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Method Article
* これらの著者は同等に貢献しました
この研究では、心筋ミオシン軽鎖キナーゼ(cMLCK)のキナーゼ活性とその基質であるミオシン調節性軽鎖(MLC2v)のリン酸化レベルを決定するための、非放射測定法、生物発光ADP検出アッセイ、およびリン酸親和性SDS-PAGEのプロトコルについて説明します。
心臓特異的ミオシン調節性軽鎖キナーゼ(cMLCK)は、ミオシン調節性軽鎖(MLC2v)の心室アイソフォームをリン酸化することにより、心筋サルコメアの構造と収縮性を調節します。MLC2vのリン酸化レベルは、機能不全の心臓では大幅に低下しており、心不全の病因を解明するためにcMLCKの活性とMLC2vのリン酸化レベルを評価することが臨床的に重要であることを示しています。この論文では、cMLCKの活性とMLC2vリン酸化レベルの両方を評価するための非放射性方法について説明します。In vitro キナーゼ反応は、ATP およびカルシウムの存在下で 25 °C で組換えカルモジュリンおよび MLC2v を含む組換え cMLCK を使用して行い、その後、生物発光 ADP 検出アッセイまたはリン酸親和性 SDS-PAGE を使用します。代表的な研究では、生物発光ADP検出アッセイは、1.25 nM〜25 nMのcMLCK濃度でシグナルの厳密な線形増加を示しました。リン酸親和性SDS-PAGEも、同じcMLCK濃度範囲でリン酸化MLC2vの線形増加を示しました。次に、5 nM cMLCKの濃度で反応の時間依存性を調べました。生物発光ADP検出アッセイでは、反応の90分間でシグナルが直線的に増加することが示されました。同様に、リン酸親和性SDS-PAGEは、リン酸化MLC2vの経時的な増加を示しました。MLC2v に対する cMLCK の生化学的パラメーターは、生物発光 ADP 検出アッセイを使用した Michaelis-Menten プロットによって決定されました。 Vmax は1.65 ± 0.10 mol/min/molキナーゼであり、平均 Km は25°Cで約0.5 USA μMでした。 次に、野生型と拡張型心筋症関連p.Pro639Valfs*15変異体cMLCKの活性を測定しました。生物発光ADP検出アッセイとリン酸親和性SDS-PAGEは、それぞれcMLCK活性とMLC2vリン酸化の欠陥を正しく検出しました。結論として、生物発光ADP検出アッセイとリン酸アフィニティーSDS-PAGEの組み合わせは、cMLCK活性とMLC2vのリン酸化レベルを測定するためのシンプルで正確、安全、低コスト、かつ柔軟な方法です。
MYLK3遺伝子によってコードされる心臓特異的ミオシン制御性軽鎖キナーゼ(cMLCK)は、心室ミオシン制御性軽鎖2(MLC2v)1,2のリン酸化の維持に主に関与するキナーゼです。Ser-15でMLC2vをリン酸化することにより、cMLCKはサルコメア組織化1を促進し、クロスブリッジ形成の増加、したがってミオシンIIのレバーアーム剛性の増加の結果として、心収縮性2,3を増強します4。cMLCK活性の欠陥またはMLC2vリン酸化のレベルの低下は、動物モデル3,5,6の心不全の発症に寄与します。したがって、cMLCK活性は、MLC2vのリン酸化レベルを調節することにより、生理学的および病理学的状態の両方で心臓の収縮性に重要な役割を果たします。
拡張型心筋症(DCM)は、収縮期機能障害と左心室サイズの拡大を特徴とし、うっ血性心不全や心臓移植の主な原因となっています。これまでに、40以上の遺伝子がDCMを引き起こす突然変異として同定されています7。最近、cMLCKタンパク質の触媒ドメイン中央部8の切り捨てによりキナーゼ活性を完全に消失させる新規のDCM関連MYLK3変異(p.Pro639Valfs*15)が同定された。また、MYLK3における家族性DCM関連変異の2例が、cMLCK活性の低下または消失を示していることが報告されている9。したがって、家族性DCMにおけるcMLCK活性の低下または廃止は、MLC2vリン酸化レベルを低下させることにより、疾患の発症に寄与する可能性があります。MLC2vのリン酸化レベルは、MYLK310,11に変異がなくても、機能不全のヒト心臓でも大幅に減少します。したがって、MLC2vリン酸化レベルの低下はヒトの心不全では一般的であると考えられ、cMLCK活性とMLC2vリン酸化レベルの評価が臨床的に重要であることを示しています。MLC2vリン酸化レベルの低下が心臓の収縮性の低下にどのように寄与するかを説明する必要があります。したがって、cMLCK活性とMLC2vリン酸化レベルを測定するアッセイは、心不全の病因を解明するために非常に重要です。
cMLCK活性を測定するための古典的な方法は、放射性標識されたATPからの[γ-32P]のMLC2v2への取り込みを定量化する放射測定ベースのアッセイです。しかし、その危険性のために、特別な安全と環境への配慮が必要であり、廃棄物処理のコストは高くなります。さらに、32 の半減期が短いため、放射測定法の柔軟性が制限されます。これらの欠点を克服するために、代替の非放射性プロテインキナーゼアッセイ技術が開発されました12。プロメガ株式会社が開発した生物発光ADP検出アッセイは、放射性同位元素を使わずにプロテインキナーゼ反応により生成されるADPを測定する13。これは、さまざまなレベルの活性を持つプロテインキナーゼの放射測定アッセイと同等の結果を示しています13。生物発光ADP検出アッセイはキナーゼ反応によって産生されるADPを測定するため、MLC2vが実際にリン酸化されているかどうかを確認するために、生物発光ADP検出アッセイと並行してリン酸親和性SDS-PAGEを使用しました。リン酸親和性SDS-PAGEは、リン酸化基質タンパク質の移動度の変化を非リン酸化基質タンパク質と比較して検出できるリン酸親和性電気泳動技術である14。
この記事では、非放射性法を使用してcMLCKの活性とその基質MLC2vのリン酸化レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。in vitroキナーゼ反応を行った後、生物発光ADP検出アッセイとリン酸親和性SDS-PAGEの両方を使用して、MLCKの生化学的値とMCL2vのリン酸化レベルをそれぞれ計算します。全体として、2つの非放射性キナーゼアッセイを組み合わせたプロトコールは、キナーゼの研究に価値があります。
1. 組換え野生型およびDCM関連変異体cMLCKのクローニングと精製
2. 組換えカルモジュリンのクローニングと精製
3. in vitroキナーゼアッセイ
注:キナーゼ反応が進行するのを防ぐために、すべてのステップは氷上で実行されます。さらに、MLCK溶液と基質溶液は別々に混合され、反応が速すぎるのを防ぎます。
4. リン酸親和性 SDS-PAGE
注:リン酸アフィニティーSDS-PAGEは、製造元のプロトコルに従って実施しました( 材料の表を参照)。
5. 生物発光ADP検出アッセイ
注:生物発光ADP検出アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施しました。
6. データ分析
キナーゼ活性を測定するための古典的な方法は、キナーゼ基質に組み込まれた放射性標識リン酸塩を定量する放射測定ベースのアッセイです。ここで紹介した方法では、精製された野生型cMLCK(図1A)、MLC2v、およびカルモジュリンを用いた非放射性in vitro cMLCKキナーゼアッセイを開発し(図1B)、生物発光性ADP検出アッセイを用?...
本研究は、非放射性法、生物発光性ADP検出アッセイ、およびリン酸親和性SDS-PAGEの組み合わせがcMLCKの活性を決定するためにうまく使用できるかどうかを評価するために行われました。キナーゼ反応は、最適な温度と反応時間で行うことが不可欠です。これらのいずれかを増やすと、酵素反応が急速かつ強力に促進されます。本研究では、in vitroキナーゼ反応を5 nMのcM...
著者は何も開示していません。
本研究の一部は、日本学術振興会科研費第JP17K09578号およびJP18H04050の支援を受けて行われました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
30% acrylamide/Bis solution | Bio-Rad | 1610156 | Store at 4ºC |
acrylamide | Bio-Rad | 1610156 | Store at 4ºC |
Amicon Ultra-15 | Merck | UFC901008 | |
ammonium persulfate | Wako | 019-03435 | |
ampicillin sodium | Wako | 014-23302 | Store at -20ºC |
BugBuster | Milipore | 71456-4 | Store at 4ºC |
CaCl2 | Wako | 031-00435 | |
CHAPS | Dojindo | 349-04722 | Store at 4ºC |
chemiluminescence imaging analyzer TriStar2 | CBERTHOLD TECHNOLOGIES | LB942-A | |
dithiothreitol | Wako | 047-08973 | Store at -20ºC |
ECL (Enhanced Chemi Luminescence) reagent | GE Healthcare | RPN2106 | Mix reagent 1 and reagent 2 in equal amounts |
EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
Ethanol | Wako | 057-00456 | |
FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | Store at -20ºC |
FLAG agarose | Merck | A2220 | Store at -20ºC |
FLAG peptide | Merck | F3290-4MG | Store at 4ºC |
GateWay pEF-DEST51 Vector | Invitrogen | 12285011 | Store at -20ºC |
glycine | Sigma-Aldrich | 12-1210-5 | |
HEPES | Dojindo | 342-01375 | |
Igepal CA-630 (NP40) | Sigma-Aldrich | 13021-500ML | |
Imiadasole | Wako | 095-00015 | |
L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256-25G | Store at -20ºC |
LAS-4000 | GE Healthcare | 28955810 | |
LB | Merck | WM841485 824 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
Manganase (II) Chloride Tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
MgCl2 | nacalai-tesque | 20909-42 | |
N, N, N’, N’- tetramethylethylenediamin | Wako | 110-18-9 | |
NaCl | Wako | 191-01665 | |
OneShot BL21 AI | Invitrogen | 44-0184 | Store at -80ºC |
OptiMEM | gibco | 31985-070 | Store at 4ºC |
PBS | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | Store at 4ºC |
penicillin streptmycin | gibco | 15140-122 | Store at -20ºC |
pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | Store at -20ºC |
Phos-tag Acrylamide | Wako | AAL-107 | Store at 4ºC |
Promega ADP-Glo | Promega | V9104 | Store at -20ºC |
protease inhibitor cock-tail | nacalai-tesque | 25955-11 | |
PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | Pore size : 0.45 μm |
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | |
SDS | Wako | 191-07145 | |
sodium phosphate | Wako | 192-02815 | |
TALON affinity resin | TaKaRa | 635504 | Store at 4ºC |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
Tween 20 | Wako | 167-11515 | Store at 4ºC |
Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultra Pure ATP, 100mM | Promega | V703B-C | Store at -20ºC |
Urea | Sigma-Aldrich | U0631-1KG |
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