식에 데이터를 피팅합니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현됩니다.

키나아제 활성을 측정하는 고전적인 방법은 키나아제 기질에 통합된 방사성 표지된 인산염을 정량화하는 방사성 측정 기반 분석법입니다. 여기에 제시된 방법을 위해 정제된 야생형 cMLCK(그림 1A), MLC2v 및 칼모듈린을 사용한 비방사성 체외 cMLCK 키나아제 분석법을 개발했으며(그림 1B), 생물 발광 ADP 검출 분석을 사용하여 키나?...

본 연구는 비방사성 방법, 생물 발광 ADP 검출 분석 및 인산염 친화성 SDS-PAGE의 조합이 cMLCK의 활성을 결정하는 데 성공적으로 사용될 수 있는지 여부를 평가하기 위해 수행되었습니다. 최적의 온도와 반응 시간 하에서 kinase 반응을 수행하는 것이 필수적입니다. 이들 중 하나를 증가시키면 효소 반응을 빠르고 강력하게 촉진할 수 있습니다. 본 연구에서는 25°C에서 5nM의 cMLCK...

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이 작업은 JSPS KAKENHI Grant Number JP17K09578 및 JP18H04050의 일부 지원을 받았습니다.