הקמה וניתוח היסטולוגי של אורגנואידים בוושט: מידול ההתקדמות מרקמות נורמליות לסרטניות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמה וניתוח היסטולוגי של מודלים אורגנואידים בוושט המייצגים שלבים שונים של התקדמות הגידול. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור שינויים במורפולוגיה התאית, בארגון המרחבי ובדפוסי ביטוי הסמנים המולקולריים במהלך המעבר מרקמות נורמליות לרקמות סרטניות.

אורגנואידים התגלו ככלי מרכזי לקידום ההבנה של גידול וטיפול בסרטן. על ידי יצירת מודלים אורגנואידים אנושיים המייצגים שלבי גידול שונים וביצוע ניתוחים היסטולוגיים, ניתן לקבל הבנה מעמיקה יותר של השינויים במורפולוגיה התאית, בארכיטקטורה המרחבית ובביטוי של סמנים מולקולריים מרכזיים ככל שהגידול מתקדם. מחקר זה מציג פרוטוקול מקיף להקמה ותרבית של אורגנואידים של תאי קשקש בוושט. בנוסף, הפרוטוקול מתאר שיטות להערכת דפוסי הביטוי והארגון המרחבי של מולקולות קריטיות בתוך האורגנואידים, תוך שימוש בטכניקות כגון קיבוע, הטבעה וצביעה. באמצעות פרוטוקול זה, זוהו שינויים משמעותיים במבנה המרחבי של תאי אפיתל קשקשיים בוושט ובביטוי של סמנים ביולוגיים שונים של גידול במהלך גידול. הפרוטוקול מקל על בנייה וניתוח היסטולוגי של אורגנואידים, ומאפשר לחוקרים לחקור את הארכיטקטורה המרחבית והשינויים המולקולריים של תאי אפיתל בשלבים שונים של גידול והתערבות טיפולית.

גידול הוא תהליך מורכב ורב-שלבי המאופיין בשינויים מולקולריים ומורפולוגיים מתקדמים בתאים ^1,2. קרצינומה של תאי קשקש בוושט (ESCC), ממאירות שכיחה עם פרוגנוזה גרועה ^3,4, מדגימה התקדמות הדרגתית זו דרך ארבעה שלבים נפרדים: רירית תקינה, ניאופלזיה תוך-אפיתליאלית בדרגה נמוכה (LGIN), ניאופלזיה תוך-אפיתליאלית בדרגה גבוהה (HGIN) וקרצינומה פולשנית⁵. לאורך שלבים אלה, תאי אפיתל מציגים שינויים דינמיים בדפוסי הביטוי המולקולרי ובארגון המרחבי, המלווים בשינויים שיטתיים במורפולוגיה של הרקמות ככל שהיא מתקדמת ממצב נורמלי לממאיר ^6,7. למרות ההתקדמות בהבנת הפתוגנזה של ESCC, היעדר מודלים ניסיוניים המסכמים נאמנה היבטים מרחביים וזמניים של התפתחות הגידול - תוך מתן אפשרות לניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים שיטתיים - עיכב הבנה מכניסטית עמוקה יותר של התקדמות המחלה והתפתחות טיפולית.

בעוד שקווי תאי סרטן אימורטליים דו-ממדיים תרמו תרומה משמעותית להבנת האונקוגנזה, הם מוגבלים מטבעם בשכפול המורכבות הביולוגית והמאפיינים הפתולוגיים של גידולים מקומיים⁸. מודלים של בעלי חיים, למרות שהם מספקים הקשר in vivo, לרוב מנבאים בצורה גרועה תגובות אנושיות עקב הבדלים ספציפיים למין^. לעומת זאת, אורגנואידים התגלו כפלטפורמה פרה-קלינית טרנספורמטיבית המשמרת נאמנה את ההטרוגניות התאית, הארכיטקטורה והפונקציונליות של רקמות אנושיות 10,11,12,13. כמודלים פרה-קליניים, אורגנואידים לוכדים טוב יותר את המאפיינים של גידולים ראשוניים, ומאפשרים חקירה מפורטת של אירועים מולקולריים מרכזיים ושינויים תאיים במהלך התקדמות הגידול¹⁴. לדוגמה, צ'ן ועמיתיו השתמשו באורגנואידים של הוושט שמקורם בחולה משלבים שונים של ESCC כדי להבהיר אינטראקציות אפיתל-פיברובלסטים, ובסופו של דבר אימתו את ציר האיתות ANXA1-FPR2 כמניע קריטי לפתוגנזה של ESCC⁶. באופן דומה, Ko et al. השתמשו באורגנואידים מהונדסים גנטית של הוושט כדי לזהות גורמים גנטיים מרכזיים המניעים התחלת ESCC והתחמקות חיסונית, והדגימו כיצד מודלים אורגנואידים יכולים לסכם ביעילות את מאפייני המחלה ולחשוף מטרות טיפוליות חדשות¹⁵.

המתודולוגיה הנוכחית פותרת בעיות משמעותיות במודלים של סרטן הוושט על ידי קביעת פרוטוקול הניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים ESCC רב-שלביים המשקפים התקדמות היסטולוגית מאפיתל רגיל לקרצינומה פולשנית. מערכת זו משלבת תנאי תרבית אופטימליים באמצעות מדיום מותנה L-WRN לשמירה על גבעול האפיתל, בשילוב עם פרוטוקולים סטנדרטיים לעיבוד היסטולוגי וניתוח אימונופלואורסצנטי מרובה (mIF), ומספקת פלטפורמה אידיאלית לניתוח אורך של שינויים מרחביים ומולקולריים במהלך גידול. בהשוואה לטכניקות אלטרנטיביות כגון תרביות דו-ממדיות, פלטפורמה אורגנואידית זו משמרת באופן ייחודי את ארכיטקטורת הרקמות, ומאפשרת הדמיה של סמנים מולקולריים מאורגנים מרחבית, כולל חלבון המחסום החיסוני PD-L1 (CD274), המתווך התחמקות חיסונית של הגידול על ידי עיכוב תגובות תאי T 16,17,18וסמן התפשטות Ki-67., הפרוטוקול מאפשר מעבר אורגנואידים מרקמות תקינות של הוושט והטרום סרטן, ומסייע לחוקרים לבנות מודל אורגנואיד רציף מרקמה רגילה לגידול¹⁹. על ידי מתן אפשרות לניתוח מפורט של שינויים מרחביים ומולקולריים במהלך גידול, פרוטוקול זה מציע לחוקרים כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות והתקדמות הסרטן, מה שעשוי להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות.

מתודולוגיה זו מתאימה במיוחד לחוקרים החוקרים סרטן אפיתל, אינטראקציות מיקרו-סביבתיות של גידול או תגובות טיפוליות ב-ESCC ובממאירויות קשקשיות קשורות. העיצוב המודולרי שלו מאפשר הסתגלות לחקר סמנים מולקולריים או מסלולי איתות אחרים, בתנאי שמשולבים שלבי אימות מתאימים. על ידי הצעת פלטפורמה סטנדרטית אך גמישה, פרוטוקול זה נועד לקדם מחקר פרה-קליני בביולוגיה של גידולים ולהאיץ את התרגום של תובנות מכניסטיות לטיפולים ממוקדים.

מחקר זה אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית החולים לסרטן, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (אישור מס' 20/069-2265, 22/221-3423 ו-23/305-4047). דגימות רקמת הוושט התקבלו מחולים שעברו ניתוח או בדיקה מוקדמת לקרצינומה של תאי קשקש בוושט (ESCC) בבית החולים לסרטן, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה בין השנים 2021 ל-2024, לצורך הקמת אורגנואידים בוושט אנושי. אף אחד מהחולים שנכללו במחקר זה לא קיבל כימותרפיה או הקרנות לפני איסוף הדגימה. הסכמה מדעת הושגה מכל המשתתפים, ומידע קליני רלוונטי נשלף מהרשומות הרפואיות. רשימה מלאה של ריאגנטים וציוד המשמשים במחקר זה מסופקת בטבלת החומרים.

1. הכנת אורגנואידים אפיתל בוושט

1. הכנת מדיום מותנה L-WRN
   1. הכנת קו תאים L-WRN
      1. הפשירו קו תאים L-WRN (אחסון ב-80 מעלות צלזיוס) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 דקות. יש לערבב עם 5 מ"ל תרבית בסיס מחוממת מראש (DMEM בתוספת 10% FBS).
      2. צנטריפוגה את התערובת בחום של 200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      3. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים עם 2-3 מ"ל של מדיום ברירה טרי שחומם מראש (DMEM המכיל 10% FBS, 0.5 מ"ג/מ"ל היגרומיצין B ו-0.5 מ"ג/מ"ל G-418).
         הערה: שמור את המדיום על 4 מעלות צלזיוס (אחסון מקסימלי חודש).
      4. מעבירים תאים לתבנית תרבית בגודל 10 ס"מ המכילה את מדיום הבחירה. תרבית את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% CO₂ .
   2. מעבר של שורת תאים L-WRN
      1. לפרק תאים קונפלואנטים באמצעות 0.025% טריפסין-EDTA (1-2 דקות ב-37 מעלות צלזיוס) ולפצל ביחס של 1:2.
   3. אוסף המדיום המותנה ב-L-WRN
      1. החלף את מדיום התרבות במדיום תרבית בסיסי במפגש תאים של 80%. העבירו את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה.
      2. סנן דרך ממברנה של 0.22 מיקרומטר כדי לחסל פסולת תאית. אסוף את המסנן כמדיום מותנה L-WRN.
         הערה: שמור על מדיום ממוזג L-WRN ב-4 מעלות צלזיוס (שבוע) או ב-80 מעלות צלזיוס (6 חודשים).
2. הכנת מדיום תרבית אורגנואידים בוושט אנושי (H-EOCM)
   1. הכנת H-EOCM
      1. מערבולת המדיום המותנה L-WRN (נפח 1.5 מ"ל) לאחר 4 שעות של שיווי משקל ב-4 מעלות צלזיוס.
      2. שלבו מדיום DMEM/F12 מתקדם עם תוספים אלה ליצירת H-EOCM: 3% מדיום ממוזג L-WRN, 1× אנטי, 1× L-גלוטמין, 1× תוסף N2, 1× תוסף B27, 0.15 מ"מ HEPES, 40 ננוגרם/מ"ל EGF, 10 מיקרומטר Y-27632 ו-50 מיקרומטר A83-01.
         הערה: שמור על אחסון קפוא של H-EOCM בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימור של שישה חודשים.
3. הכנה טרום ניסויית
   1. הפשירו את H-EOCM על ידי שמירה על טמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.

2. הקמת אורגנואיד הוושט האנושי

1. הכנת חומרים
   1. הפשירו את מטריצת קרום המרתף ו-H-EOCM ב-4 מעלות צלזיוס. עקר מספריים ופינצטה כירורגית לניסוי הבא.
   2. מצננים מראש את קצות הפיפטה ל -4 מעלות צלזיוס. מחממים מראש את צלחת 24 הבארות ל -37 מעלות צלזיוס.
2. עיבוד רקמות ובידוד תאים
   הערה: רקמת גידול ESCC, נגעים דיספלסטיים (≤2 ס"מ משולי הגידול) ורקמת וושט תקינה תואמת (≥5 ס"מ משולי הגידול) נאספו מאותם אנשים עם ESCC שעברו כריתה כירורגית. בנוסף, דגימות וושט רב-שלביות הושגו באמצעות תוכנית גילוי מוקדם וסינון של ESCC, כפי שתואר במחקרים הקודמים שלנו ^6,7.
   1. נקה את הדגימה עם מאגר כביסה בטמפרטורת החדר (PBS המכיל 1×אנטי אנטי ו-0.15 מ"מ HEPES) בצינורות צנטריפוגה של 5 מ"ל שלוש פעמים.
      הערה: שטפו את הדגימות יותר משלוש פעמים כדי להפחית את הסיכון לזיהום.
   2. טוחנים את הרקמה לשברים בגודל 1 מ"מ³ בעזרת מספריים סטריליים. מעבירים שברים לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
   3. השעו את הדגימה עם מאגר עיכול של 1 מ"ל ונערו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 50-100 סל"ד, למשך 10-20 דקות לעיכול הרקמה.
   4. צנטריפוגה את התערובת בחום של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו סופרנטנט.
   5. השעו מחדש את המשקעים ב-500 מיקרוליטר של 0.025% טריפסין-EDTA. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הוסף 1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS כדי לעצור את הפעילות האנזימטית.
   6. העבירו את המתלה דרך פילטר סטרילי של 70 מיקרומטר. אוספים את המסנן בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
   7. צנטריפוגה מסוננת למשך 5 דקות ב-400 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו סופרנטנט. השעו מחדש את התאים עם 100 מיקרוליטר של H-EOCM.
3. זריעה אורגנואידית
   1. קבע את צפיפות התאים, ולאחר מכן הכין צינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל עם 5,000-15,000 תאים בתרחיף.
   2. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט בזהירות. השעו בעדינות תאים ב-50-100 מיקרוליטר של מטריצת קרום המרתף באופן שווה.
      הערה: אחסן את מטריצת קרום המרתף ב-4 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות.
   3. הוסף 50 מיקרוליטר של מטריצת קרום המרתף עם התאים המעורבים למרכז כל צלחת של 24 בארות. פילמור מטריצת קרום הבסיס באמצעות דגירה של 37 מעלות צלזיוס (משך 30 דקות).
   4. הוסף 500 מיקרוליטר של H-EOCM מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) כדי לכסות את מטריצת קרום המרתף. תרבית את האורגנואידים בחממה לחה של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
4. תחליף בינוני
   1. שאפו את המדיום המושקע וחידשו ב -500 מיקרוליטר H-EOCM טרי (מחומם ל -37 מעלות צלזיוס).
      הערה: החלף את H-EOCM במרווחים של 3 ימים.

3. מעבר אורגנואידים

1. הכנת חומרים
   1. הפשירו את מטריצת קרום המרתף ו-H-EOCM ב-4 מעלות צלזיוס. יש לקרר מראש את קצות הפיפטה ל-4 מעלות צלזיוס. מחממים מראש את צלחת 24 הבארות ל -37 מעלות צלזיוס.
2. עיכול אורגנואיד
   1. הסר את מדיום ה-H-EOCM בעדינות. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר מעבר מקורר מראש (DMEM/F12 מתקדם המכיל 1× אנטי-אנטי ו-0.15 מ"מ HEPES, מקורר מראש ל-4 מעלות צלזיוס) בבאר כדי להמיס את מטריצת קרום המרתף.
   2. שלב את מטריצת קרום המרתף עם מאגר מעבר בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. שטפו את הבאר עם 500 מיקרוליטר של מאגר מעבר מקורר מראש ואספו את המאגר כדי לאחזר את כל האורגנואידים שנותרו.
   3. צנטריפוגה את המאגר למשך 5 דקות ב-400 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט בעדינות. הוסף 500 מיקרוליטר של טריפסין רקומביננטי לתוך הצינור ודגירה לעיכול אנזימטי (37 מעלות צלזיוס, 15 דקות). השהה מחדש במרווחים של 5 דקות.
   4. צנטריפוגה את הדגימה המעוכלת (400 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס). השליכו את הסופרנטנט. חזור על שלבים 3.2.6 ו- 3.2.7. השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של H-EOCM.
3. זריעה אורגנואידית
   1. לזריעה אורגנואידית, חזור על שלב 2.3.

4. הקפאה והתאוששות אורגנואידית

1. הקפאת אורגנואידים
   1. להכנת חומרים, חזור על שלב 2.1.
   2. לעיכול האורגנואידים, חזור על שלב 3.2.
   3. הקפאת אורגנואידים
      1. קבע את צפיפות התאים, ולאחר מכן הכין צינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל עם 10,000 תאים בתרחיף.
      2. צנטריפוגה את הדגימות ב-400 x g למשך 5 דקות ב-RT. שאבו את הסופרנטנט בזהירות.
      3. השעו מחדש את התאים עם 500-1000 מיקרוליטר של מדיום שימור בהקפאה. העבר לצינור קריוטיוב חדש. הקפיאו את צינור הקירור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ארכיון במערכת אחסון חנקן נוזלי לשימור מורחב.
2. הפשרת אורגנואיד קפוא
   1. להכנת החומרים, חזור על שלב 2.1.
   2. הפשרת אורגנואיד קפוא
      1. הפשירו במהירות את צינור הקירור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות. העבירו את החומר הקפוא ל-9 מ"ל של תרבית בזאלית מחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) והשעו מחדש את התאים באופן שווה.
      2. צנטריפוגה את מתלה התא למשך 5 דקות ב-400 x g (ב-RT). שאפו את הסופרנטנט בזהירות.
   3. זריעה אורגנואידית
      1. לזריעת האורגנואידים, חזור על שלב 2.3.

5. ניתוח היסטולוגי של אורגנואיד

1. הכנת קטעים משובצים בפרפין
   1. הכנת חומרים
      1. יש לעקר 50 מ"ל של מטריצת הטבעה (תמיסה מימית: 2% אגר + 2.5% ג'לטין) בבקבוק של 250 מ"ל באמצעות חיטוי. Aliquot 5 מ"ל לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
   2. קיבוע אורגנואידים
      1. חזור על שלבים 3.2.1-3.2.2. השעו מחדש את המשקעים עם 1 מ"ל של מאגר מעבר בצינור טרי של 1.5 מ"ל.
      2. צנטריפוגה ב-400 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הסר את ה-supernatant. השעו מחדש את האורגנואידים ב-500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות לפחות.
   3. הטמעת אורגנואיד
      1. צנטריפוגה את התערובת (400 x גרם, 5 דקות, RT). הסר את ה-supernatant. הוסף 1 מ"ל ממאגר המעבר בצינור והשהה מחדש את המשקעים.
      2. צנטריפוגה את התערובת (400 x גרם, 5 דקות, RT). הסר את ה-supernatant.
      3. הנח צינור אחד (15 מ"ל) עם מדיום הטבעה (5 מ"ל) לאמבט המים (100 מ"ל, מיכל 150 מ"ל). מיקרוגל בעוצמה מקסימלית עד שהמים מתחילים לרתוח.
         הערה: הברג את המכסה של צינור ה-15 מ"ל לפני המיקרוגל.
      4. השעו מחדש את האורגנואידים עם 50 מיקרוליטר של ג'ל הטמעה בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. מצננים את הצינור ל-4 מעלות צלזיוס עד שהג'ל מתקשה לחלוטין.
      5. העבירו את הג'ל המוצק ל-70% אתנול. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   4. הכנת גוש פרפין
      1. לייבש את הג'ל באמצעות סדרת אתנול (30% → 50% → 70% → 80% → 95% → 100%), 30 דקות לריכוז.
      2. שים את הג'ל המוצק בקסילן שקוף למשך 30 דקות. טבלו את הג'ל המוצק בפרפין והטמיעו אותו באמצעות תחנת פרפין מחוממת.
      3. חותכים פרוסות בעובי 4 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום. הרכיבו על מגלשות וייבשו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה. יש לאחסן בתנאים יבשים.
2. צביעת אימונוהיסטוכימיה (IHC) של פרוסות אורגנואידים
   1. הסרת שעווה ולחות
      1. מחממים פרוסות בחומר ניקוי רקמות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. טבלו את השקופית בחומר טרי לניקוי רקמות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
      2. עבדו את השקופיות דרך מגשי זכוכית המכילים סדרת אתנול: טבלו ב-100% אתנול למשך 10 דקות וחזרו על הפעולה פעם אחת, ואז העבירו ל-95% אתנול למשך 5 דקות, ולאחר מכן 85% אתנול למשך 5 דקות, ואז 75% אתנול למשך 5 דקות, ולבסוף הניחו ב-4% PFA למשך 10 דקות.
      3. הוסף מים מעוקרים לתא היציב בחום ושמור 5 דקות על השייקר ב-80 סל"ד. חזור על שלב זה פעמיים.
   2. אחזור אנטיגן
      1. הוסף תמיסת אחזור אנטיגן Tris-EDTA (pH 9.0) לתא היציב בחום כדי לטבול את השקופיות. מיקרוגל את התא העמיד בחום המכיל את השקופיות בעוצמה מקסימלית (700 וואט, 3 דקות) עד לרתיחה. המשיכו לחמם במיקרוגל בטמפרטורה נמוכה (70 וואט, 15 דקות) והתקררו לטמפרטורת החדר.
      2. שוטפים במים מזוקקים למשך 2 דקות על שייקר ב-80 סל"ד. חזור על הפעולה פעמיים. הקף את מיקום האורגנואידים בעט היסטולוגי.
   3. חסימת פרוקסידאז
      1. זרוק תמיסה חוסמת פרוקסידאז כדי לכסות את אזור הדגימה. דגירה בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
      2. העבירו את השקופיות לתא יציב בחום. יש לכבס ב-PBST (PBS + 0.1% Tween 20) למשך 2 דקות ב-80 סל"ד. חזור על הפעולה פעמיים.
   4. דגירה ראשונית של נוגדנים
      1. נגב בעדינות את טיפות ה-PBST העודפות על השקופיות.
         הערה: הימנע מלגעת באורגנואידים בשקופיות.
      2. זרוק נוגדן ראשוני מדולל כדי לכסות את אזור האורגנואיד. דגירה בתא לחות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, או 8-14 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה.
   5. דגירה משנית של נוגדנים
      1. חזור על שלב 5.2.4.1. זרוק נוגדן משני HRP מדולל כדי לכסות את אזור האורגנואידים. דגירה בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. חזור על שלב זה.
   6. צביעת DAB (3,3′-Diaminobenzidine).
      1. חזור על שלב 5.2.4.1. שחרר 1× DAB כדי לכסות את אזור האורגנואידים. דוגרים בתא לחות בטמפרטורת החדר עד שהצבע הופך לחום.
      2. טבלו את המגלשות במים מזוקקים למשך 5-10 שניות כדי לסיים את שינוי הצבע. חזור על השלב.
   7. מכתים המטוקסילין
      1. מכתימים בהמטוקסילין למשך 5-8 דקות. להבדיל באלכוהול חומצי 1% (1% HCl ב-70% אלכוהול) למשך 5-10 שניות.
      2. טבלו את המגלשות במים מזוקקים למשך 5-10 שניות. חזור על שלב זה.
   8. התייבשות
      1. עבדו את השקופיות דרך מגשי זכוכית בסדר עוקב: טבלו ב-75% אתנול למשך 5 דקות, העבירו ל-85% אתנול למשך 5 דקות, עברו ל-95% אתנול למשך 5 דקות, ולאחר מכן שתי טבילות נפרדות ב-100% אתנול למשך 10 דקות כל אחת, ולבסוף הניחו בקסילן למשך שתי תקופות רצופות של 20 דקות.
   9. הרכבה בשקופיות
      1. הוסיפו קסילן לחניכיים ניטרליות עד שהוא הופך לשקוף. יש לייבש מעט באוויר. לאחר מכן, זרוק מסטיק עם קסילן כדי לכסות את אזור האורגנואיד.
      2. החל כיסוי. סרוק ונתח את השקופית.
3. צביעה אימונופלואורסצנטית מרובה (mIF).
   1. להסרת שעווה ולחות, חזור על שלב 5.2.1.
   2. לחסימת פרוקסידאז, חזור על שלב 5.2.3.
   3. לאחזור אנטיגן, חזור על שלב 5.2.3.
   4. חסימת סרום כבשים.
      1. חזור על שלב 5.2.4.1. הוסף תמיסה לחסימת סרום כבשים כדי לכסות את אזור האורגנואידים. דגירה בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      2. יש לשטוף ב-PBST למשך 2 דקות.
   5. לדגירת נוגדנים ראשונית, חזור על שלב 5.2.4.
   6. לדגירת נוגדנים משנית, חזור על שלב 5.2.4.1.
      1. זרוק תמיסת נוגדנים משנית ספציפית כדי לכסות את אזור האורגנואידים. דגירה בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. חזור על שלב 5.2.3.2.
         הערה: הגן על שקופיות מפני אור משלב זה ועד סוף הניסוי.
   7. צביעת צבע פלואורסצנטי
      1. חזור על שלב 5.3.4.1. זרוק תמיסת צבע פלואורסצנטי כדי לכסות את אזור האורגנואיד.
      2. דגירה בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 10-20 דקות. חזור על שלב 5.2.3.2.
   8. לריבוי מכתים, חזור על שלבים 5.3.3-5.3.7.
   9. צביעת DAPI
      1. חזור על שלב 5.2.4.1. זרוק תמיסת DAPI כדי לכסות את אזור האורגנואידים. חזור על שלב 5.2.3.2. לאחר מכן, חזור על שלב 5.3.4.2.
      2. טבלו את המגלשות במים מעוקרים למשך 2 דקות.
   10. הרכבה בשקופיות
       1. זרוק מדיום הרכבה נגד דהייה כדי לכסות את אזור האורגנואיד. החל כיסוי.
   11. רכוש תמונות דיגיטליות באמצעות סורק שקופיות ונתח אותן.

פרוטוקול זה מתאר דגימה אורגנואידית וניתוח היסטולוגי בשלבים שונים של גידול ESCC (איור 1). על ידי דגימת רירית הוושט הרגילה, ניאופלזיה תוך-אפיתלית בדרגה נמוכה (LGIN), ניאופלזיה תוך-אפיתלית בדרגה גבוהה (HGIN) ורקמות גידול מחולי ESCC, ניתן לבנות אורגנואידים המייצגים שלבים שונים של גידול. יתר על כן, בוצעו הטמעת פרפין וחתך של אורגנואידים אלה, ואחריהם צביעה אימונופלואורסצנטית.

כדי לחקור את הביטוי של מולקולות מדכאות חיסון ואת המאפיינים המורפולוגיים של שיבוטי תאים במהלך גידול, נאספו רקמות אפיתל של הוושט משלבים שונים של התפתחות הגידול, וביצעו צביעה אימונופלואורסצנטית. לאחר השלמת הצביעה, הוגדרו ארבעה פסאודו-צבעים לסמנים לפני סריקת השקופיות. PD-L1, Ki-67 ו-KRT6A הוקצו לפסאודו-צבעים של ירוק, אדום ואפור, בהתאמה, בעוד שגרעיני התאים סומנו ב-DAPI. תוצאות הניסוי הראו כי מורפולוגיה אורגנואידית מרירית הוושט השתנתה במהלך הגידול, ובעיקר הפכה לא מאורגנת יותר. צביעה אימונופלואורסצנטית גילתה שככל שהגידול התקדם, התפשטות תאי האפיתל השתנתה, מלווה בביטוי מוגבר של מולקולות מדכאות חיסון כמו PD-L1 (איור 2).

איור 1: זרימת עבודה של הקמה וניתוח היסטולוגי של אורגנואידים רב-שלביים של קרצינומה של תאי קשקש בוושט (ESCC). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: צביעה אימונופלואורסצנטית מרובה (mIF) של אורגנואיד ESCC רב-שלבי. תמונות מייצגות המציגות ביטוי של PD-L1 (ירוק), Ki-67 (אדום) ו-KRT6A (אפור). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. NOR, רירית תקינה; LGIN, ניאופלזיה תוך-אפיתליאלית בדרגה נמוכה; LGIN, ניאופלזיה תוך-אפיתליאלית בדרגה גבוהה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הקמה וניתוח היסטולוגי של אורגנואידים מייצגים התקדמות משמעותית במידול התקדמות הגידול. הפרוטוקול מציע יתרונות בולטים על פני השיטות הקיימות לחקר גידול²⁰. בניגוד למערכות תרבית תאים דו-ממדיות מסורתיות, אורגנואידים שומרים על ארכיטקטורה תלת מימדית מורכבת והטרוגניות תאית המשקפת טוב יותר את תנאי in vivo. בהשוואה למודלים של בעלי חיים, אורגנואידים שמקורם ברקמה אנושית מייצגים בצורה מדויקת יותר מאפייני מחלות אנושיות ^9,21,22. השילוב של צביעה אימונופלואורסצנטית מרובה מאפשר הדמיה בו זמנית של סמנים מרובים, ומספק תובנות לגבי היחסים המרחביים בין מולקולות מפתח וארכיטקטורת רקמות במהלך התפתחות הגידול. תוך שימוש בפרוטוקול מתקדם זה, מחקר זה חשף שינויים דינמיים משמעותיים בקרצינומה של תאי קשקש בוושט, והדגים באופן ספציפי כי רמות התפשטות תאי הגידול השתנו בהדרגה במהלך התפתחות הגידול, מלווים בשינויים מקבילים בביטוי המולקולה המדכאת את החיסון PD-L1.

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה מקיפה לחקירת שינויים מורפולוגיים ומולקולריים במהלך גידול, עם מספר שלבים קריטיים הדורשים תשומת לב מיוחדת. יש לעקוב בקפידה אחר זמן העיכול במהלך עיבוד הרקמות, שכן עיכול יתר עלול להוביל למוות מוגזם של תאים, בעוד שעיכול לא מספיק גורם לבידוד תאים לקוי. בנוסף, בקרת טמפרטורה במהלך טיפול במטריצת ממברנת המרתף היא קריטית - יש לשמור על המטריצה ב-4 מעלות צלזיוס כדי למנוע פילמור מוקדם תוך שמירה על כדאיות התא.

עם זאת, יש להכיר במגבלות מסוימות של הטכניקה. היעדר רכיבים חיסוניים ותאי סטרומה במערכת התרבית האורגנואידית הבסיסית עשוי שלא לסכם באופן מלא את האינטראקציות בין גידול למיקרו-סביבה^23,24. ניתן לטפל במגבלה זו באופן חלקי באמצעות מערכות קו-תרבות, אם כי שינויים כאלה דורשים אופטימיזציה קפדנית. לבסוף, הפשרת האורגנואידים היא גם נושא חשוב. על פי ניסיון קודם, אחוזי ההצלחה של הפשרת אורגנואידים קפואים אינם גבוהים. לכן, מומלץ למשתמשים להקפיא אורגנואידים בזהירות.

ההשלכות הקליניות של פרוטוקול זה הן משמעותיות, במיוחד במתן אפשרות למידול של התקדמות רב-שלבית מ-NOR דרך LGIN ו-HGIN לקרצינומה פולשנית⁶. אורגנואידים שמקורם בחולה שנוצרו באמצעות מתודולוגיה זו משמשים ככלים רבי ערך למחקר ורפואה מותאמת אישית, ומאפשרים זיהוי סמנים מולקולריים הקשורים להתקדמות המחלה^25,26.

ניתן להתאים פרוטוקול זה ליישומים שונים בחקר הסרטן ופיתוח תרופות. ניתן להרחיב את המתודולוגיה לחקר סרטן אפיתל אחרים ולשנות אותה כך שתשלב טכניקות ניתוח נוספות כגון ריצוף תא בודד^27,28. יתר על כן, התאמות עתידיות יכולות לשלב פיברובלסטים ותאי חיסון הקשורים לסרטן שמקורם בחולה כדי לדגמן אינטראקציות גידול-סטרומה-חיסון או לשלב עריכת CRISPR כדי לחקור מניעים גנטיים, ולהרחיב את התועלת שלה במחקר תרגומי וחיזוי תגובה לטיפול^29,30.

פרוטוקול זה מציג את השיטות לבנייה והקפאה של אורגנואידים משלבים שונים של גידול של ESCC. חשוב מכך, הטכניקות של הטמעה, חתך, צביעת IHC ו-mIF עבור אורגנואידים מתוארות במאמר זה. אנו מאמינים שניתן ליישם שיטות אלה של הטמעה, חיתוך וצביעה של אורגנואידים על שיטות צביעה אורגנואידיות של מקורות איברים מרובים, כולל הוושט. גישה זו יכולה גם לעזור לחוקרים להתבונן בקשר בין ביטוי מולקולרי רלוונטי למבנה מרחבי.

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים או ניגודי אינטרסים מתחרים.

המחברים מודים לכל המטופלים והרופאים המשתתפים במחקר בבית החולים לסרטן, באקדמיה הסינית למדעי הרפואה (CAMS) ובמכללה הרפואית של פקין יוניון (PUMC). מחקר זה ממומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82203156 עד S.Z.), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2023YFC3503200 עד S.Z.), וקרן החדשנות של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה למדעי הרפואה (2023-I2M-QJ-002 עד S.Z). איור 1 נוצר עם BioRender.com.