Dosages non radioactifs de myosine kinase à chaîne légère cardiaque in vitro

Cette étude décrit des protocoles pour des méthodes non radiométriques, un test de détection ADP bioluminescent et un SDS-PAGE d’affinité phosphate, pour déterminer l’activité kinase de la chaîne légère de myosine cardiaque kinase (cMLCK) et le niveau de phosphorylation de son substrat, la chaîne légère régulatrice de la myosine (MLC2v).

La kinase de la chaîne légère régulatrice de la myosine spécifique du cancer (cMLCK) régule la structure et la contractilité du sarcomère cardiaque en phosphorylant l’isoforme ventriculaire de la chaîne légère régulatrice de la myosine (MLC2v). Les niveaux de phosphorylation de MLC2v sont significativement réduits dans les cœurs défaillants, ce qui indique l’importance clinique d’évaluer l’activité de la cMLCK et le niveau de phosphorylation de la MLC2v pour élucider la pathogenèse de l’insuffisance cardiaque. Cet article décrit des méthodes non radioactives pour évaluer à la fois l’activité des niveaux de phosphorylation de cMLCK et de MLC2v. Des réactions kinases in vitro sont réalisées à l’aide de cMLCK recombinant avec de la calmoduline recombinante et de la MLC2v en présence d’ATP et de calcium à 25 °C, qui sont suivies soit d’un test de détection d’ADP bioluminescent, soit d’un test d’affinité phosphate SDS-PAGE. Dans l’étude représentative, le test de détection bioluminescent de l’ADP a montré une augmentation linéaire stricte du signal à des concentrations de cMLCK comprises entre 1,25 nM et 25 nM. L’affinité phosphate SDS-PAGE a également montré une augmentation linéaire de MLC2v phosphorylée dans la même gamme de concentration de cMLCK. Ensuite, la dépendance temporelle des réactions a été examinée à la concentration de 5 nM cMLCK. Un test de détection ADP bioluminescent a montré une augmentation linéaire du signal pendant 90 minutes de la réaction. De même, l’affinité phosphatée SDS-PAGE a montré une augmentation dépendante du temps de MLC2v phosphorylée. Les paramètres biochimiques de cMLCK pour MLC2v ont été déterminés par un graphique de Michaelis-Menten à l’aide du test de détection bioluminescent ADP. Le V_max était de 1,65 ± 0,10 mol/min/mol kinase et le K_m moyen était d’environ 0,5 USA μM à 25 °C. Ensuite, l’activité du type sauvage et de la cardiomyopathie dilatée associée à la cardiomyopathie p.Pro639Valfs*15 mutante cMLCK a été mesurée. Le test de détection ADP bioluminescent et l’affinité phosphate SDS-PAGE ont correctement détecté les défauts d’activité cMLCK et de phosphorylation de MLC2v, respectivement. En conclusion, la combinaison du test de détection ADP bioluminescent et de l’affinité phosphatée SDS-PAGE est une méthode simple, précise, sûre, peu coûteuse et flexible pour mesurer l’activité de la cMLCK et le niveau de phosphorylation de MLC2v.

La kinase de la chaîne légère régulatrice de la myosine spécifique du cœur (cMLCK) codée par le gène MYLK3 est la kinase principalement responsable du maintien de la phosphorylation de la chaîne légère régulatrice de la myosine ventriculaire cardiaque 2 (MLC2v)^1,2. En phosphorylant MLC2v au niveau de Ser-15, cMLCK favorise l’organisation du sarcomère¹ et potentialise la contractilité cardiaque ^2,3 en raison de l’augmentation de la formation de ponts croisés et donc d’une augmentation de la rigidité du bras de levier de la myosine II⁴. Des défauts de l’activité de cMLCK ou des niveaux réduits de phosphorylation de MLC2v contribuent au développement de l’insuffisance cardiaque dans des modèles animaux ^3,5,6. Ainsi, l’activité de la cMLCK joue un rôle essentiel dans la contractilité cardiaque dans des conditions physiologiques et pathologiques en régulant le niveau de phosphorylation de MLC2v.

La cardiomyopathie dilatée (CMD) se caractérise par un dysfonctionnement systolique et une augmentation de la taille de la chambre ventriculaire gauche et est une cause majeure d’insuffisance cardiaque congestive et de transplantations cardiaques. Jusqu’à présent, plus de 40 gènes ont été identifiés comme étant des mutations responsables de la CMD⁷. Récemment, une nouvelle mutation MYLK3 associée à DCM (p.Pro639Valfs*15) a été identifiée qui abolit complètement l’activité kinase en raison de la troncature de la protéine cMLCK dans la partie médiane de son domaine catalytique⁸. Deux cas de mutations familiales associées à la CMD dans MYLK3 montrant une activité cMLCK déprimée ou abolie ont également été rapportés⁹. Ainsi, une activité réduite ou abolie de la cMLCK dans la CMD familiale peut contribuer au développement de la maladie en diminuant les niveaux de phosphorylation de MLC2v. Les niveaux de phosphorylation de MLC2v sont également significativement réduits dans les cœurs humains défaillants, même sans mutations dans MYLK3 ^10,11. Ainsi, la réduction des niveaux de phosphorylation de MLC2v semble être courante dans l’insuffisance cardiaque humaine, ce qui indique que l’évaluation de l’activité de la cMLCK et des niveaux de phosphorylation de MLC2v est cliniquement importante. Il est nécessaire d’expliquer comment les niveaux réduits de phosphorylation de MLC2v contribuent à la contractilité cardiaque déprimée. Par conséquent, les tests qui mesurent l’activité de la cMLCK et les niveaux de phosphorylation de la MLC2v sont extrêmement importants pour élucider la pathogenèse de l’insuffisance cardiaque.

La méthode classique de mesure de l’activité de la cMLCK est un test radiométrique qui quantifie l’incorporation de [^γ-32P] de l’ATP marqué radioactivement dans la MLC2v². Cependant, en raison de sa nature dangereuse, il nécessite des considérations particulières en matière de sécurité et d’environnement, et le coût de l’élimination des déchets est élevé. De plus, la courte demi-vie du³² limite la flexibilité du test radiométrique. Pour pallier ces inconvénients, d’autres techniques non radiométriques de dosage des protéines kinases ont été mises au point¹². Le test de détection de l’ADP bioluminescent développé par Promega Corporation mesure l’ADP généré par la réaction de la protéine kinase sans utiliser de radio-isotopes¹³. Il montre des résultats comparables à ceux du dosage radiométrique des protéines kinases avec des niveaux d’activité variables¹³. Étant donné que le test de détection de l’ADP bioluminescent mesure l’ADP produit par une réaction kinase, le test de détection de l’ADP bioluminescent SDS-PAGE, parallèlement au test de détection de l’ADP bioluminescent, a été utilisé pour vérifier si le MLC2v est réellement phosphorylé. SDS-PAGE est une technique d’électrophorèse d’affinité phosphate qui permet de détecter les changements dans la mobilité des protéines de substrat phosphorylées par rapport à leurs homologues non phosphorylées¹⁴.

Cet article décrit des protocoles permettant de mesurer l’activité du cMLCK et le niveau de phosphorylation de son substrat, MLC2v, à l’aide de méthodes non radioactives. Après avoir réalisé une réaction kinase in vitro, le test de détection ADP bioluminescent et l’affinité phosphate SDS-PAGE sont utilisés pour calculer les valeurs biochimiques de MLCK et le niveau de phosphorylation de MCL2v, respectivement. Dans l’ensemble, un protocole combinant les deux dosages de kinases non radioactives est précieux pour l’étude des kinases.

1. Clonage et purification de cMLCK recombinant de type sauvage et de cMLCK mutant associé à la DCM

1. Clonage de la myosine cardiaque recombinante kinase à chaîne légère dans un plasmide
   1. Concevez une séquence nucléotidique continue pour représenter le plasmide final.
   2. Amplifier un fragment d’ADN codant pour MYLK3 humain (NM_1829493.3) à l’aide d’une méthode PCR standard. Les séquences d’amorces sont les suivantes :
      Amorce avant : 5'- CACCATGTCAGGAACCTCCAAGGAGAGTCTGGGG -3'
      Amorce inversée : 5'- TTAGGGAGAAGTTGGAAATTTCCTTAACCT -3'
      La température de fusion est de 60 °C.
      REMARQUE : La séquence de porte-à-faux simple brin (CACC) est nécessaire pour la ligature au vecteur de clonage TOPO.
   3. Introduire une construction mutante associée à la DCM par mutagenèse dérivée de l’amorce. Les séquences d’amorces sont les suivantes :
      Amorce avant : 5'- GTACAAGCCTCGAGAGAAGCTGAAGGTGAAC -3'
      Amorce inversée : 5'- CTTGAGGTCCAGGTGCAGGATGTAGTGCTGGT -3'
      La température de fusion est de 60 °C.
   4. Faites fonctionner un gel d’agarose à 0,8 % à 135 V pendant 20 min, et découpez les bandes correspondant aux produits de PCR. Ensuite, extrayez et purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit d’extraction de gel (voir Matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
   5. Effectuer une réaction de clonage TOPO en suivant les instructions du fabricant (voir Matériaux) et transformer Escherichia coli (pENTR/cMLCK WT, vecteur mutant).
   6. Confirmez la séquence correcte par PCR à l’aide des amorces universelles M13 suivantes. Les séquences d’amorces sont les suivantes :
      Amorce avant : 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Amorce inversée : 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   7. Incorporer une étiquette FLAG dans le vecteur pENTR/cMLCK et effectuer une réaction de recombinaison LR entre MYLK3 et un vecteur de destination GateWay (c’est-à-dire pEF-DEST51) en suivant les instructions du fabricant (pEF-DEST51/FLAG-cMLCK WT, mutant).
2. Culture cellulaire et transfection dans HEK293T cellules
   1. Ensemencer une boîte de 100 mm avec 7,5 x 10^{cellules de 6} HEK293T et cultiver avec du DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Incuber à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   2. Préparez le mélange réactif de lipofection/ADN pour la transfection dans HEK293T cellules en mélangeant 10 μg d’ADN plasmidique dans 500 μL de MEM (voir le tableau des matériaux). Dans le même temps, préparez le mélange en ajoutant 20 μL de Lipofectamine 2000 dans 500 μL de MEM.
   3. Incuber pendant 5 min à température ambiante (RT), puis mélanger la solution de lipofectamine-ADN.
   4. Incuber pendant 20 min à RT, puis ajouter 1 mL de la solution de lipofectamine-ADN dans la boîte de 100 mm.
      REMARQUE : Pour éviter de détacher les cellules, ajoutez doucement le mélange de lipofection.
   5. Incuber les cellules transfectées jusqu’à 48 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
3. Purification de la protéine cMLCK recombinante
   1. Placez les cellules transfectées sur de la glace et lavez-les 3 fois avec 5 ml de PBS.
   2. Préparez un tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl, 0,15 M de NaCl, 1 % de NP40, 0,5 mM d’EDTA, 0,5 mM d’EGTA et un cocktail d’inhibiteurs de protéase, pH = 7,5) et conservez-le sur de la glace.
      REMARQUE : Ajouter le cocktail d’inhibiteurs de protéase juste avant le dos.
   3. Ajoutez 1 ml de tampon de lyse aux cellules, utilisez un grattoir pour récolter les cellules dans un tube de 1,5 ml et incubez sur de la glace pendant 5 min.
   4. Centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
   5. Prélever le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et incuber avec 5 μL d’agarose FLAG-M2 pendant 1 h à 4 °C.
   6. Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min à 4 °C, puis retirer le surnageant et laver dans l’agarose FLAG-M2 3x à l’aide d’un tampon de lavage (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1 % NP40, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA et cocktail inhibiteur de protéase, pH = 7,5).
   7. Eluter les protéines de liaison avec un tampon d’élution (50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1 % NP40, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA et cocktail d’inhibiteurs de protéase, pH = 7,5) à 4 °C pendant 30 min.
   8. Centrifuger à 1 000 x g à 4 °C pendant 3 min et utiliser le surnageant comme protéine recombinante marquée FLAG.

2. Clonage et purification de la calmoduline recombinante

1. Clonage de la calmoduline recombinante dans le plasmide
   1. Concevez une séquence nucléotidique continue pour représenter le plasmide final.
   2. Amplifier un fragment d’ADN codant pour la calmoduline humaine (CALM1) (NM_006888) à l’aide d’une méthode PCR standard. Les séquences d’amorces sont les suivantes :
      Amorce avant : 5'- CACCATGGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATT -3'
      Amorce inversée : 5'- TCATTTTGCAGTCATCATCTGTACGAATTC -3'.
      La température de fusion est de 60 °C.
      REMARQUE : Les séquences de surplomb simple brin (CACC) sont nécessaires pour la ligature au vecteur de clonage TOPO.
   3. Faites fonctionner un gel d’agarose à 0,8 % à 135 V pendant 20 min et découpez les bandes correspondant aux produits PCR dans le gel. Ensuite, extrayez et purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit d’extraction de gel (voir Matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
   4. Effectuer la réaction de clonage TOPO en suivant les instructions du fabricant (voir Matériaux) et se transformer en E. coli (pENTR/Calmodulin).
   5. Confirmez la séquence correcte par PCR à l’aide des amorces universelles M13 suivantes. Les amorces séquencées sont les suivantes :
      Amorce avant : 5'- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
      Amorce inversée : 5'- GTCATAGCTGTTTCCTG -3'
   6. Effectuez la réaction de recombinaison LR entre la calmoduline et un vecteur de destination GateWay (pEF-DEST17) en suivant les instructions du fabricant.
   7. Transformer en BL21 (DE3) E . coli chimiquement compétent.
2. Culture cellulaire et induction de l’expression
   1. Inoculer 5 mL de milieu LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline avec une colonie d’E. coli transformé et agiter toute la nuit à 37 °C.
   2. Transvaser dans 200 mL de milieu LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline et incuber à 37 °C jusqu’à ce que la densité optique de culture (600 nm) atteigne 0,5.
   3. Ajouter l’arabinose à une concentration finale de 0,2 % et laisser cultiver pendant 3 h à 37 °C.
   4. Centrifuger à 5 000 x g à 4 °C pendant 10 min et retirer le surnageant.
   5. Mettre en suspension dans 10 ml de BugBuster Master Mix contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA et tourner à l’heure normale pendant 20 minutes.
   6. Centrifugeuse à 16 000 x g à 4 °C pendant 10 min.
   7. Le surnageant résultant contenant la protéine calmoduline marquée N-terminus His-a été chargé sur une colonne de résine d’affinité TALON équilibrée avec un tampon de liaison par chromatographie d’ions métalliques immobilisé.
   8. Éluer la protéine calmoduline liée à His-marquée avec un tampon d’élution (phosphate de sodium 50 mM [pH = 8,0], 0,3 M NaCl, 0,1 % CHAPS et 0,15 M imidazole), puis replier et concentrer par centrifugation à 5 000 x g à 4 °C à l’aide d’un filtre centrifuge.
   9. La concentration en protéines a été ajustée à 10 μM et la solution maintenue à -80 °C jusqu’à l’utilisation.

3. Dosage de kinase in vitro

REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées sur de la glace pour empêcher la réaction kinase de se poursuivre. De plus, les solutions MLCK et de substrat sont mélangées séparément pour éviter une réaction trop rapide.

1. Préparez les solutions suivantes et restez sur la glace :
   10x tampon kinase (200 mM HEPES, 10 mM CaCl₂, 50 mM MgCl₂, 0,1 % Tween 20, pH = 7,5)
   TNT 100 mM
   10 mM d’ATP
   500 nM de calmoduline
   100 nM étiqueté FLAG cMLCK
   24 μM His-étiqueté MLC2v
   REMARQUE : Les protéines recombinantes sont diluées à l’aide d’un tampon de kinase 1x selon les concentrations indiquées.
2. Préparez 100 μL de la solution maîtresse de cMLCK sur de la glace dans des tubes de 1,5 mL en utilisant les ingrédients suivants :
   10 μL de tampon kinase 10x
   20 μL de 100 nM cMLCK
   20 μL de calmoduline 5 μM
   8 μL de 100 mM DTT
   42 μL de H₂O
   REMARQUE : Chaque échantillon est dilué avec un tampon de kinase 10x et de l’eau distillée et conservé sur de la glace.
3. Préparer 30 μL de solution de substrat dans le tube PCR à 8 bandes sur de la glace à chaque concentration de MLC2v, comme décrit dans le tableau 1. Les concentrations finales de MLC2v sont de 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 et 12 μM.
   REMARQUE : Le MLC2v recombinant marqué His-marqué est dilué avec un tampon kinase 10x et de l’eau distillée. Le volume de la solution de substrat est ajusté à 30 μL par l’ajout d’eau pour obtenir la concentration appropriée de MLC2v.
4. Ajouter 10 μL de la solution maîtresse MLCK pour obtenir un volume de solution réactionnelle finale de 40 μL. La concentration finale de chaque composant dans la réaction kinase est de 20 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,01 % Tween 20, 2 mM DTT, 150 μM ATP, 5 nM cMLCK, 250 nM de calmoduline et 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 ou 12 μM MLC2v (pH = 7,5).
5. Mélangez bien et tournez.
6. Incuber les échantillons de réaction à 25 °C pendant la durée indiquée.
7. Après l’incubation, mesurer l’activité de la kinase à l’aide d’un test de détection d’affinité de phosphate SDS-PAGE ou d’ADP bioluminescent.

4. Affinité phosphate SDS-PAGE

REMARQUE : L’affinité phosphatée SDS-PAGE a été réalisée conformément au protocole du fabricant (voir Tableau des matériaux).

1. Versez le gel pour l’affinité phosphate SDS-PAGE.
   1. Mélanger les solutions de gel d’empilage comme suit : 12 % en poids/vol d’acrylamide, 0,1 % en poids/vol de SDS, 125 mM de Tris-HCl (pH = 6,8), 0,1 % en poids/vol de persulfate d’ammonium et 0,5 % en volume, N, N, N', tétraméthyléthylènediamine.
   2. Mélanger les solutions de gel de résolution comme suit : 12 % en poids/vol d’acrylamide, 30 μM d’acrylamide Phos-tag, 60 μM de MnCl₂, 0,1 % en poids/vol SDS, 375 mM de Tris-HCl (pH = 8,8), 0,05 % en poids/vol de persulfate d’ammonium et 0,25 % en volume/vol de tétraméthyléthylènediamine.
2. Préparez l’échantillon pour l’électrophorèse.
   1. Ajouter et mélanger 1 mM de MnCl₂ à l’échantillon issu de la réaction kinase in vitro.
3. Effectuez une électrophorèse et un western blot.
   1. Faites fonctionner le gel à 150 V pendant 80 min dans un tampon de fonctionnement (0,1 % en poids/vol SDS, 25 mM de Tris et 192 mM de glycine).
   2. Après l’électrophorèse, trempez le gel dans un tampon de transfert EDTA (+) (10 mM EDTA, 50 mM Tris, 380 mM de glycine, 0,000375 % poids/vol SDS et 20 % poids/vol d’éthanol) pendant 10 min, puis dans le tampon de transfert pendant 10 min.
   3. Transférer les protéines sur une membrane PVDF à 15 V pendant 30 min dans un tampon de transfert.
   4. Secouez la membrane en continu avec du lait écrémé en poudre pendant 30 min en RT. Après le blocage, laver la membrane 3x avec du TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,001 % Tween).
   5. Trempez la membrane avec l’anticorps primaire (anti-MLC2v, 1:4 000 ; Abcam ab92721) pendant la nuit à 4 °C.
   6. Lavez la membrane 3 fois avec du TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl et 0,001 % Tween).
   7. Trempez la membrane avec l’anticorps secondaire (HRP couplé à la chèvre anti-lapin 1:8 000 ; Cappel, #55696) pendant 1 h à RT.
   8. Lavez la membrane 3x avec TTBS.
4. Détecter et analyser les protéines sur la membrane.
   1. Ajoutez le réactif de détection ECL (Enhanced Chemi Luminescence reagent) à la membrane pendant 1 min à RT.
   2. Détectez les protéines sur la membrane à l’aide d’un LAS-4000 au moment optimal.
   3. Quantifiez le MLC2v phosphorylé et non phosphorylé, en soustrayant la densitométrie de fond à l’aide du logiciel ImageQuant TL.

5. Essai de détection ADP bioluminescent

REMARQUE : Le test de détection de l’ADP bioluminescent a été réalisé conformément au protocole du fabricant.

1. Arrêtez la réaction kinase en ajoutant 40 μL de réactif de déplétion de l’ATP dans la solution de réaction de dosage de kinase. Bien mélanger et incuber pendant 30 min à RT.
2. Ajouter 80 μL de réactif de détection ADP. Bien mélanger et incuber pendant 30 min à RT.
3. Mesurez la luminescence à l’aide d’un luminomètre avec un temps d’intégration maximal suggéré de 0,5 s par puits.
4. Convertissez l’intensité de luminescence en concentration ADP à l’aide d’une courbe d’étalonnage.
5. Calculer la quantité de phosphates utilisée pour la phosphorylation de MLC2v.
   REMARQUE : L’ADP total produit pendant la réaction kinase est mesuré comme décrit ci-dessus. L’ADP de fond, y compris l’autophosphorylation de cMLCK, est mesurée sur la base d’une réaction sans MLC2v, et la quantité d’ADP utilisée pour la phosphorylation de MLC2v est évaluée en soustrayant l’ADP de fond de l’ADP total.

6. Analyse des données

1. Ajustez les données à l’équation de Michalis-Menten à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié. Les données sont exprimées en moyenne ± en écart-type.

La méthode classique de mesure de l’activité kinase est un test radiométrique qui quantifie le phosphate radiomarqué incorporé dans le substrat kinase. Pour la méthode présentée ici, un test de kinase cMLCK in vitro non radioactif utilisant du cMLCK de type sauvage purifié (figure 1A), MLC2v et de la calmoduline a été mis au point (figure 1B), et l’activité de la kinase a été déterminée à l’aide d’un tes...

La présente étude a été entreprise afin d’évaluer si la combinaison de méthodes non radioactives, du test de détection de l’ADP bioluminescent et de l’affinité phosphate SDS-PAGE pouvait être utilisée avec succès pour déterminer l’activité de la cMLCK. Il est essentiel d’effectuer les réactions kinases dans des conditions optimales de température et de temps de réaction. L’augmentation de l’un ou l’autre de ces éléments favorisera rapidement et fortement...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail a été soutenu en partie par JSPS KAKENHI Grant Number JP17K09578 et JP18H04050.