정상 조직에서 암 조직으로의 진행을 모델링하는 식도 오가노이드의 확립 및 조직학적 분석

본 프로토콜은 종양 진행의 여러 단계를 나타내는 식도 오가노이드 모델의 확립 및 조직학적 분석을 설명합니다. 이 방법을 통해 연구자들은 정상 조직에서 암 조직으로 전환하는 동안 세포 형태, 공간 조직 및 분자 마커 발현 패턴의 변화를 연구할 수 있습니다.

오가노이드는 종양 형성과 암 치료에 대한 이해를 증진하기 위한 중추적인 도구로 부상했습니다. 다양한 종양 단계를 나타내는 인간 오가노이드 모델을 생성하고 조직학적 분석을 수행함으로써 종양이 진행됨에 따라 세포 형태, 공간 구조 및 주요 분자 마커의 발현의 변화에 대해 더 깊이 이해할 수 있습니다. 이 연구는 식도 편평 세포 오가노이드의 확립 및 배양을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 또한 이 프로토콜은 고정, 포매 및 염색과 같은 기술을 활용하여 오가노이드 내 중요 분자의 발현 패턴과 공간 조직을 평가하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 식도 편평 상피 세포의 공간 구조와 종양 형성 중 다양한 종양 바이오마커의 발현에서 중요한 변화가 확인되었습니다. 이 프로토콜은 오가노이드의 구성 및 조직학적 분석을 용이하게 하여 연구자들이 종양 형성 및 치료 개입의 여러 단계에서 상피 세포의 공간 구조 및 분자 변화를 조사할 수 있도록 합니다.

종양 형성은 세포 ^1,2의 점진적인 분자 및 형태학적 변화를 특징으로 하는 복잡한 다단계 과정입니다. 예후가 좋지 않은 유병률 종양인 식도 편평 세포 암종(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC) ^3,4은 정상 점막, 저등급 상피내 종양(low-grade epiithelial neoplasia, LGIN), 고등급 상피내 종양(high-grade epiithelial neoplasia, HGIN), 침습성 암종(invasive carcinoma)⁵의 4단계를 통해 단계적으로 진행된다. 이러한 단계를 거치면서 상피 세포는 분자 발현 패턴과 공간 조직에 역동적인 변화를 보이며, 정상 상태에서 악성 상태로 진행됨에 따라 조직 형태학의 체계적인 변화를 동반합니다 ^6,7. 배아줄기세포(ESCC) 발병기전에 대한 이해가 진전되었음에도 불구하고, 체계적인 조직학 및 분자 분석을 가능하게 하면서 종양 진화의 공간적, 시간적 측면을 충실하게 요약하는 실험 모델의 부족으로 인해 질병 진행과 치료 개발에 대한 심층적인 기계론적 이해가 저해되고 있습니다.

2D 불멸화 암 세포주는 종양발생에 대한 이해에 상당한 기여를 했지만, 본래 종양의 생물학적 복잡성과 병리학적 특징을 복제하는 데는 본질적으로 제한적입니다⁸. 동물 모델은 생체 내 맥락을 제공하기는 하지만, 종별 차이로 인해 인간의 반응을 제대로 예측하지 못하는 경우가 많다⁹. 이와는 대조적으로, 오가노이드는 인간 조직의 세포 이질성, 구조 및 기능을 충실히 보존하는 혁신적인 전임상 플랫폼으로 부상했습니다 10,11,12,13. 전임상 모델로서 오가노이드는 원발성 종양의 특성을 더 잘 포착하여 종양 진행 중 주요 분자 사건 및 세포 변화를 자세히 조사할 수 있습니다¹⁴. 예를 들어, Chen 등은 상피-섬유아세포 상호작용을 규명하기 위해 ESCC의 여러 단계에서 환자 유래 식도 오가노이드를 활용했으며, 궁극적으로 ANXA1-FPR2 신호축이 ESCC 발병의 중요한 동인임을 입증했습니다⁶. 이와 유사하게, Ko 등은 유전자 조작 식도 오가노이드를 사용하여 ESCC 발병 및 면역 회피를 유발하는 주요 유전적 결정 요인을 규명했으며, 이를 통해 오가노이드 모델이 어떻게 질병의 특징을 효과적으로 요약하고 새로운 치료 표적을 밝힐 수 있는지를 입증했다¹⁵.

본 방법론은 정상 상피에서 침습성 암종으로의 조직학적 진행을 반영하는 다단계 ESCC 오가노이드를 생성하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 수립하여 식도암 모델링의 중요한 문제를 해결합니다. 이 시스템은 조직학적 처리 및 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 표준화된 프로토콜과 결합된 L-WRN 컨디셔닝 배지를 사용하여 최적화된 배양 조건을 통합하여 종양 형성 중 공간 및 분자 변화를 종적으로 분석할 수 있는 이상적인 플랫폼을 제공합니다. 2D 배양과 같은 대체 기술과 비교했을 때, 이 오가노이드 플랫폼은 조직 구조를 고유하게 보존하여 T 세포 반응을 억제하여 종양 면역 회피를 매개하는 면역 관문 단백질 PD-L1(CD274)을 포함하여 공간적으로 조직된 분자 마커를 시각화할 수 있습니다 16,17,18, 그리고 확산 마커 Ki-67. 이 프로토콜은 정상 식도 및 전암성 조직에서 오가노이드가 통과할 수 있도록 하여 연구자들이 정상 조직에서 종양까지 연속 오가노이드 모델을 구축하는 데 도움이 됩니다¹⁹. 종양 형성 중 공간 및 분자 변화에 대한 자세한 분석을 가능하게 함으로써 이 프로토콜은 연구자들에게 암 발생 및 진행의 기저에 있는 메커니즘을 이해할 수 있는 강력한 도구를 제공하여 잠재적으로 개선된 치료 전략으로 이어질 수 있습니다.

이 방법론은 상피 암발생, 종양 미세환경 상호 작용 또는 배아줄기세포 및 관련 편평 악성 종양의 치료 반응을 조사하는 연구자에게 특히 적합합니다. 모듈식 설계로 인해 적절한 검증 단계가 통합된 경우 다른 분자 마커 또는 신호 전달 경로를 연구할 수 있습니다. 표준화되었지만 유연한 플랫폼을 제공함으로써 이 프로토콜은 종양 생물학의 전임상 연구를 발전시키고 기계론적 통찰력을 표적 치료로 전환하는 것을 가속화하는 것을 목표로 합니다.

이 연구는 중국의학원(Chinese Academy of Medical Sciences) 암병원 기관심사위원회(Institutional Review Board of the Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences)의 승인을 받았다(승인 번호 20/069–2265, 22/221-3423 및 23/305-4047). 식도 조직 샘플은 인간 식도 오가노이드를 확립하기 위해 2021년에서 2024년 사이에 중국의학원 암병원에서 식도 편평 세포 암종(ESCC)에 대한 수술 또는 조기 검사를 받는 환자로부터 얻었습니다. 이 연구에 포함된 환자 중 샘플 채취 전에 화학 요법이나 방사선 요법을 받은 환자는 없었습니다. 모든 참가자로부터 사전 동의를 얻었고, 의료 기록에서 관련 임상 정보를 검색했습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 전체 목록은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 식도 상피 오가노이드의 준비

1. L-WRN 컨디셔닝 배지의 제조
   1. L-WRN 세포주의 준비
      1. L-WRN 세포주(-80°C에서 보관)를 37°C 수조에서 1-2분 동안 해동합니다. 5mL의 예열 기저 배양 배지(10% FBS가 보충된 DMEM)와 혼합합니다.
      2. 혼합물을 실온(RT)에서 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
      3. 상등액을 버리십시오. 2-3mL의 새로운 예열 선택 배지(10% FBS, 0.5mg/mL hygromycin B 및 0.5mg/mL G-418을 함유하는 DMEM)로 세포를 재현탁합니다.
         알림: 매체를 4°C(최대 보관 1개월)로 유지하십시오.
      4. 선택 배지를 함유한 10cm 배양 접시로 세포를 옮깁니다. 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양합니다.
   2. L-WRN 세포주 통과
      1. 0.025% 트립신-EDTA(37°C에서 1-2분)를 사용하여 융합 세포를 해리하고 1:2 비율로 분할합니다.
   3. L-WRN 컨디셔닝 매체 모음
      1. 배양 배지를 80% 세포 합류점에서 기저 배양 배지로 교체합니다. 상층액을 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
      2. 0.22μm 멤브레인을 통해 필터링하여 세포 파편을 제거합니다. 여과액을 L-WRN 조건 매체로 수집합니다.
         참고 : L-WRN 조건 매체를 4 ° C (1 주) 또는 -80 ° C (6 개월)로 유지하십시오.
2. 인간 식도 오가노이드 배양 배지(H-EOCM) 준비
   1. H-EOCM 준비
      1. 4°C에서 4시간 평형 후 L-WRN 조건 매체(1.5mL 부피)를 소용돌이.
      2. 고급 DMEM/F12 배지를 H-EOCM을 생성합니다: 3% L-WRN 컨디셔닝 배지, 1× Anti-Anti, 1× L-glutamine, 1× N2 보충제, 1× B27 보충제, 0.15mM HEPES, 40ng/mL EGF, 10μM Y-27632 및 50μM A83-01.
         참고: H-EOCM의 냉동 보관은 6개월 동안 -20°C에서 유지합니다.
3. 실험 전 준비
   1. H-EOCM을 4°C에서 4시간 동안 유지하여 해동합니다.

2. 인간 식도 오가노이드(human esophageal organoid)의 확립

1. 재료 준비
   1. 기저막 매트릭스와 H-EOCM을 4°C에서 해동합니다. 다음 실험을 위해 수술용 가위와 핀셋을 소독합니다.
   2. 피펫 팁을 4 °C로 예냉각합니다. 24웰 플레이트를 37°C로 예열합니다.
2. 조직 처리 및 세포 분리
   참고: 외과적 절제를 받은 ESCC 환자와 동일한 개인으로부터 ESCC 종양 조직, 이형성 병변(종양 가장자리에서 ≤2cm) 및 일치하는 정상 식도 조직(종양 가장자리에서 ≥5cm)을 수집했습니다. 또한, 이전 연구에서 설명한 바와 같이 ESCC 조기 발견 및 스크리닝 프로그램을 통해 다단계 식도 샘플을 얻었다 ^6,7.
   1. 5mL 원심분리 튜브에 실온 세척 버퍼(1×Anti-Anti 및 0.15mM HEPES 함유 PBS)로 샘플을 세척합니다.
      알림: 오염 위험을 줄이기 위해 샘플을 세 번 이상 씻으십시오.
   2. 멸균 가위를 사용하여 조직을 1mm³ 조각으로 다집니다. 단편을 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   3. 1mL 분해 버퍼로 샘플을 현탁시키고 37°C, 50-100rpm에서 10-20분 동안 흔들어 조직을 분해합니다.
   4. 혼합물을 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.
   5. 침전물을 500μL의 0.025% 트립신-EDTA에 재현탁시킵니다. 37 °C에서 10 분 동안 배양합니다. 10% FBS가 보충된 DMEM 1mL를 첨가하여 효소 활성을 중단합니다.
   6. 현탁액을 70μm 멸균 필터에 통과시킵니다. 1.5mL 원심분리 튜브에 여과액을 수집합니다.
   7. 4 °C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리기 여과액. 상등액을 버리십시오. 100μL의 H-EOCM으로 세포를 재현탁합니다.
3. 오가노이드 시딩
   1. 세포 밀도를 측정한 다음 5,000-15,000개의 현탁액 세포가 있는 새로운 1.5mL 원심분리 튜브를 준비합니다.
   2. 4°C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오. 50-100 μL의 기저막 매트릭스에 세포를 균일하게 부드럽게 재현탁합니다.
      알림: 응고를 방지하기 위해 기저막 매트릭스를 4°C에서 보관하십시오.
   3. 혼합된 세포가 있는 50μL의 기저막 매트릭스를 각 24웰 플레이트의 중앙에 추가합니다. 37°C 배양(30분 소요)을 통해 기저막 매트릭스를 중합합니다.
   4. 예열된 H-EOCM(37°C) 500μL를 추가하여 기저막 매트릭스를 덮습니다. 오가노이드를 37°C에서 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양합니다.
4. 중간 교체
   1. 사용한 배지를 흡인하고 500μL의 신선한 H-EOCM(37°C로 예열)을 보충합니다.
      참고: H-EOCM은 3일 간격으로 교체하십시오.

3. 오가노이드의 패시징

1. 재료 준비
   1. 기저막 매트릭스와 H-EOCM을 4°C에서 해동합니다. 피펫 팁을 4°C로 예냉각합니다. 24웰 플레이트를 37°C로 예열합니다.
2. 오가노이드의 분해
   1. H-EOCM 매체를 부드럽게 제거합니다. 웰에 500μL의 사전 냉각된 통로 완충액(1× Anti-Anti 및 0.15mM HEPES를 포함하는 Advanced DMEM/F12, 4°C로 사전 냉각)을 추가하여 기저 멤브레인 매트릭스를 용융합니다.
   2. 기저 멤브레인 매트릭스와 계대 완충액을 1.5mL 원심분리 튜브에 결합합니다. 500μL의 사전 냉각된 계대 완충액으로 웰을 세척하고 완충액을 수집하여 남아 있는 오가노이드를 회수합니다.
   3. 4°C에서 400 x g 에서 5분 동안 버퍼를 원심분리합니다. 상등액을 부드럽게 흡입합니다. 500μL의 재조합 트립신을 튜브에 추가하고 효소 분해를 위해 배양합니다(37°C, 15분). 5분 간격으로 다시 중단합니다.
   4. 분해된 시료를 원심분리합니다(400 x g, 5분, 4°C). 상등액을 버리십시오. 3.2.6 및 3.2.7단계를 반복합니다. 100μL의 H-EOCM에 세포를 재현탁합니다.
3. 오가노이드 시딩
   1. 오가노이드 시딩의 경우 2.3단계를 반복합니다.

4. 오가노이드 동결 및 회수

1. 오가노이드 동결
   1. 재료 준비의 경우 2.1단계를 반복합니다.
   2. 오가노이드 분해를 위해 3.2단계를 반복합니다.
   3. 오가노이드 동결
      1. 세포 밀도를 측정한 다음 현탁액 세포 10,000개가 있는 새로운 1.5mL 원심분리 튜브를 준비합니다.
      2. RT에서 5분 동안 400 x g 에서 샘플을 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 흡입합니다.
      3. 500-1000 μL의 동결 보존 배지로 세포를 재현탁합니다. 새 크라이오튜브로 옮깁니다. 크라이오튜브를 -80°C에서 24시간 동안 동결합니다. 장시간 보존을 위해 액체 질소 저장 시스템에 보관하십시오.
2. 동결 오가노이드의 해동
   1. 재료 준비를 위해 2.1단계를 반복합니다.
   2. 동결 오가노이드의 해동
      1. 크라이오튜브를 37°C 수조에서 2-3분 동안 빠르게 해동합니다. 동결된 물질을 예열된 기저 배양 9mL(37°C)로 옮기고 세포를 균일하게 재현탁합니다.
      2. 400 x g (상온에서)에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오.
   3. 오가노이드 시딩
      1. 오가노이드를 파종하려면 2.3단계를 반복합니다.

5. 오가노이드의 조직학적 분석

1. 파라핀 함유 절편의 준비
   1. 재료 준비
      1. 오토클레이브를 통해 250mL 플라스크에 50mL의 포매 매트릭스(수용액: 2% 한천 + 2.5% 젤라틴)를 멸균합니다. 5mL를 15mL 원심분리 튜브에 부분 표본으로 주입합니다. 실온에서 보관하십시오.
   2. 오가노이드 고정
      1. 3.2.1-3.2.2 단계를 반복합니다. 새로운 1.5mL 튜브에 1mL의 계대 완충액으로 침전물을 재현탁합니다.
      2. 400 x g 에서 4°C, 5분 동안 원심분리기. 상층액을 제거합니다. 오가노이드를 500μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)에 재현탁합니다. 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 최소 6시간 동안 배양합니다.
   3. 오가노이드 임베딩
      1. 혼합물을 원심분리(400 x g, 5분, RT)합니다. 상층액을 제거합니다. 튜브에 1mL의 계대 완충액을 추가하고 침전을 재현탁합니다.
      2. 혼합물을 원심분리(400 x g, 5분, RT)합니다. 상층액을 제거합니다.
      3. 매립 매체(5mL)가 있는 튜브 1개(15mL)를 수조(100mL, 150mL 용기)에 넣습니다. 물이 끓기 시작할 때까지 최대 전력으로 전자레인지에 돌립니다.
         알림: 전자레인지에 돌리기 전에 15mL 튜브의 캡을 푸십시오.
      4. 1.5mL 원심분리 튜브에 50μL의 임베딩 겔로 오가노이드를 재현탁합니다. 젤이 완전히 굳을 때까지 튜브를 4°C로 냉각합니다.
      5. 응고된 겔을 70% 에탄올로 옮깁니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   4. 파라핀 블록 준비
      1. 에탄올 시리즈 (30 % → 50 % → 70 % → 80 % → 95 % → 100 %), 농도 당 30 분을 통해 젤을 탈수하십시오.
      2. 응고된 젤을 투명한 자일렌에 30분 동안 넣습니다. 응고된 젤을 파라핀에 담그고 가열된 파라핀 스테이션을 사용하여 삽입합니다.
      3. 마이크로톰으로 4μm 두께의 슬라이스를 자릅니다. 슬라이드에 장착하고 65°C에서 1시간 동안 건조합니다. 건조한 상태로 보관하십시오.
2. 오가노이드 절편의 면역조직화학(IHC) 염색
   1. 디왁스와 수분 공급
      1. 조직 투명화제의 슬라이스를 65°C에서 40분 동안 가열합니다. 슬라이드를 실온에서 20분 동안 새 조직 투명화제에 담그십시오.
      2. 에타놀 시리즈를 포함하는 유리제 쟁반을 통해서 활주를 가공하십시오: 10분 동안 100%년 에타놀에서 가라앉히고 한 번 반복하고, 그 후에 5 분 동안 85% 에타놀, 5 분 동안 85% 에타놀, 그 후에 5 분 동안 75% 에타놀, 그리고 10 분 동안 4% PFA에서 마지막으로 두십시오 옮기십시오.
      3. 내열성 챔버에 멸균된 물을 넣고 셰이커에서 80rpm으로 5분 동안 유지합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
   2. 항원 회수
      1. 내열성 챔버에 Tris-EDTA 항원(pH 9.0) 회수 용액을 추가하여 슬라이드를 침지시 넣습니다. 슬라이드가 들어있는 내열성 챔버를 끓을 때까지 최대 강도 (700W, 3 분)로 전자 레인지에 넣습니다. 전자레인지에 저출력 설정(70W, 15분)으로 유지하고 실온으로 식히십시오.
      2. 셰이커에서 80rpm으로 2분 동안 증류수로 세척합니다. 두 번 반복합니다. 조직학적 펜으로 오가노이드의 위치를 동그라미로 그립니다.
   3. 과산화효소 차단(Peroxidase blocking)
      1. 과산화효소 차단 용액을 떨어뜨려 시료 영역을 덮습니다. 실온의 습도 챔버에서 20분 동안 배양합니다.
      2. 슬라이드를 내열성 챔버로 옮깁니다. PBST(PBS + 0.1% Tween 20)에서 80rpm에서 2분 동안 세척합니다. 두 번 반복합니다.
   4. 1차 항체 배양
      1. 슬라이드에 남아 있는 PBST 방울을 부드럽게 닦아냅니다.
         참고: 슬라이드의 오가노이드를 만지지 마십시오.
      2. 오가노이드 영역을 덮기 위해 희석된 1차 항체를 떨어뜨립니다. 습도 챔버에서 실온에서 2시간 또는 4°C에서 8-14시간 동안 배양합니다. 이 단계를 반복합니다.
   5. 2차 항체 배양
      1. 5.2.4.1단계를 반복합니다. 오가노이드 영역을 덮기 위해 희석된 HRP 2차 항체를 떨어뜨립니다. 실온의 습도 챔버에서 20분 동안 배양합니다. 이 단계를 반복합니다.
   6. DAB(3,3'-디아미노벤지딘) 염색
      1. 5.2.4.1단계를 반복합니다. 오가노이드 영역을 덮기 위해 1× DAB를 떨어뜨립니다. 색이 갈색으로 변할 때까지 실온의 습도 챔버에서 배양합니다.
      2. 슬라이드를 증류수에 5-10초 동안 담가 색상 변화를 종료합니다. 단계를 반복합니다.
   7. 헤마톡실린 염색
      1. 헤마톡실린에 5-8분 동안 염색합니다. 1% 산성 알코올(70% 알코올 중 1% HCl)을 5-10초 동안 구별합니다.
      2. 슬라이드를 증류수에 5-10초 동안 담그십시오. 이 단계를 반복합니다.
   8. 탈수
      1. 유리 트레이를 통해 슬라이드를 순차적으로 처리합니다 : 5 분 동안 75 % 에탄올에 담그고, 5 분 동안 85 % 에탄올로 옮기고, 5 분 동안 95 % 에탄올로 이동 한 다음 10 분 동안 100 % 에탄올에 두 번 개별 침지하고, 마지막으로 두 번 연속 20 분 동안 크실렌에 넣습니다.
   9. 슬라이드 장착
      1. 자일렌을 중성 껌에 넣어 투명해질 때까지 첨가합니다. 약간 자연 건조하십시오. 그런 다음 자일렌이 함유된 껌을 떨어뜨려 오가노이드 부위를 덮습니다.
      2. 커버슬립을 적용합니다. 슬라이드를 스캔하고 분석합니다.
3. 멀티플렉스 면역형광(mIF) 염색
   1. 디왁스 및 수분 공급을 위해 5.2.1단계를 반복하십시오.
   2. 과산화효소 차단의 경우 5.2.3단계를 반복합니다.
   3. 항원 회수의 경우 5.2.3단계를 반복합니다.
   4. 쉽 세럼 블로킹.
      1. 5.2.4.1단계를 반복합니다. 양 혈청 차단 용액을 추가하여 오가노이드 영역을 덮습니다. 실온의 습도 챔버에서 30분 동안 배양합니다.
      2. PBST에서 2분 동안 세척합니다. 두 번 반복합니다.
   5. 1차 항체 배양의 경우 5.2.4단계를 반복합니다.
   6. 2차 항체 배양의 경우 5.2.4.1단계를 반복합니다.
      1. 오가노이드 영역을 덮기 위해 특정 2차 항체 용액을 떨어뜨립니다. 실온의 습도 챔버에서 20분 동안 배양합니다. 5.2.3.2단계를 반복합니다.
         알림: 이 단계부터 실험이 끝날 때까지 슬라이드를 빛으로부터 보호하십시오.
   7. 형광 염료 염색
      1. 5.3.4.1단계를 반복합니다. 오가노이드 영역을 덮기 위해 형광 염료 용액을 떨어뜨립니다.
      2. 실온의 습도 챔버에서 10-20분 동안 배양합니다. 5.2.3.2단계를 반복합니다.
   8. 다중 염색의 경우 5.3.3-5.3.7 단계를 반복합니다.
   9. DAPI 염색
      1. 5.2.4.1단계를 반복합니다. 오가노이드 영역을 커버하기 위해 DAPI 용액을 떨어뜨립니다. 5.2.3.2단계를 반복합니다. 그런 다음 5.3.4.2단계를 반복합니다.
      2. 슬라이드를 멸균된 물에 2분 동안 담그십시오.
   10. 슬라이드 장착
       1. 오가노이드 영역을 덮기 위해 페이드 방지 장착 매체를 떨어뜨립니다. 커버슬립을 적용합니다.
   11. 슬라이드 스캐너를 사용하여 디지털 이미지를 획득하고 분석합니다.

이 프로토콜은 ESCC 종양 형성의 여러 단계에서 오가노이드 샘플링 및 조직학적 분석을 설명합니다(그림 1). ESCC 환자의 정상 식도 점막, 저등급 상피내 종양(LGIN), 고급 상피내 종양(HGIN) 및 종양 조직을 샘플링하여 종양 형성의 여러 단계를 나타내는 오가노이드를 구성할 수 있습니다. 또한, 이러한 오가노이드의 파라핀 포매 및 절단을 수행한 후 면역형광 염색을 수행했습니다.

종양 형성 중 면역 억제 분자의 발현과 세포 클론의 형태학적 특성을 조사하기 위해 다양한 종양 발달 단계에서 식도 상피 조직을 수집하고 면역형광 염색을 수행했습니다. 염색을 완료한 후 슬라이드를 스캔하기 전에 마커에 대해 4개의 의사 색상을 정의했습니다. PD-L1, Ki-67 및 KRT6A에는 각각 녹색, 적색, 회색의 의사 색상이 할당되었으며 세포핵에는 DAPI가 표시되었습니다. 실험 결과에 따르면 식도 점막의 오가노이드 형태는 종양 형성 중에 변화하여 주로 더 무질서해지는 것으로 나타났습니다. 면역형광 염색 결과 종양형성이 진행됨에 따라 상피세포 증식이 변화하고 PD-L1과 같은 면역 억제 분자의 발현이 증가함을 밝혔습니다(그림 2).

그림 1: 다단계 식도 편평 세포 암종(ESCC) 오가노이드의 확립 및 조직학적 분석 워크플로우.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 다단계 ESCC 오가노이드의 다중 면역형광(mIF) 염색. PD-L1(녹색), Ki-67(빨간색) 및 KRT6A(회색)의 발현을 보여주는 대표적인 이미지. 스케일 바 = 100 μm. NOR, 정상 점막; LGIN, 저등급 상피내 종양; LGIN, 고급 상피내 종양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

오가노이드의 확립 및 조직학적 분석은 종양 진행 모델링에 있어 상당한 진전을 나타냅니다. 이 프로토콜은 종양 형성을 연구하는 기존 방법에 비해 주목할 만한 이점을 제공합니다²⁰. 기존의 2D 세포 배양 시스템과 달리 오가노이드는 생체 내 조건을 더 잘 반영하는 복잡한 3차원 구조와 세포 이질성을 유지합니다. 동물 모델과 비교했을 때, 인간 조직에서 유래한 오가노이드는 인간의 질병 특성을 더 정확하게 표현한다 ^9,21,22. 다중 면역형광 염색을 통합하면 여러 마커를 동시에 시각화할 수 있어 종양 진화 중 주요 분자와 조직 구조 간의 공간적 관계에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 고급 프로토콜을 활용하여 이 연구는 식도 편평 세포 암종의 유의미한 동적 변화를 밝혔으며, 특히 종양 세포 증식 수준이 종양 발달 중에 점진적으로 변화하고 면역 억제 분자 PD-L1의 발현에 상응하는 변화가 있음을 입증했습니다.

이 프로토콜은 종양 형성 중 형태학적 및 분자 변화를 조사하기 위한 포괄적인 방법론을 제공하며, 특히 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계를 제공합니다. 과도한 소화는 과도한 세포 사멸로 이어질 수 있고 불충분한 소화는 세포 격리 불량을 초래할 수 있으므로 조직 처리 중 소화 시간을 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 또한, 기저막 매트릭스 취급 중 온도 제어가 매우 중요합니다 - 매트릭스는 조기 중합을 방지하고 세포 생존력을 유지하기 위해 4°C로 유지되어야 합니다.

그러나 이 기술의 특정 제한 사항을 인정해야 합니다. 기본 오가노이드 배양 시스템에서 면역 성분 및 기질 세포가 없기 때문에 종양-미세환경 상호작용을 완전히 재현하지 못할 수 있습니다^23,24. 이러한 제한은 공동 배양 시스템을 통해 부분적으로 해결할 수 있지만 이러한 수정에는 신중한 최적화가 필요합니다. 마지막으로, 오가노이드의 해동도 중요한 문제입니다. 이전 경험에 따르면 냉동 오가노이드의 해동 성공률은 높지 않습니다. 따라서 사용자는 주의해서 오가노이드를 동결하는 것이 좋습니다.

이 프로토콜의 임상적 함의는 특히 NOR에서 LGIN 및 HGIN을 거쳐 침습성 암종으로의 다단계 진행을 모델링할 수 있다는 점에서 중요합니다⁶. 이 방법론을 사용하여 생성된 환자 유래 오가노이드는 연구 및 맞춤형 의학을 위한 귀중한 도구 역할을 하며, 질병 진행과 관련된 분자 마커를 식별할 수 있습니다^25,26.

이 프로토콜은 암 연구 및 약물 개발의 다양한 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 이 방법론은 다른 상피암을 연구하도록 확장될 수 있으며, 단세포 염기서열분석(single-cell sequencing)과 같은 추가 분석 기법을 통합하도록 수정될 수 있다^27,28. 또한, 향후 적응은 환자 유래 암 관련 섬유아세포와 면역 세포를 통합하여 종양-기질-면역 상호작용을 모델링하거나 CRISPR 편집을 통합하여 유전적 동인을 조사함으로써 중개 연구 및 치료 반응 예측에서 유용성을 확대할 수 있습니다^29,30.

이 프로토콜은 ESCC의 종양 형성의 다양한 단계에서 오가노이드를 구성하고 동결하는 방법을 소개합니다. 더 중요한 것은 오가노이드에 대한 임베딩, 절편, IHC 및 mIF 염색 기술이 이 기사에 설명되어 있다는 것입니다. 우리는 오가노이드의 이러한 임포딩, 슬라이스 및 염색 방법이 식도를 포함한 여러 장기 공급원의 오가노이드 염색 방법에 적용될 수 있다고 믿습니다. 이 접근 방식은 또한 연구자가 관련 분자 발현과 공간 구조 간의 관계를 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다.

저자는 경쟁하는 재정적 또는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

저자는 암 병원, 중국 의학 아카데미 (CAMS) 및 베이징 연합 의과 대학 (PUMC)에서 연구에 참여한 모든 환자와 의사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 중국 국가자연과학재단(82203156에서 S.Z.), 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2023YFC3503200에서 S.Z.), 중국의학원 의학혁신기금(2023-I2M-QJ-002에서 S.Z.)의 지원을 받습니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 만든 것입니다.