Нерадиоактивные анализы киназы легкой цепи миозина in vitro

В этом исследовании описаны протоколы нерадиометрических методов, биолюминесцентного анализа обнаружения АДФ и фосфат-аффинного SDS-PAGE, для определения киназной активности сердечной миозиновой киназы легкой цепи (cMLCK) и уровня фосфорилирования ее субстрата, регуляторной легкой цепи миозина (MLC2v).

Кардиакальная специфичная миозиновая регуляторная киназа легкой цепи (cMLCK) регулирует структуру и сократимость сердечного саркомера путем фосфорилирования желудочковой изоформы регуляторной легкой цепи миозина (MLC2v). Уровни фосфорилирования MLC2v значительно снижены при сердечной недостаточности, что указывает на клиническую важность оценки активности cMLCK и уровня фосфорилирования MLC2v для выяснения патогенеза сердечной недостаточности. В данной статье описаны нерадиоактивные методы оценки активности уровней фосфорилирования cMLCK и MLC2v. Реакции киназы in vitro проводят с использованием рекомбинантного cMLCK с рекомбинантным кальмодулином и MLC2v в присутствии АТФ и кальция при 25 °C, после чего проводят либо биолюминесцентный анализ для обнаружения АДФ, либо фосфат-аффинный SDS-PAGE. В репрезентативном исследовании биолюминесцентный анализ обнаружения АДФ показал строгое линейное увеличение сигнала при концентрациях cMLCK в диапазоне от 1,25 нМ до 25 нМ. Фосфатное сродство SDS-PAGE также показало линейное увеличение фосфорилированного MLC2v в том же диапазоне концентраций cMLCK. Затем была исследована зависимость реакций от времени при концентрации 5 нМ сМЛК. Биолюминесцентный анализ для обнаружения АДФ показал линейное усиление сигнала в течение 90 минут реакции. Аналогичным образом, аффинное сродство к фосфатам SDS-PAGE показало зависящее от времени увеличение фосфорилированного MLC2v. Биохимические параметры cMLCK для MLC2v определяли по графику Михаэлиса-Ментена с использованием биолюминесцентного анализа обнаружения АДФ. Vmax составлял 1,65 ± 0,10 моль/мин/моль киназы, а среднее значение K_m составляло около 0,5 США мкМ при 25 °C. Затем измеряли активность дикого типа и дилатационную кардиомиопатию-ассоциированную мутантную cMLCK p.Pro639Valfs*15. Биолюминесцентный анализ детекции АДФ и фосфат-аффинный SDS-PAGE корректно обнаружили дефекты активности cMLCK и фосфорилирования MLC2v соответственно. В заключение следует отметить, что комбинация биолюминесцентного анализа для обнаружения АДФ и аффинного SDS-PAGE является простым, точным, безопасным, недорогим и гибким методом измерения активности cMLCK и уровня фосфорилирования MLC2v.

Специфичная для сердца миозиновая регуляторная киназа легкой цепи (cMLCK), кодируемая геном MYLK3, является киназой, преимущественно ответственной за поддержание фосфорилирования регуляторной световой цепи миозина 2 (MLC2v) сердечного желудочка (MLC2v)^1,2. Фосфорилируя MLC2v в Ser-15, cMLCK способствует саркомерной организации¹ и потенцирует сердечную сократительную способность ^2,3 в результате увеличения образования поперечного моста и, следовательно, увеличения жесткости рычага-плеча миозина II⁴. Дефекты активности cMLCK или снижение уровня фосфорилирования MLC2v способствуют развитию сердечной недостаточности на животных моделях ^3,5,6. Таким образом, активность cMLCK играет решающую роль в сократимости сердца как при физиологических, так и при патологических состояниях, регулируя уровень фосфорилирования MLC2v.

Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) характеризуется систолической дисфункцией и увеличенным размером камеры левого желудочка и является основной причиной застойной сердечной недостаточности и трансплантации сердца. На сегодняшний день более 40 генов были идентифицированы как мутации, вызывающие DCM⁷. Недавно была идентифицирована новая DCM-ассоциированная мутация MYLK3 (p.Pro639Valfs*15), которая полностью отменяет активность киназы из-за усечения белка cMLCK в средней части его каталитического домена⁸. Также^{сообщалось о} двух случаях семейных DCM-ассоциированных мутаций в MYLK3, демонстрирующих подавленную или отмененную активность cMLCK. Таким образом, подавленная или отмененная активность cMLCK в семейном ДКМП может способствовать развитию заболевания за счет снижения уровня фосфорилирования MLC2v. Уровни фосфорилирования MLC2v также значительно снижены в отказавших сердцах человека даже без мутаций в MYLK3 ^10,11. Таким образом, снижение уровня фосфорилирования MLC2v, по-видимому, является обычным явлением при сердечной недостаточности человека, что указывает на то, что оценка активности cMLCK и уровней фосфорилирования MLC2v является клинически важной. Необходимо объяснить, каким образом сниженный уровень фосфорилирования MLC2v способствует угнетению сердечной сократимости. Соответственно, анализы, измеряющие активность cMLCK и уровни фосфорилирования MLC2v, чрезвычайно важны для выяснения патогенеза сердечной недостаточности.

Классическим методом измерения активности cMLCK является радиометрический анализ, который количественно оценивает включение [^γ-32P] из радиоактивно меченой АТФ в MLC2v². Однако из-за своей опасной природы он требует особых мер безопасности и охраны окружающей среды, а стоимость утилизации отходов высока. Кроме того, короткий период полураспада³² ограничивает гибкость радиометрического анализа. Для преодоления этих недостатков были разработаны альтернативные методы нерадиометрического анализа протеинкиназ¹². Биолюминесцентный анализ обнаружения АДФ, разработанный корпорацией Promega, измеряет АДФ, образующийся в результате реакции протеинкиназы, без использования радиоизотопов¹³. Он показывает результаты, сопоставимые с радиометрическим анализом для протеинкиназ с различными уровнями активности¹³. Поскольку биолюминесцентный анализ обнаружения АДФ измеряет АДФ, полученный в результате киназной реакции, фосфат-аффинный SDS-PAGE параллельно с анализом детекции биолюминесцентного АДФ был использован для проверки того, действительно ли MLC2v фосфорилирован. SDS-PAGE с аффинным сродством к фосфатам SDS-PAGE представляет собой метод аффинного электрофореза, который позволяет обнаруживать изменения подвижности фосфорилированных белков субстрата по сравнению с их нефосфорилированными аналогами¹⁴.

В данной статье описаны протоколы измерения активности cMLCK и уровня фосфорилирования его субстрата MLC2v с использованием нерадиоактивных методов. После проведения реакции киназы in vitro для расчета биохимических значений MLCK и уровня фосфорилирования MCL2v используют как биолюминесцентный анализ обнаружения АДФ, так и фосфат-аффинный SDS-PAGE соответственно. В целом, протокол, объединяющий два анализа нерадиоактивных киназ, представляет ценность для изучения киназ.

1. Клонирование и очистка рекомбинантного дикого типа и DCM-ассоциированного мутантного cMLCK

1. Клонирование рекомбинантной миозинкиназы легкой цепи миозина сердца в плазмиду
   1. Спроектируйте непрерывную нуклеотидную последовательность, представляющую конечную плазмиду.
   2. Амплифицируйте фрагмент ДНК, кодирующий человеческий MYLK3 (NM_1829493.3), с помощью стандартного метода ПЦР. Последовательности праймеров следующие:
      Передний праймер: 5'- CACCATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGTCTGGGG -3'
      Обратный праймер: 5'- TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
      Температура плавления составляет 60 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одноцепочечная последовательность выступов (CACC) необходима для лигирования вектора клонирования POPO.
   3. Введение DCM-ассоциированной мутантной конструкции путем мутагенеза, полученного из праймера. Последовательности праймеров следующие:
      Передний грунт: 5'- GTACAAGCCTCGAGAGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
      Обратная грунтовка: 5'- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATGTAGTGCTGGT -3'
      Температура плавления составляет 60 °C.
   4. Запустите 0,8% агарозный гель при напряжении 135 В в течение 20 минут и вырежьте полосы, соответствующие продуктам ПЦР. Затем извлеките и очистите продукты ПЦР с помощью набора для экстракции гелем (см. раздел «Материалы»), следуя инструкциям производителя.
   5. Выполните реакцию клонирования TOPO в соответствии с инструкциями производителя (см. раздел «Материалы») и трансформируйте Escherichia coli (pENTR/cMLCK WT, мутантный вектор).
   6. Подтвердите правильность последовательности методом ПЦР с помощью следующих универсальных праймеров М13. Последовательности праймеров следующие:
      Передний грунт: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Обратная грунтовка: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   7. Включите FLAG-метку в вектор pENTR/cMLCK и выполните реакцию LR-рекомбинации между MYLK3 и вектором назначения GateWay (т.е. pEF-DEST51) в соответствии с инструкциями производителя (pEF-DEST51/FLAG-cMLCK WT, мутантный).
2. Культивирование клеток и трансфекция в HEK293T клетки
   1. Засейте чашку диаметром 100 мм с клетками 7,5 x 10⁶ HEK293T и культуру с DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина. Инкубировать при 37 °C при 5%_CO2 в течение 24 часов.
   2. Приготовьте смесь реагента/ДНК Lipofection для трансфекции в HEK293T клетки, смешав 10 г плазмидной ДНК с 500 μл MEM (см. Таблицу материалов). В то же время готовят смесь, добавляя 20 мкл Липофектамина 2000 в 500 мкл MEM.
   3. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT), затем смешать раствор липофектамина и ДНК.
   4. Инкубируйте в течение 20 минут при RT, затем добавьте 1 мл раствора липофектамина-ДНК в чашку диаметром 100 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать отслоения клеток, аккуратно добавьте смесь для липофектиона.
   5. Инкубировать трансфицированные клетки в течение 48 ч при 37 °C с 5%_CO2.
3. Очистка рекомбинантного белка cMLCK
   1. Поместите трансфицированные клетки на лед и промойте 3 раза 5 мл PBS.
   2. Приготовьте буфер для лизиса (50 мМ Tris-HCl, 0,15 М NaCl, 1% NP40, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, и коктейль ингибиторов протеазы, pH = 7,5) и держите на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте коктейль ингибиторов протеазы непосредственно перед анализом.
   3. Добавьте к клеткам 1 мл буфера для лизиса, с помощью скребка соберите клетки в пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте на льду в течение 5 минут.
   4. Центрифугируйте при давлении 20 000 x g в течение 5 минут при 4 °C.
   5. Соберите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте с 5 мкл агарозы FLAG-M2 в течение 1 ч при 4 °C.
   6. Центрифугируйте при 1000 x g в течение 1 мин при 4 °C, затем удалите надосадочную жидкость и промойте в агарозе FLAG-M2 3x с использованием промывочного буфера (50 мМ Tris-HCl, 0,15 М NaCl, 1% NP40, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA и коктейль ингибиторов протеазы, pH = 7,5).
   7. Элюируют связывающие белки элюирующим буфером (50 мМ Tris-HCl, 0,15 М NaCl, 1% NP40, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ЭГТА и коктейлем ингибиторов протеазы, рН = 7,5) при 4 °С в течение 30 мин.
   8. Центрифугируйте при 1000 x g при 4 °C в течение 3 мин и используйте надосадочную жидкость в качестве рекомбинантных белков, меченных FLAG.

2. Клонирование и очистка рекомбинантного кальмодулина

1. Клонирование рекомбинантного кальмодулина в плазмиду
   1. Спроектируйте непрерывную нуклеотидную последовательность, представляющую конечную плазмиду.
   2. Амплифицируйте фрагмент ДНК, кодирующий человеческий кальмодулин (CALM1) (NM_006888) с помощью стандартного метода ПЦР. Последовательности праймеров следующие:
      Передний праймер: 5'- CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATT -3'
      Обратная грунтовка: 5'- TCATTTTGCAGTCATCATCTCTACGAATTC -3'.
      Температура плавления составляет 60 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одноцепочечные последовательности выступов (CACC) необходимы для лигирования к вектору клонирования TOPO.
   3. Запустите 0,8% агарозный гель при напряжении 135 В в течение 20 минут и вырежьте из геля полосы, соответствующие продуктам ПЦР. Затем извлеките и очистите продукты ПЦР с помощью набора для экстракции гелем (см. раздел «Материалы»), следуя инструкциям производителя.
   4. Проведите реакцию клонирования TOPO в соответствии с инструкциями производителя (см. раздел «Материалы») и превратите его в E. coli (pENTR/Calmodulin).
   5. Подтвердите правильность последовательности методом ПЦР с помощью следующих универсальных праймеров M13. Праймеры упорядочены следующим образом:
      Передний грунт: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Обратная грунтовка: 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   6. Выполните реакцию рекомбинации LR между кальмодулином и вектором назначения GateWay (pEF-DEST17) в соответствии с инструкциями производителя.
   7. Превращают в BL21 (DE3) химически компетентную кишечную палочку.
2. Культивирование клеток и индукция экспрессии
   1. Инокулируйте 5 мл LB среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, с колонией трансформированной E. coli и встряхните в течение ночи при 37 °C.
   2. Перенесите в 200 мл LB среду, содержащую 100 мкг/мл ампициллина, и инкубируйте при 37 °C до тех пор, пока оптическая плотность культуры (600 нм) не достигнет 0,5.
   3. Добавьте арабинозу до конечной концентрации 0,2% и закваливайте в течение 3 ч при 37 °C.
   4. Центрифугируйте при давлении 5 000 x g при 4 °C в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость.
   5. Суспензируйте в 10 мл смеси BugBuster Master Mix, содержащей коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА, и вращайте при температуре RT в течение 20 минут.
   6. Центрифуга при 16 000 x g при 4 °C в течение 10 минут.
   7. Полученный надосадочный пласт, содержащий N-концевой белок кальмодулина, меченный His, загружали в колонку смолы TALON Affinity Resin, уравновешенную иммобилизованным буфером для связывания ионов металлов.
   8. Элюируют связанный меченный His-меченным белок кальмодулина с элюирующим буфером (50 мМ фосфата натрия [pH = 8,0], 0,3 М NaCl, 0,1% CHAPS и 0,15 М имидазола), затем переваривают и концентрируют центрифугированием при 5000 x g при 4 °C с использованием центробежного фильтра.
   9. Концентрацию белка доводили до 10 мкМ и поддерживали температуру раствора при -80 °C до использования.

3. Анализ in vitro киназы

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются на льду, чтобы предотвратить протекание киназной реакции. Кроме того, растворы MLCK и субстрата смешиваются отдельно, чтобы избежать слишком быстрой реакции.

1. Приготовьте следующие растворы и держите на льду:
   10x киназный буфер (200 мМ HEPES, 10 мМ CaCl₂, 50 мМ MgCl₂, 0,1% Tween 20, pH = 7,5)
   100 мМ DTT
   10 мМ АТФ
   500 нМ кальмодулин
   100 нМ с тегом FLAG cMLCK
   24 μM с тегом MLC2v
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантные белки разбавляют с использованием 1x киназного буфера в соответствии с указанными концентрациями.
2. Приготовьте 100 мкл главного раствора cMLCK на льду в пробирках объемом 1,5 мл с использованием следующих ингредиентов:
   10 мкл 10-кратного киназного буфера
   20 мкл 100 нМ cMLCK
   20 мкл 5 мкМ кальмодулина
   8 мкл 100 мМ DTT
   42 мкл H₂O
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый образец разбавляют 10-кратным киназным буфером и дистиллированной водой и держат на льду.
3. Приготовьте 30 мкл субстратного раствора в 8-полосковой ПЦР-пробирке на льду при каждой концентрации MLC2v, как описано в таблице 1. Конечные концентрации MLC2v составляют 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 и 12 мкМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантный MLC2v, меченный His, разбавляют 10-кратным киназным буфером и дистиллированной водой. Объем раствора субстрата доводят до 30 мкл путем добавления воды для получения соответствующей концентрации MLC2v.
4. Добавьте 10 μL главного раствора MLCK, чтобы получить конечный объем реакционного раствора 40 μL. Конечная концентрация каждого компонента в киназной реакции составляет 20 мМ HEPES, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ MgCl₂, 0,01% Tween 20, 2 мМ DTT, 150 мкМ АТФ, 5 нМ cMLCK, 250 нМ кальмодулина и 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 или 12 мкМ MLC2v (pH = 7,5).
5. Хорошо перемешайте и убавьте обороты.
6. Инкубировать реакционные образцы при температуре 25 °C в течение указанного времени.
7. После инкубации измерьте активность киназы с помощью фосфат-аффинного SDS-PAGE или биолюминесцентного анализа для обнаружения АДФ.

4. Фосфатно-аффинное сродство SDS-PAGE

ПРИМЕЧАНИЕ: Фосфат-аффинное определение SDS-PAGE проводилось в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).

1. Налейте гель для аффинного сродства фосфатов SDS-PAGE.
   1. Смешайте гелевые растворы следующим образом: 12% мас./волю акриламида, 0,1% мас./об.м SDS, 125 мМ трис-HCl (pH = 6,8), 0,1% масс./об.м персульфата аммония и 0,5% об./об.м N, N, N'-тетраметилэтилендиамина.
   2. Смешайте растворяющие растворы в геле следующим образом: 12% мас./об.м акриламида, 30 мкМ фос-таг-акриламида, 60 мкМ MnCl2_, 0,1% мас./об.м SDS, 375 мМ Tris-HCl (pH = 8,8), 0,05% масс./об.м персульфата аммония и 0,25% об./об.м N, N, N'-тетраметилэтилендиамина.
2. Подготовьте образец для электрофореза.
   1. Добавьте и смешайте 1 мМ MnCl2_с образцом из реакции киназы in vitro.
3. Проводят электрофорез и вестерн-блоттинг.
   1. Проведите гель при напряжении 150 В в течение 80 минут в проточном буфере (0,1% мас./об. SDS, 25 мМ Трис и 192 мМ глицин).
   2. После электрофореза замочите гель в ЭДТА (+) трансферном буфере (10 мМ ЭДТА, 50 мМ Трис, 380 мМ глицина, 0,000375% мас./об. SDS и 20% масс./об. этанола) на 10 мин, а затем в трансферном буфере на 10 мин.
   3. Перенесите белки на мембрану PVDF при напряжении 15 В в течение 30 минут в буфере для переноса.
   4. Непрерывно покачивайте мембрану обезжиренным сухим молоком в течение 30 минут в режиме RT. После блокировки промойте мембрану 3x с помощью TTBS (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,001% Твин).
   5. Пропитайте мембрану первичным антителом (анти-MLC2v, 1:4,000; Abcam ab92721) на ночь при 4 °C.
   6. Промойте мембрану 3 раза с помощью TTBS (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl и 0,001% Tween).
   7. Пропитайте мембрану вторичным антителом (HRP-сопряженный козий антикролик 1:8,000; Cappel, #55696) в течение 1 часа на RT.
   8. Промойте мембрану 3 раза с помощью TTBS.
4. Обнаруживайте и анализируйте белки на мембране.
   1. Добавьте реагент для детектирования ECL (Enhanced Chemi Luminescence reagent) на мембрану на 1 мин при РТ.
   2. Определите белки на мембране с помощью LAS-4000 в оптимальное время.
   3. Количественно оцените фосфорилированный и нефосфорилированный MLC2v, вычитая фоновую денситометрию с помощью программного обеспечения ImageQuant TL.

5. Биолюминесцентный анализ обнаружения АДФ

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ на биолюминесцентное обнаружение АДФ проводился в соответствии с протоколом производителя.

1. Остановите киназную реакцию, добавив 40 мкл реагента для истощения АТФ в раствор для анализа киназы. Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 30 минут при RT.
2. Добавьте 80 мкл реагента для обнаружения АДФ. Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 30 минут при RT.
3. Измерьте люминесценцию с помощью люминометра с рекомендуемым максимальным временем интегрирования 0,5 с на лунку.
4. Преобразуйте интенсивность люминесценции в концентрацию АДФ с помощью калибровочной кривой.
5. Рассчитайте количество фосфатов, используемых для фосфорилирования MLC2v.
   Примечание: Общее количество АДФ, вырабатываемое во время киназной реакции, измеряется, как описано выше. Фоновый АДФ, включая аутофосфорилирование cMLCK, измеряют на основе реакции без MLC2v, а количество АДФ, используемого для фосфорилирования MLC2v, оценивают путем вычитания фонового АДФ из общего АДФ.

6. Анализ данных

1. Подгоняйте данные под уравнение Михалиса-Ментена с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа данных. Данные выражаются в виде среднего ± стандартного отклонения.

Классическим методом измерения активности киназы является радиометрический анализ, который количественно определяет радиоактивно меченый фосфат, включенный в субстрат киназы. Для представленного здесь метода был разработан нерадиоактивный анализ киназы cMLCK in vitro ?...

Настоящее исследование было предпринято с целью оценить, может ли комбинация нерадиоактивных методов, биолюминесцентного анализа обнаружения АДФ и фосфат-аффинного SDS-PAGE быть успешно использована для определения активности cMLCK. Важно проводить киназные реакции при ...

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была частично поддержана грантами JSPS KAKENHI No JP17K09578 и JP18H04050.