非放射性 In Vitro 心筋ミオシン軽鎖キナーゼアッセイ

この研究では、心筋ミオシン軽鎖キナーゼ(cMLCK)のキナーゼ活性とその基質であるミオシン調節性軽鎖(MLC2v)のリン酸化レベルを決定するための、非放射測定法、生物発光ADP検出アッセイ、およびリン酸親和性SDS-PAGEのプロトコルについて説明します。

心臓特異的ミオシン調節性軽鎖キナーゼ(cMLCK)は、ミオシン調節性軽鎖(MLC2v)の心室アイソフォームをリン酸化することにより、心筋サルコメアの構造と収縮性を調節します。MLC2vのリン酸化レベルは、機能不全の心臓では大幅に低下しており、心不全の病因を解明するためにcMLCKの活性とMLC2vのリン酸化レベルを評価することが臨床的に重要であることを示しています。この論文では、cMLCKの活性とMLC2vリン酸化レベルの両方を評価するための非放射性方法について説明します。In vitro キナーゼ反応は、ATP およびカルシウムの存在下で 25 °C で組換えカルモジュリンおよび MLC2v を含む組換え cMLCK を使用して行い、その後、生物発光 ADP 検出アッセイまたはリン酸親和性 SDS-PAGE を使用します。代表的な研究では、生物発光ADP検出アッセイは、1.25 nM〜25 nMのcMLCK濃度でシグナルの厳密な線形増加を示しました。リン酸親和性SDS-PAGEも、同じcMLCK濃度範囲でリン酸化MLC2vの線形増加を示しました。次に、5 nM cMLCKの濃度で反応の時間依存性を調べました。生物発光ADP検出アッセイでは、反応の90分間でシグナルが直線的に増加することが示されました。同様に、リン酸親和性SDS-PAGEは、リン酸化MLC2vの経時的な増加を示しました。MLC2v に対する cMLCK の生化学的パラメーターは、生物発光 ADP 検出アッセイを使用した Michaelis-Menten プロットによって決定されました。 V_max は1.65 ± 0.10 mol/min/molキナーゼであり、平均 K_m は25°Cで約0.5 USA μMでした。 次に、野生型と拡張型心筋症関連p.Pro639Valfs*15変異体cMLCKの活性を測定しました。生物発光ADP検出アッセイとリン酸親和性SDS-PAGEは、それぞれcMLCK活性とMLC2vリン酸化の欠陥を正しく検出しました。結論として、生物発光ADP検出アッセイとリン酸アフィニティーSDS-PAGEの組み合わせは、cMLCK活性とMLC2vのリン酸化レベルを測定するためのシンプルで正確、安全、低コスト、かつ柔軟な方法です。

MYLK3遺伝子によってコードされる心臓特異的ミオシン制御性軽鎖キナーゼ(cMLCK)は、心室ミオシン制御性軽鎖2(MLC2v)^1,2のリン酸化の維持に主に関与するキナーゼです。Ser-15でMLC2vをリン酸化することにより、cMLCKはサルコメア組織^化1を促進し、クロスブリッジ形成の増加、したがってミオシンII^のレバーアーム剛性の増加の結果として、心収縮性^2,3を増強します4。cMLCK活性の欠陥またはMLC2vリン酸化のレベルの低下は、動物モデル^3,5,6の心不全の発症に寄与します。したがって、cMLCK活性は、MLC2vのリン酸化レベルを調節することにより、生理学的および病理学的状態の両方で心臓の収縮性に重要な役割を果たします。

拡張型心筋症(DCM)は、収縮期機能障害と左心室サイズの拡大を特徴とし、うっ血性心不全や心臓移植の主な原因となっています。これまでに、40以上の遺伝子がDCMを引き起こす突然変異として同定されています⁷。最近、cMLCKタンパク質の^{触媒ドメイン中央}部8の切り捨てによりキナーゼ活性を完全に消失させる新規のDCM関連MYLK3変異(p.Pro639Valfs*15)が同定された。また、MYLK3における家族性DCM関連変異の2例が、cMLCK活性の低下または消失を示していることが報告されている⁹。したがって、家族性DCMにおけるcMLCK活性の低下または廃止は、MLC2vリン酸化レベルを低下させることにより、疾患の発症に寄与する可能性があります。MLC2vのリン酸化レベルは、MYLK3^10,11に変異がなくても、機能不全のヒト心臓でも大幅に減少します。したがって、MLC2vリン酸化レベルの低下はヒトの心不全では一般的であると考えられ、cMLCK活性とMLC2vリン酸化レベルの評価が臨床的に重要であることを示しています。MLC2vリン酸化レベルの低下が心臓の収縮性の低下にどのように寄与するかを説明する必要があります。したがって、cMLCK活性とMLC2vリン酸化レベルを測定するアッセイは、心不全の病因を解明するために非常に重要です。

cMLCK活性を測定するための古典的な方法は、放射性標識されたATPからの[^γ-32P]のMLC2v²への取り込みを定量化する放射測定ベースのアッセイです。しかし、その危険性のために、特別な安全と環境への配慮が必要であり、廃棄物処理のコストは高くなります。さらに、³² の半減期が短いため、放射測定法の柔軟性が制限されます。これらの欠点を克服するために、代替の非放射性プロテインキナーゼアッセイ技術が開発されました¹²。プロメガ株式会社が開発した生物発光ADP検出アッセイは、放射性同位元素を使わずにプロテインキナーゼ反応により生成されるADPを測定する¹³。これは、さまざまなレベルの活性を持つプロテインキナーゼの放射測定アッセイと同等の結果を示しています¹³。生物発光ADP検出アッセイはキナーゼ反応によって産生されるADPを測定するため、MLC2vが実際にリン酸化されているかどうかを確認するために、生物発光ADP検出アッセイと並行してリン酸親和性SDS-PAGEを使用しました。リン酸親和性SDS-PAGEは、リン酸化基質タンパク質の移動度の変化を非リン酸化基質タンパク質と比較して検出できるリン酸親和性電気泳動技術である¹⁴。

この記事では、非放射性法を使用してcMLCKの活性とその基質MLC2vのリン酸化レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。in vitroキナーゼ反応を行った後、生物発光ADP検出アッセイとリン酸親和性SDS-PAGEの両方を使用して、MLCKの生化学的値とMCL2vのリン酸化レベルをそれぞれ計算します。全体として、2つの非放射性キナーゼアッセイを組み合わせたプロトコールは、キナーゼの研究に価値があります。

1. 組換え野生型およびDCM関連変異体cMLCKのクローニングと精製

1. 組換え心筋ミオシン軽鎖キナーゼのプラスミドへのクローニング
   1. 最終的なプラスミドを表す連続ヌクレオチド配列を設計します。
   2. ヒト MYLK3 (NM_1829493.3)をコードするDNA断片を、標準的なPCR法を用いて増幅します。プライマー配列は以下の通りである:
      フォワードプライマー:5'- CACCATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGTCTGGGG -3'
      リバースプライマー:5'-TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
      融解温度は60°Cです。
      注:一本鎖オーバーハング配列(CACC)は、TOPOクローニングベクターにライゲーションするために必要です。
   3. プライマー由来の突然変異導入により、DCM関連変異体コンストラクトを導入します。プライマー配列は以下の通りである:
      フォワードプライマー:5'-GTACAAGCCTCGAGAGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
      リバースプライマー:5'- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATGTAGTGCTGGT -3'
      融解温度は60°Cです。
   4. 0.8%アガロースゲルを135 Vで20分間泳動し、PCR産物に対応するバンドを切り取ります。次に、製造元の指示に従って、ゲル抽出キット( 「材料」を参照)を使用してPCR産物を抽出し、精製します。
   5. 製造元の指示に従って TOPO クローニング反応を行い ( 「材料」を参照)、 大腸菌 (pENTR/cMLCK WT、変異ベクター) を形質転換します。
   6. 以下のユニバーサルM13プライマーを用いたPCRにより、正しい配列を確認してください。プライマー配列は以下の通りである:
      フォワードプライマー:5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'
      リバースプライマー:5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   7. pENTR/cMLCKベクターにFLAGタグを組み込み、 製造元の指示に従ってMYLK3 とGateWayデスティネーションベクター(pEF-DEST51)との間でLR組換え反応を行います(pEF-DEST51/FLAG-cMLCK WT、変異体)。
2. 細胞培養とHEK293T細胞へのトランスフェクション
   1. 100 mmディッシュに7.5 x 10⁶ HEK293T細胞を播種し、10% FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEMで培養します。37°Cで5%_CO2 中24時間インキュベートします。
   2. 10 μgのプラスミドDNAを500 μLのMEMに混合して、HEK293T細胞にトランスフェクションするためのLipofection試薬/DNAミックスを調製します( 材料表を参照)。同時に、500 μL の MEM に 20 μL の Lipofectamine 2000 を加えて混合物を調製します。
   3. 室温(RT)で5分間インキュベートし、次にLipofectamine-DNA溶液を混合します。
   4. 室温で20分間インキュベートし、100 mmディッシュに1 mLのLipofectamine-DNA溶液を加えます。
      注:細胞が剥がれないように、リポフェクション混合物を穏やかに加えます。
   5. トランスフェクションした細胞を、5% CO₂を用いて37°Cで最大48時間インキュベートします。
3. 組換えcMLCKタンパク質の精製
   1. トランスフェクションした細胞を氷の上に置き、5 mLのPBSで3回洗浄します。
   2. 溶解バッファー(50 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、1% NP40、0.5 mM EDTA、0.5 mM EGTA、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル、pH = 7.5)を調製し、氷上に保管します。
      注:アッセイの直前にプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加します。
   3. 1 mLの溶解バッファーを細胞に加え、スクレーパーを使用して細胞を1.5 mLチューブに回収し、氷上で5分間インキュベートします。
   4. 20,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   5. 新しい1.5 mLチューブに上清を回収し、5 μLのFLAG-M2アガロースと4°Cで1時間インキュベートします。
   6. 1,000 x g で 1 分間、4 °C で遠心分離した後、上清を除去し、洗浄バッファー (50 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、1% NP40、0.5 mM EDTA、0.5 mM EGTA、および pH = 7.5) を使用して FLAG-M2 アガロース 3x で洗浄します。
   7. 溶出バッファー(50 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、1% NP40、0.5 mM EDTA、0.5 mM EGTA、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル、pH = 7.5)で4°C、30分間、結合タンパク質を溶出します。
   8. 1,000 x g 、4°Cで3分間遠心分離し、上清を組換えFLAGタグ付きタンパク質として使用します。

2. 組換えカルモジュリンのクローニングと精製

1. プラスミドへの組換えカルモジュリンのクローニング
   1. 最終的なプラスミドを表す連続ヌクレオチド配列を設計します。
   2. 標準的なPCR法を用いて、ヒトカルモジュリンをコードするDNA断片(CALM1)(NM_006888)を増幅します。プライマー配列は以下の通りである:
      フォワードプライマー:5'-CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATT -3'
      リバースプライマー:5'-TCATTTGCAGTCATCATCTGTACGAATTC -3'。
      融解温度は60°Cです。
      注:一本鎖オーバーハング配列(CACC)は、TOPOクローニングベクターへのライゲーションに必要です。
   3. 0.8%アガロースゲルを135 Vで20分間泳動し、PCR産物に対応するバンドをゲルから切り取ります。次に、製造元の指示に従って、ゲル抽出キット( 「材料」を参照)を使用してPCR産物を抽出し、精製します。
   4. 製造元の指示に従ってTOPOクローニング反応を行い( 「材料」を参照)、 大腸菌 (pENTR/カルモジュリン)に形質転換します。
   5. 以下のユニバーサルM13プライマーを用いたPCRにより、正しい配列を確認します。シーケンシングされたプライマーは以下の通りです:
      フォワードプライマー:5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'
      リバースプライマー:5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   6. メーカーの指示に従って、カルモジュリンとGateWayデスティネーションベクター(pEF-DEST17)との間のLR組換え反応を行います。
   7. BL21(DE3)の化学的にコンピテントな 大腸菌に形質転換します。
2. 細胞培養と発現誘導
   1. 100 μg/mL のアンピシリンを含む 5 mL の LB 培地に形質転換 大腸菌 のコロニーを接種し、37 °C で一晩振盪します。
   2. 100 μg/mL のアンピシリンを含む 200 mL の LB 培地に移し、培養光学密度(600 nm)が 0.5 に達するまで 37 °C でインキュベートします。
   3. アラビノースを最終濃度0.2%まで添加し、37°Cで3時間培養します。
   4. 5,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去します。
   5. EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルを含むBugBuster Master Mix10 mLに懸濁し、室温で20分間回転させます。
   6. 16,000 x g 、4°C、10分間遠心分離します。
   7. 得られた上清には、N末端のHisタグ付きカルモジュリンタンパク質が含まれており、固定化金属イオンクロマトグラフィー結合バッファーで平衡化したTALONアフィニティレジンのカラムにロードしました。
   8. 結合したHisタグ付きカルモジュリンタンパク質を溶出バッファー(50 mM リン酸ナトリウム[pH = 8.0]、0.3 M NaCl、0.1% CHAPS、0.15 Mイミダゾール)で溶出し、遠心フィルターを用いて5,000 x g 、4°Cで遠心分離して再フォールド濃縮します。
   9. タンパク質濃度を10μMに調整し、溶液は使用時まで-80°Cに保った。

3. in vitroキナーゼアッセイ

注:キナーゼ反応が進行するのを防ぐために、すべてのステップは氷上で実行されます。さらに、MLCK溶液と基質溶液は別々に混合され、反応が速すぎるのを防ぎます。

1. 次の溶液を準備し、氷の上に保ちます。
   10x キナーゼバッファー (200 mM HEPES, 10 mM CaCl₂, 50 mM MgCl₂, 0.1% Tween 20, pH = 7.5)
   100 mM DTT
   10 mM ATP
   500 nM カルモジュリン
   100 nM FLAGタグ付きcMLCK
   24 μM Hisタグ付きMLC2v
   注:組換えタンパク質は、示された濃度に従って1xキナーゼバッファーを使用して希釈されます。
2. 以下の材料を使用して、1.5 mLチューブに氷上で100 μLのcMLCKマスター溶液を調製します。
   10 μL の 10x キナーゼバッファー
   20 μL の 100 nM cMLCK
   20 μL の 5 μM カルモジュリン
   100 mM DTT の 8 μL
   42 μL の H₂O
   注:各サンプルは、10倍キナーゼ緩衝液と蒸留水で希釈し、氷上に保持します。
3. 表1に示すように、氷上の8ストリップPCRチューブに30 μLの基質溶液を調製し、各MLC2v濃度で調製します。最終的なMLC2v濃度は、0、0.25、0.5、1、2、4、8、および12μMです。
   注:組換えHisタグ付きMLC2vは、10xキナーゼバッファーと蒸留水で希釈されます。基質溶液の量は、水を加えて適切なMLC2v濃度を得ることにより30μLに調整します。
4. MLCKマスター溶液を10 μL加えると、最終反応溶液の容量は40 μLになります。キナーゼ反応における各成分の最終濃度は、20 mM HEPES、1 mM CaCl₂、5 mM MgCl₂、0.01% Tween 20、2 mM DTT、150 μM ATP、5 nM cMLCK、250 nM カルモジュリン、および0、0.25、0.5、1、2、4、8、または12 μM MLC2v(pH = 7.5)です。
5. よく混ぜてスピンダウンします。
6. 反応サンプルを25°Cで指定の時間インキュベートします。
7. インキュベーション後、リン酸親和性SDS-PAGEまたは生物発光性ADP検出アッセイによりキナーゼ活性を測定します。

4. リン酸親和性 SDS-PAGE

注:リン酸アフィニティーSDS-PAGEは、製造元のプロトコルに従って実施しました( 材料の表を参照)。

1. ゲルをリン酸アフィニティーSDS-PAGEに注ぎます。
   1. 12% wt/vol アクリルアミド、0.1% wt/vol SDS、125 mM Tris-HCl (pH = 6.8)、0.1% wt/vol 過硫酸アンモニウム、0.5% vol/vol N、N、N'、N'- テトラメチルエチレンジアミン。
   2. 12% wt/vol アクリルアミド、30 μM Phos-tag アクリルアミド、60 μM MnCl₂、0.1% wt/vol SDS、375 mM Tris-HCl (pH = 8.8)、0.05% wt/vol 過硫酸アンモニウム、0.25% vol/vol N、N、N'、N'- テトラメチルエチレンジアミン。
2. 電気泳動用のサンプルを準備します。
   1. in vitroキナーゼ反応から得られたサンプルに1 mM MnCl₂ を添加して混合します。
3. 電気泳動とウェスタンブロッティングを行います。
   1. ゲルを150 Vで80分間、ランニングバッファー(0.1% wt/vol SDS、25 mM Tris、および192 mM Glycine)で分析します。
   2. 電気泳動後、ゲルをEDTA(+)転写バッファー(10 mM EDTA、50 mM Tris、380 mMグリシン、0.000375% wt/vol SDS、および20% wt/vol ethanol)に10分間浸し、次いでトランスファーバッファーに10分間浸します。
   3. 転写バッファー中でタンパク質を15VでPVDFメンブレンに30分間転写します。
   4. 脱脂粉乳で膜をRTで30分間連続的に揺さぶります。ブロッキング後、メンブレンをTTBS(50 mM Tris、150 mM NaCl、0.001% Tween)で3回洗浄します。
   5. メンブレンに一次抗体(抗MLC2v、1:4,000;Abcam ab92721)を4°Cで一晩使用しました。
   6. メンブレンをTTBS(50 mM Tris、150 mM NaCl、および0.001% Tween)で3回洗浄します。
   7. メンブレンに二次抗体(HRP結合ヤギ抗ウサギ1:8,000;Cappel, #55696) を RT で 1 時間。
   8. メンブレンをTTBSで3回洗います。
4. メンブレン上のタンパク質を検出および分析します。
   1. ECL(Enhanced Chemi Luminescence reagent)検出試薬をメンブレンに室温で1分間添加します。
   2. LAS-4000を使用して、最適なタイミングでメンブレン上のタンパク質を検出します。
   3. ImageQuant TLソフトウェアを使用して、バックグラウンドデンシトメトリーを差し引きながら、リン酸化MLC2vと非リン酸化MLC2vを定量します。

5. 生物発光ADP検出アッセイ

注:生物発光ADP検出アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施しました。

1. キナーゼアッセイ反応液に40 μLのATP枯渇試薬を添加して、キナーゼ反応を停止します。よく混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。
2. 80 μLのADP検出試薬を添加します。よく混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。
3. ルミノメーターを使用して発光を測定し、推奨される最大積分時間はウェルあたり0.5秒です。
4. 検量線を使用して、発光強度をADP濃度に変換します。
5. MLC2vのリン酸化に使用されるリン酸塩の量を計算します。
   注:キナーゼ反応中に生成される総ADPは、上記のように測定されます。cMLCK自己リン酸化を含むバックグラウンドADPは、MLC2vを使用しない反応に基づいて測定され、MLC2vリン酸化に使用されるADPの量は、総ADPからバックグラウンドADPを差し引くことによって評価されます。

6. データ分析

1. 適切なデータ解析ソフトウェアを使用して、データをMichalis-Menten方程式に適合させます。データは平均±標準偏差で表されます。

キナーゼ活性を測定するための古典的な方法は、キナーゼ基質に組み込まれた放射性標識リン酸塩を定量する放射測定ベースのアッセイです。ここで紹介した方法では、精製された野生型cMLCK(図1A)、MLC2v、およびカルモジュリンを用いた非放射性in vitro cMLCKキナーゼアッセイを開発し(図1B)、生物発光性ADP検出アッセイを用?...

本研究は、非放射性法、生物発光性ADP検出アッセイ、およびリン酸親和性SDS-PAGEの組み合わせがcMLCKの活性を決定するためにうまく使用できるかどうかを評価するために行われました。キナーゼ反応は、最適な温度と反応時間で行うことが不可欠です。これらのいずれかを増やすと、酵素反応が急速かつ強力に促進されます。本研究では、in vitroキナーゼ反応を5 nMのcM...

著者は何も開示していません。

本研究の一部は、日本学術振興会科研費第JP17K09578号およびJP18H04050の支援を受けて行われました。