Комплексный анализ прокоагулянтных тромбоцитов, проявляющих признаки некроза, апоптоза и активации тромбоцитов

Настоящий протокол предоставляет полный набор процедур, необходимых для анализа прокоагулянтных тромбоцитов, которые демонстрируют перекрывающиеся признаки некроза, апоптоза и активации тромбоцитов.

Тромбоциты, циркулирующие в кровотоке, относительно спокойны, но становятся «активируемыми» при встрече со стимуляторами или «агонистами» в месте повреждения кровеносных сосудов. Проагрегаторные и прокоагулянтные тромбоциты представляют собой две различные популяции активированных тромбоцитов. В то время как проагрегаторные тромбоциты способствуют остановке кровотечения, или «гемостаза», образуя пробку из тромбоцитов, слипшихся через фибриногеновые мостики, прокоагулянтные тромбоциты резко ускоряют коагуляционный каскад, достигая кульминации в образовании фибринового сгустка. Интересным аспектом прокоагулянтных тромбоцитов является то, что их морфология проявляет определенные черты «некроза» и «апоптоза». Таким образом, они могут представлять собой форму клеточной смерти тромбоцитов, хотя и играют важную роль в тромбозе и гемостазе. В данной статье представлено понятие прокоагулянтных тромбоцитов, их значение для здоровья и заболевания, а также сравнение существующих методов их анализа. Затем он предоставляет исчерпывающие протоколы для анализа прокоагулянтных тромбоцитов, изучения механизмов их образования и оценки их протромботической роли в содействии коагуляции. Статья завершается обсуждением ключевых шагов, ограничений и принципов устранения неполадок для описанных методов.

Существует, по крайней мере, две различные популяции активированных тромбоцитов ^1,2. Проагрегационные тромбоциты характеризуются высокой активацией интегринов и низким, если таковой имеется, экспозицией PS. С другой стороны, прокоагулянтные тромбоциты характеризуются низкой интегринной активностью и высокой экспозицией ПС ^1,2, обеспечивая поверхность для сборки комплексов теназы и протромбиназы³, которая в 10^5-10 раз в⁶ и 300000 раз активнее отдельных растворимых фазовых факторов IXa и Xa соответственно⁴. Таким образом, прокоагулянтные тромбоциты резко ускоряют свертывание крови. Интересным аспектом прокоагулянтных тромбоцитов является то, что их морфология напоминает некоторые признаки «некроза», такие как микровезикуляция, раздувание клетки с нарушением цитоскелета и потеря целостности мембраны, а также «апоптоза», такого как потеря фосфолипидной асимметрии мембраны при воздействии фосфатидилсерина на наружный листок ^5,6. Другими словами, образование прокоагулянтных тромбоцитов может представлять собой форму гибели клеток тромбоцитов, хотя и с важной физиологической функцией в гемостазе.

Прокоагулянтные тромбоциты в значительной степени связаны с тромботическими нарушениями. В то время как большинство здоровых людей не имеют циркулирующих прокоагулянтных тромбоцитов, ~30% нормальных донорских тромбоцитов принимают прокоагулянтный фенотип ex vivo после воздействия сильных агонистов, таких как тромбин и коллаген⁷. Сообщалось о циркулирующих прокоагулянтных тромбоцитах при травме, где их образование может отражать активацию гистоном H4 ^8,9. Однако при большинстве протромботических расстройств повышенный уровень прокоагулянтных тромбоцитов обнаруживается только после стимуляции ex vivo10. Например, пациенты с острым инсультом, у которых >51,1% тромбоцитов были преобразованы в прокоагулянтные тромбоциты (также известные как тромбоциты COAT) с помощью коллагена и тромбина, имели отношение рисков 10,72 для повторного инсульта в течение 30 дней по сравнению с пациентами с меньшим образованием прокоагулянтных тромбоцитов¹¹. Аналогичные результаты были зарегистрированы у пациентов с транзиторными ишемическими атаками и каротидным атеросклерозом¹². Напротив, синдром Скотта с нарушением свертываемости крови является результатом мутации ANO6, которая кодирует фосфолипидскрамблазу TMEM-16F, что приводит к недостаточному воздействию тромбоцитарного PS¹³. Идиопатические нарушения свертываемости крови и внутричерепные кровотечения могут быть связаны со снижением способности вырабатывать прокоагулянтные тромбоциты¹⁴.

Таким образом, оценка прокоагулянтных тромбоцитов является частью любого анализа функции тромбоцитов не только при базовом исследовании механизмов активации тромбоцитов и последующего тромбоза и гемостаза, но и при клиническом анализе риска тромбоза или кровотечения у пациентов при различных патологических состояниях. Группа экспертов Международного общества по тромбозу и гемостазу (ISTH) рекомендовала использовать связывание Аннексина V и экспрессию Р-селектина методом проточной цитометрии для дифференциации прокоагулянтов из других субпопуляций тромбоцитов¹⁵. В статье также обсуждаются различные методы, которые могут быть использованы для анализа прокоагулянтных и апоптотических тромбоцитов, но подробно описываются процессы. Эти методы включают обнаружение (1) активации тромбоцитов с помощью PAC1/JonA или связывания фибриногена (проточная цитометрия); (2) секреция альфа-гранул с помощью экспрессии Р-селектина (проточная цитометрия); (3) воздействие ФС путем связывания аннексина V/лактадерина (проточная цитометрия); (4) потеря целостности мембраны при мечении GSAO (проточная цитометрия); (5) морфологические изменения, такие как баллонирование (микроскопия); (6) обнаружение активации каспазы с помощью анализа каспазы (иммуноблоттинг/люминометрия/проточная цитометрия) или деградации цитоскелетного субстрата гелсолина (иммуноблоттинг); (7) потеря потенциала митохондриальной мембраны митохондриальными потенциал-чувствительными красителями, такими как JC-1/Mitotracker (проточная цитометрия); (8) митохондриальные внутренние апоптотические маркеры Bax, Bak и высвобождение цитохрома с (иммуноблоттинг); (9) функция прокоагулянтов по анализу генерации тромбина и связыванию фактора свертывания крови Xa/Va (проточная цитометрия, микроскопия); (10) цитозольный и митохондриальный кальций повышаются с помощью флуоресцентных кальций-чувствительных красителей (проточная цитометрия, флуориметрия, микроскопия).

В настоящем исследовании подробно рассматриваются протоколы анализа прокоагулянтных тромбоцитов, а также их отличия от проагрегационных и апоптотических тромбоцитов. Большинство описанных процедур основаны на проточной цитометрии, которая имеет следующие преимущества: (1) она легко доступна и проста в использовании, (2) требует небольшого объема образца и (3) позволяет одновременно обнаруживать несколько субпопуляций тромбоцитов (проагрегационных, прокоагулянтных и апоптотических)¹⁵. Эти протоколы, основанные на проточной цитометрии, дополнены функциональными анализами активности прокоагулянтов на основе связывания с фактором свертывания крови и анализами генерации тромбина на основе тромбов.

Люди были набраны для забора крови из периферических вен после получения письменного информированного согласия, строго следуя рекомендациям и одобрению Институционального наблюдательного совета Научно-исследовательского института Лернера Кливлендской клиники, при этом все методологии исследования соответствовали стандартам, установленным Хельсинкской декларацией. Были включены здоровые взрослые участники старше 18 лет, в то время как лица моложе 18 лет, лица с недавним анамнезом тромботических событий в течение последних шести месяцев, лица с историей алкоголизма или злоупотребления наркотиками, а также участники, которые использовали антитромбоцитарные или антикоагулянтные препараты в течение последних четырех недель, были исключены. С подробным описанием материалов и реагентов, используемых в протоколах, можно ознакомиться в Таблице материалов.

1. Подготовка тромбоцитов

1. Забор образцов периферической венозной крови в антикоагулянт ACD (1:9 v/v) у участников после получения письменного информированного согласия, строго следуя рекомендациям, утвержденным Институциональным наблюдательным советом.
2. Центрифугируйте кровь, собранную в ACD при 100 x g, в течение 20 мин при 22 °C с получением обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) в качестве надосадочной жидкости.
3. Центрифугируйте PRP при 800 x g в течение 7 мин при 22 °C после добавления 3 мкМ PGE₁ и 2 мМ ЭДТА.
4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте тромбоцитарную гранулу в буфере А (см. Таблицу материалов) с помощью осторожного пипетирования.
5. Центрифугируйте тромбоциты, ресуспендированные в буфере А при 800 x g в течение 7 мин при 22 °C.
6. Ресуспендируйте тромбоцитарную гранулу в буфере В (см. Таблицу материалов) с помощью щадящего пипетирования.
7. Отрегулируйте итоговое количество тромбоцитов до 1 × 10⁷/мл с помощью автоматического счетчика клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги в стерильных условиях и принимайте меры предосторожности для поддержания тромбоцитов в состоянии покоя, избегая воздействия чрезмерного сдвига во время пипетирования.

2. Анализ прокоагулянтных тромбоцитов методом проточной цитометрии

1. Дополните промытые тромбоциты человека 2,5 мМ кальцием (0,5 мкл стокового раствора CaCl₂ 0,5 М в 100 мкл тромбоцитарной суспензии).
2. Не стимулируйте одну фракцию тромбоцитов и стимулируйте остальные фракции тромбином (0,1 Ед/мл, 0,25 Ед/мл, 0,5 Ед/мл), конвульксином (20 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл) или их комбинацией в течение 15 мин при комнатной температуре.
3. После стимуляции добавьте по 1 мкл PE-аннексина V, FITC-PAC1 и антитела APC-античеловеческого CD62P к 100 мкл стимулированных тромбоцитарных суспензий.
4. Инкубируйте тромбоциты в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут.
5. Зафиксируйте тромбоциты, добавив равный объем (1:1) 2% формалина.
6. Анализ образцов с помощью проточной цитометрии для количественного определения прокоагулянтных тромбоцитов^15,16.
7. Нарисуйте аморфный затвор, чтобы охватить тромбоциты, отделив их от шума и мультитромбоцитарных частиц.
8. Соберите все флуоресцентные данные с помощью четырехквадрантной логарифмической амплификации для 10 000 событий в тромбоцитарном затворе из каждого образца.
9. Определите области для тромбоцитов на основе положительной или отрицательной флуоресцентной способности к воздействию фосфатидилсерина (PS) (связывание с аннексином V), экспрессии P-селектина (CD62P) и активации интегрина αIIbβ₃ (связывание PAC1).
10. Рассматривайте тромбоциты положительными как для воздействия PS (связывание с аннексином V), так и для экспрессии P-селектина (CD62P), но отрицательными для активации интегрина αIIbβ₃ (связывание PAC1) в качестве прокоагулянтных тромбоцитов (рис. 1) (табл. 1).
11. Аналогичным образом, рассматривайте тромбоциты положительными как для активации интегрина αIIbβ₃ (связывание PAC1), так и с экспрессией P-селектина (CD62P), но отрицательными для экспозиции PS (связывание с аннексином V) в качестве проагрегаторных тромбоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбоциты, отрицательные как по активации интегрина αIIbβ₃ (связывание PAC1), так и по экспрессии P-селектина (CD62P), но положительные по воздействию PS (связывание с аннексином V), вероятно, являются апоптотическими тромбоцитами^15,16.

3. Анализ митохондриального кальция методом проточной цитометрии

1. Разведите промытые тромбоциты человека до 1 × 10⁶/мл и добавьте 2,5 мМ кальция (0,5 мкл стокового раствора CaCl₂ 0,5 М в 100 мкл тромбоцитарной суспензии).
2. Пометьте тромбоциты 5 мкМ Rhod-2 AM (для митохондриального кальция) в течение 30 минут в темноте.
3. Загатите тромбоциты соответствующим образом, как описано в шаге 2.
4. Проанализируйте события в тромбоцитарном затворе на предмет зависящих от времени изменений средней флуоресценции зарегистрированных событий в течение 5 мин с помощью диаграммы плотности рассеяния флуоресценции ПЭ (для Rhod-2 AM) в зависимости от времени.
5. Запишите исходный уровень кальция в течение первой 1 минуты.
6. Добавьте тромбин (0,1 ЕД/мл, 0,25 ЕД/мл или 0,5 ЕД/мл), конвульксин (20 нг/мл, 50 нг/мл или 100 нг/мл) или их комбинацию и продолжайте сбор данных еще 4 мин¹⁷.

4. Анализ потенциала митохондриальной мембраны методом проточной цитометрии

1. Дополните промытые тромбоциты человека 2,5 мМ кальцием (0,5 мкл стокового раствора CaCl₂ 0,5 М в 100 мкл тромбоцитарной суспензии).
2. Не стимулируйте одну фракцию тромбоцитов и стимулируйте остальные фракции тромбином (0,1 Ед/мл, 0,25 Ед/мл или 0,5 Ед/мл), конвульксином (20 нг/мл, 50 нг/мл или 100 нг/мл) или их комбинацией в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. После стимуляции к стимулированным взвесям тромбоцитов добавляют краситель для мечения митохондрий (см. Таблицу материалов) в конечной концентрации 500 нМ.
4. Инкубируйте тромбоциты в течение 30 минут в темноте.
5. Зафиксируйте тромбоциты, добавив равный объем 2% формалина.
6. Анализ образцов методом проточной цитометрии¹⁷.
7. Загатите тромбоциты соответствующим образом, как описано в шаге 2.
8. Проанализируйте события в тромбоцитарном затворе на предмет снижения флуоресценции в ПЭ-канале (для красителя для мечения митохондрий) проточного цитометра.

5. Анализ активности каспазы 3 и каспазы 8 методом проточной цитометрии

1. Дополните промытые тромбоциты человека 2,5 мМ кальцием (0,5 мкл стокового раствора CaCl₂ 0,5 М в 100 мкл тромбоцитарной суспензии).
2. Не стимулируйте одну фракцию тромбоцитов и стимулируйте остальные фракции тромбином (0,1 Ед/мл, 0,25 Ед/мл или 0,5 Ед/мл), конвульксином (20 нг/мл, 50 нг/мл или 100 нг/мл) или их комбинацией в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. После стимуляции добавьте к стимулированным тромбоцитарным суспензиям реагент для обнаружения апоптоза в соотношении 1:1000 (v/v) (см. Таблицу материалов) (для внутренних и внешних путей апоптоза) или 1:300 (v/v) FITC-IETD-FMK (для каспазы 8 внешнего пути апоптоза).
4. Инкубируйте тромбоциты в течение 30 минут в темноте.
5. Зафиксируйте тромбоциты, добавив равный объем 2% формалина.
6. Анализ образцов методом проточной цитометрии¹⁷.
7. Загатите тромбоциты соответствующим образом, как описано в шаге 2.
8. Проанализируйте события в тромбоцитарном затворе на флуоресценцию в канале FITC (для каспазы 3/7 или каспазы 8) проточного цитометра.

6. Анализ связывания протромбина методом проточной цитометрии

1. Конъюгировать бычий протромбин с красителем Alexa Fluor 488 с помощью набора для маркировки белка (см. Таблицу материалов), следуя инструкциям производителя.
2. Дополните промытые тромбоциты человека 2,5 мМ кальцием (0,5 мкл стокового раствора CaCl₂ 0,5 М в 100 мкл тромбоцитарной суспензии).
3. Не стимулируйте одну фракцию тромбоцитов и стимулируйте остальные фракции тромбином (0,1 Ед/мл, 0,25 Ед/мл или 0,5 Ед/мл), конвульксином (20 нг/мл, 50 нг/мл или 100 нг/мл) или их комбинацией в течение 15 минут при комнатной температуре.
4. После стимуляции добавьте AF488-конъюгированный бычий протромбин (100 мкг/мл) и по 1 мкл антител PE-аннексин V и APC против человеческого CD62P к 100 мкл стимулированных тромбоцитарных суспензий.
5. Зафиксируйте тромбоциты, добавив равный объем 2% формалина.
6. Анализируйте образцы с помощью проточной цитометрии¹⁷ для количественного определения связывания протромбина с тромбоцитами.
7. Нарисуйте аморфный затвор, чтобы охватить тромбоциты, отделенные от шума и многотромбоцитарных частиц.
8. Соберите все флуоресцентные данные с помощью четырехквадрантной логарифмической амплификации для 10 000 событий в тромбоцитарном затворе из каждого образца.
9. Нарисуйте области для тромбоцитов с положительной или отрицательной флуоресценцией на воздействие PS (связывание с аннексином V), экспрессию P-селектина (CD62P) и AF488-протромбина (связывание с протромбином).
10. Определите долю всех тромбоцитарных событий, а также долю тромбоцитов, положительных как на воздействие PS (связывание с Аннексином V), так и на экспрессию P-селектина (CD62P) (прокоагулянтные тромбоциты), которые являются положительными на связывание с протромбином.

7. Анализ связывания протромбина методом конфокальной микроскопии

1. Конъюгировать бычий протромбин с красителем Alexa Fluor 488 с помощью набора для маркировки белка (см. Таблицу материалов), следуя инструкциям производителя.
2. Дополните промытые тромбоциты человека 2,5 мМ кальцием (0,5 мкл стокового раствора CaCl₂ 0,5 М в 100 мкл тромбоцитарной суспензии).
3. Не стимулируйте одну фракцию тромбоцитов и стимулируйте остальные фракции тромбином (0,1 Ед/мл, 0,25 Ед/мл или 0,5 Ед/мл), конвульксином (20 нг/мл, 50 нг/мл или 100 нг/мл) или их комбинацией в течение 15 минут при комнатной температуре.
4. После стимуляции добавьте AF488-конъюгированный бычий протромбин (100 мкг/мл) и по 1 мкл антител PE-аннексин V и APC против человеческого CD62P к 100 мкл стимулированных тромбоцитарных суспензий.
5. Зафиксируйте тромбоциты, добавив равный объем 2% формалина.
6. Гранулируйте зафиксированные тромбоциты на покровные стекла, покрытые поли-D-лизином.
7. Закрепите покровные стекла на предметных стеклах для микроскопии с помощью решения против выцветания.
8. В качестве альтернативы можно нанести покровные салфетки с коллагеном (100 мкг/мл) на 1 час во влажной камере.
9. Заблокируйте покровные стекла с покрытием 0,5% BSA в PBS на 1 час.
10. Пометьте тромбоциты AF488-конъюгированным бычьим протромбином (100 мкг/мл) и по 1 мкл PE-аннексина V и антитела APC против человеческого CD62P.
11. Дайте меченым тромбоцитам прилипнуть в течение 20 минут на покровных стеклах, покрытых коллагеном.
12. Промойте покровные листы с прилипшими тромбоцитами три раза с PBS.
13. Закрепить покровные стекла 2% параформальдегидом на 1 ч.
14. Закрепите покровные стекла на предметных стеклах для микроскопии с помощью решения против выцветания.
15. Наблюдайте за предметными стеклами под конфокальным микроскопом при увеличении объектива 63×.
16. Анализируйте изображения с помощью программного обеспечения Fiji для количественной оценки флуоресценции.

8. Анализ фосфолипид-зависимого образования тромбина на основе тромбов

1. Дополните промытые тромбоциты человека 2,5 мМ кальцием (0,5 мкл стокового раствора CaCl₂ 0,5 М в 100 мкл тромбоцитарной суспензии).
2. Не стимулируйте одну фракцию тромбоцитов и стимулируйте остальные фракции тромбином (0,1 Ед/мл, 0,25 Ед/мл или 0,5 Ед/мл), конвульксином (20 нг/мл, 50 нг/мл или 100 нг/мл) или их комбинацией в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. Добавьте 100 мкл обработанных тромбоцитов к смеси из 50 мкл объединенной нормальной плазмы и 50 мкл раствора каолина с низкой мутностью (20 мг/мл), предварительно инкубированной при 37 °C в течение 5 мин.
4. Добавьте в смесь 5 мМ CaCl₂ .
5. Контролируйте образование тромба с помощью мутиметрии на микропланшетном ридоре, измеряя поглощение при длине волны 660 нм каждые 60 с в течение 1 ч.

Часть активированных тромбоцитов становится «прокоагулянтной» с характерным увеличением поверхностной экспрессии как фосфатидилсерина (ФС), так и Р-селектина, что отличает их от «апоптотических» тромбоцитов, положительных только на воздействие ФС, а также от «проагрегаторных» тромбоцитов, положительных на экспрессию Р-селектина. Мы обнаружили, что тромбин индуцирует дозозависимое увеличение доли прокоагулянтных тромбоцитов, положительных как на экспрессию P-селектина, так и на PS, что обнаруживается при связывании антител FITC-анти-CD62P и PE-аннексина V соответственно (рис. 2). Генерация прокоагулянтных тромбоцитов зависит от притока митохондриального кальция^18,19 вдоль электрохимического градиента через внутреннюю митохондриальную мембрану, от индуцированного агонистами повышения цитозольного кальция, а также от последующего образования циклофилина D (CypD)-зависимого от митохондриальной проницаемости переходной поры (mPTP)²⁰. В целом, индуцированное тромбином увеличение активности прокоагулянтов было связано с увеличением митохондриального кальция (рис. 3) и снижением потенциала митохондриальной мембраны (рис. 4), измеренным с помощью красителей Rhod-2 и Mitotracker Red соответственно. Стимулированные тромбоциты демонстрируют признаки апоптоза, включая накопление Bax/Bak^21,22; Активирует ли это каспазу^23,24 и способствует ли это воздействию PS²⁵, остается спорным. Стимуляция тромбином тромбоцитов была связана с активацией каспазы 8, но не терминальных каспаз 3 и 7 (рис. 5), что было проанализировано с помощью FITC-IETD-FMK и реагента для обнаружения апоптоза, соответственно.

Рисунок 1: Анализ прокоагулянтных тромбоцитов. Принципиальная диаграмма, изображающая анализ прокоагулянтных тромбоцитов методом проточной цитометрии с использованием антител FITC-PAC1, APC-anti-CD62P и PE-Annexin V в качестве флуоресцентных зондов для определения активации интегрина, экспрессии P-селектина и экспозиции PS соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Экспрессия P-селектина и экспозиция фосфатидилсерина в тромбоцитах при стимуляции тромбином. Репрезентативные точечные диаграммы, показывающие положительные результаты тромбоцитов на экспрессию P-селектина и/или экспозицию PS в (A) нестимулированных тромбоцитах и при воздействии тромбина в дозах (B) 0,1 Ед/мл, (C) 0,25 Ед/мл и (D) 0,5 Ед/мл, обнаруженных с помощью флуоресценции FITC-anti-CD62P и PE-аннексина V с помощью проточной цитометрии. Цифры в скобках указывают на долю общего количества тромбоцитов в каждом квадранте графика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Зависящие от времени изменения уровня кальция в митохондриях в тромбоцитах при воздействии тромбина. Репрезентативные графики плотности, показывающие зависящие от времени изменения флуоресценции под действием красителя Rhod-2, указывающие на уровни митохондриального кальция в тромбоцитах при воздействии тромбина в дозах (A) 0,1 Ед/мл, (B) 0,25 Ед/мл и (C) 0,5 Ед/мл, обнаруженных с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Потенциал митохондриальной мембраны в тромбоцитах при стимуляции тромбином. На этом рисунке показаны репрезентативные наложения гистограммы, изображающие флуоресценцию из-за мечения митохондрий красителем, указывающим на потенциал митохондриальной мембраны в тромбоцитах при воздействии различных доз тромбина, как это обнаруживается с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Активность каспазы 3/7 и каспазы 8 в тромбоцитах при стимуляции тромбином. Репрезентативные наложения гистограммы, показывающие флуоресценцию под действием (A) реагента для обнаружения апоптоза и (B) FITC-IETD-FMK, соответственно, указывают на активность каспазы 3/7 и каспазы 8 в тромбоцитах при воздействии различных доз тромбина, обнаруженных с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Маркеры проточной цитометрии для идентификации популяций тромбоцитов после стимуляции. В этой таблице представлены маркеры проточной цитометрии, используемые для обнаружения различных популяций тромбоцитов, которые появляются после стимуляции тромбоцитов сильными агонистами, такими как тромбин и конвульксин.

Прокоагулянтные тромбоциты демонстрируют заметное и устойчивое повышение внутриклеточного кальция при стимуляции²⁶, но могут быть получены с помощью различных механизмов. Они образуются при сильной стимуляции агонистами коллагеном и тромбином через различные медиаторы, включая наиболее заметный приток митохондриального кальция^18,19 вдоль электрохимического градиента через внутреннюю митохондриальную мембрану при индуцированном агонистами повышении цитозольного кальция. Как только митохондриальный кальций достигает определенного порога, он активирует образование переходных пор митохондриальной проницаемости (mPTP) циклофилином D (CypD^)-зависимым образом. Когда митохондрии проникают в кальций и больше не могут служить поглотителями для цитозольного кальция, сверхмаксимальная передача сигналов кальция наблюдается после образования mPTP²⁶. Устойчиво высокие уровни цитозольного кальция, в свою очередь, активируют активацию TMEM16F кальций-зависимой фосфолипидскрамлазы, что приводит к воздействию PS^27,28. Экспозиция ФС сопровождается инактивацией интегрина_{α IIb}β_{3 по} двойному механизму, включающему кальпаин-зависимое расщепление интегрина β₃ цитоплазматического хвоста, а также TMEM16F-зависимое скремблирование самих фосфолипидов^29,30. Таким образом, прокоагулянтные тромбоциты, в отличие от проагрегаторных тромбоцитов, имеют неактивный интегрин. Кроме того, воздействие ФС обеспечивает поверхность для связывания факторов свертывания, облегчая сборку комплексов теназы и протромбиназы³. Таким образом, прокоагулянтные тромбоциты значительно ускоряют коагуляцию⁴.

Экспозиция ФС и последующая прокоагулянтная активность также могут быть индуцированы каспазозависимым расщеплением скрамблазы XKR8 в тромбоцитах, подвергающихся внутреннему апоптозу, независимо от активации^25,31. Несмотря на то, что стимулированные тромбоциты демонстрируют признаки внутреннего апоптоза, включая накопление Bax/Bak^21,22, вопрос о том, активирует ли это каспазы^23,24 и способствует ли это воздействию PS²⁵, остается спорным. О внешнем апоптозе TNFα или FasL в тромбоцитах не сообщалось, несмотря на присутствие большинства компонентов и некоторые доказательства активации каспазы 8³². Тромбоциты при длительной стимуляции подвергаются MLKL-опосредованному некроптозу¹⁷, который, как известно, индуцирует воздействие PS независимо от CypD или каспазы³³.

В этом исследовании был предложен метод детектирования прокоагулянтных тромбоцитов с использованием экспозиции PS (связывание с аннексином V), экспрессии P-селектина (CD62P) и активации интегрина_{α IIb}β₃ (связывание PAC1) в качестве маркеров. Эти маркеры могут помочь эффективно отличить прокоагулянтные тромбоциты от апоптотических и проагрегаторных тромбоцитов¹⁵. Однако связывание аннексина V требует наличия высокого уровня кальция в среде. Следовательно, гепарин или другие ингибиторы тромбина должны использоваться при использовании обогащенной тромбоцитами плазмы или образцов цельной крови. Кроме того, ингибитор полимеризации фибрина GPRP используется, когда тромбин должен быть использован в качестве одного из агонистов с этими образцами^34,35. Лактадерин или GSAO могут быть использованы в качестве альтернативных маркеров аннексину V, но у них есть свои ограничения. В то время как лактадерин не специфичен к PS и связывается с интегринами^36,37, GSAO не является коммерчески доступным и может быть получен только в рамках исследовательского сотрудничества³⁸.

В данной статье также представлены дополнительные методы исследования механизмов воздействия ФС, включая приток митохондриального кальция и образование переходных пор митохондриальной проницаемости (потеря потенциала митохондриальной мембраны). Здесь следует отметить, что эти методы могут быть дополнены измерениями цитозольного кальция с использованием красителей Fluo-4 и Fluo-5N. Поскольку остается неясным, способствует ли активация каспазы воздействию PS в стимулированных тромбоцитах, мы также перечисляем протоколы для анализов активации каспазы 8 и каспазы 3/7. Истинная «прокоагулянтная» природа тромбоцитов может быть подтверждена только их способностью связывать факторы свертывания крови и способствовать образованию тромбина. Таким образом, тщательное исследование тромбоцитов на предмет экспозиции PS (связывание с аннексином V), экспрессии P-селектина (CD62P) и активации интегрина_IIbβ₃ интегрина α (связывание PAC1), притока митохондриального кальция, потенциала митохондриальной мембраны, активности каспазы вместе со связыванием фактора свертывания крови (протромбина) и генерации/коагуляции фосфолипид-зависимого тромбина тромбоцитов, как описано в настоящей статье, было бы необходимым и достаточным для всестороннего анализа прокоагулянтных тромбоцитов.

Авторы не имеют конкурирующих интересов для раскрытия информации.

Пареш. Кулкарни и Кит Р. МакКрей, соответственно, отмечают гранты стипендиатов и пилотов, финансируемые VeloSano, Фондом клиники Кливленда.