È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Method Article
Il presente protocollo descrive l'imaging del tempo di vita della fluorescenza NAD(P)H di un intestino murino espiantato infettato con il parassita naturale Heligmosomoides polygyrus, che consente di studiare i processi metabolici sia nei tessuti dell'ospite che in quelli del parassita in modo spazialmente risolto.
I parassiti hanno generalmente un effetto negativo sulla salute del loro ospite. Rappresentano un enorme onere sanitario, in quanto incidono a livello globale sulla salute dell'uomo o dell'animale infestato a lungo termine e, quindi, incidono sui risultati agricoli e socioeconomici. Tuttavia, sono stati descritti effetti immunoregolatori guidati dai parassiti, con potenziale rilevanza terapeutica per le malattie autoimmuni. Sebbene il metabolismo sia nell'ospite che nei parassiti contribuisca alla loro difesa e sia la base per la sopravvivenza dei nematodi nell'intestino, è rimasto in gran parte poco studiato a causa della mancanza di tecnologie adeguate. Abbiamo sviluppato e applicato l'imaging a fluorescenza NAD(P)H al tessuto intestinale murino espiantato durante l'infezione con il nematode naturale Heligmosomoides polygyrus per studiare i processi metabolici sia nell'ospite che nei parassiti in modo spazialmente risolto. Lo sfruttamento del tempo di vita in fluorescenza dei coenzimi nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) e nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH), di seguito NAD(P)H, che sono conservati in tutte le specie, dipende dal loro stato di legame e dal sito di legame sugli enzimi che catalizzano i processi metabolici. Concentrandosi sugli enzimi NAD(P)H-dipendenti più abbondantemente espressi, sono state distinte le vie metaboliche associate alla glicolisi anaerobica, alla fosforilazione ossidativa/glicolisi aerobica e al burst ossidativo basato su NOX, come principale meccanismo di difesa, ed è stato caratterizzato il crosstalk metabolico tra l'ospite e il parassita durante l'infezione.
Le infezioni parassitarie impongono un enorme onere alla salute umana 1,2. Nei paesi industrializzati è stata osservata una correlazione tra l'aumento delle malattie autoimmuni e il declino delle infezioni parassitarie. È noto che i parassiti possono avere effetti benefici smorzando le eccessive risposte immunitarie dell'ospite. H. polygyrus è un parassita naturale che si trova nell'intestino nei roditori ed è noto per indurre meccanismi immunoregolatori che riducono la risposta immunitaria antiparassitaria dell'ospite attraverso, tra gli altri meccanismi, l'induzione di cellule T regolatorie (Treg) nell'ospite infetto 3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Questi meccanismi regolatori sono particolarmente interessanti nelle malattie autoimmuni degenerative.
L'analisi del crosstalk metabolico tra l'ospite e i nematodi intestinali rimane ampiamente trascurata, sebbene il metabolismo svolga un ruolo importante sia nell'ospite che nei parassiti per la difesa, la sopravvivenza e la funzione. Proponiamo di adattare e applicare l'imaging a fluorescenza NADH e NADPH sull'eccitazione a due fotoni, una tecnologia già ampiamente utilizzata in diverse situazioni fisiologiche e fisiopatologiche in cellule e tessuti di mammifero12, per studiare il metabolismo dell'ospite e del nematode nei tessuti viventi in modo correlato.
NADH e NADPH, indicati come NAD(P)H, sono molecole ubiquitarie che sono conservate in tutte le forme di vita basate sulle cellule e svolgono il ruolo di co-enzimi in varie vie metaboliche. Ad esempio, sono coinvolti nella produzione di energia, nella biosintesi riduttiva e nella produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) mediate da NADPH ossidasi, che sono principalmente legate alla difesa cellulare e alla comunicazione cellulare 13,14,15,16,17,20. Entrambi i coenzimi emettono fluorescenza a ~450 nm dopo eccitazione a due fotoni a 750 nm, consentendo così l'imaging metabolico privo di marcatori in cellule e tessuti19,21. Eccitare sia il NADH che il NADPH con una sola lunghezza d'onda è possibile a causa dei loro spettri di eccitazione a due fotoni simili e piuttosto ampi21.
Il tempo di vita della fluorescenza del coenzima NAD(P)H dipende direttamente dall'enzima a cui si lega 18,21,22,23. A causa della sua struttura chimica che consente il trasferimento di energia intramolecolare, la molecola eccitata di NADH o NADPH perde energia attraverso processi di conversione interna, ad una velocità che dipende dalle sue proprietà di legame, agli enzimi (catalizzatore) prima di rilassarsi ed emettere un fotone di fluorescenza. Questo tempo di vita fornisce informazioni sul sito di legame del NAD(P)H sull'enzima e, quindi, sulla reazione biochimica preferenziale che avviene 19,21,22,23,24,25. Il tempo di fluorescenza delle molecole libere di NADH e NADPH ammonta a ~450 ps, mentre il loro tempo di fluorescenza quando si legano a un enzima è molto più lungo (~2.000 ps) e dipende dal loro sito di legame sul rispettivo enzima21.
Ci sono più di 370 enzimi coinvolti nei processi legati al NAD(P)H; tuttavia, solo i più abbondanti saranno in grado di contribuire al tempo di vita della fluorescenza del NAD(P)H risultante all'interno dell'intervallo di eccitazione del microscopio. Utilizzando i dati RNASeq provenienti da cellule di mammifero, abbiamo identificato gli enzimi NAD(P)H-dipendenti più abbondanti e abbiamo generato un riferimento del tempo di vita della fluorescenza per interpretare i dati generati in campioni di tessuti e cellule18. In tal modo, questo lavoro ha distinto, ad esempio, tra l'attività preferenziale della lattato deidrogenasi (LDH), che è associata alle vie metaboliche glicolitiche anaerobiche, e l'attività dell'isocitrato deidrogenasi (IDH) e della piruvato deidrogenasi (PDH), che sono principalmente coinvolte nelle vie metaboliche della glicolisi aerobica/fosforilazione ossidativa16,20. Inoltre, il legame del NADPH alle NADPH ossidasi, che sono gli enzimi principalmente responsabili del burst ossidativo, può essere facilmente risolto a causa della posizione caratteristica di questi enzimi nella cellula (legata alla membrana) e a causa della durata di fluorescenza del NADPH particolarmente lunga (3.650 ps)18,24,29,30,32. I dati RNASeq di H. polygyrus mostrano che il riferimento generato per le cellule di mammifero si applica anche in forma adattata a questo nematode27.
Quindi, in questo lavoro, eseguendo l'imaging del tempo di vita della fluorescenza (FLIM) del NAD(P)H in campioni di duodeno appena espiantati di topi infettati da H. polygyrus, sono state acquisite informazioni sul rapporto tra NAD(P)H libero e legato all'enzima, che rappresentava l'attività metabolica generale in tutti i tessuti, così come l'enzima prevalentemente attivo in ogni pixel dell'immagine (ad esempio, l'enzima a cui il NAD(P)H si lega preferenzialmente in quella specifica posizione). Il successo di questi esperimenti si basa sull'accurata preparazione del campione dell'intestino espiantato, sull'affidabile imaging dal vivo del tempo di vita della fluorescenza del NAD(P)H a risoluzione subcellulare e sulla valutazione standardizzata dei dati, come discusso in questo protocollo.
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali per la protezione degli animali e approvati dal Comitato tedesco per l'etica degli animali (G0176/16 e G0207/19). Il protocollo descrive l'acquisizione e la valutazione dei dati di imaging a fluorescenza del NAD(P)H, che consentono di valutare l'attività metabolica generale e le vie metaboliche specifiche sia nell'intestino ospite che nei parassiti in seguito all'infezione con il nematode intestinale murino naturale, H. polygyrus. A questo scopo, le femmine di topi C57BL/6 di età compresa tra 10 e 12 settimane sono state infettate con 200 larve di stadio 3 (L3). In diversi momenti dell'infezione, i topi infetti sono stati sacrificati e i duodeni sono stati asportati e preparati per l'imaging come precedentemente descritto33. I duodeni di topi non infetti, di pari età e sesso sono stati preparati e visualizzati in modo simile per scopi di controllo. Per mantenere le proprietà tissutali necessarie per ulteriori immagini e analisi, i campioni devono essere elaborati immediatamente dopo l'espianto e le fasi successive (fasi 1.1-1.7) devono essere eseguite rapidamente (Figura 1B).
1. Preparazione del campione
2. Imaging
NOTA: Il sistema di microscopio utilizzato per eseguire NAD(P)H-FLIM in campioni di tessuto duodenale infetto e sano è costituito dai dispositivi elencati e descritti nella Figura 2 e nella Tabella dei materiali. Utilizza ImSpector 208 come software di controllo per tutti i moduli utilizzati.
3. Analisi dei dati
NOTA: Per l'analisi dei fasori delle immagini NAD(P)H-FLIM, il programma per il calcolo delle durate è un codice scritto su misura in Python33.
4. Segmentazione tissutale
NOTA: Utilizzare una rete basata su U-Net pre-addestrata (ILASTIK, vedi Tabella dei materiali) per segmentare rispettivamente l'ospite intestinale e il tessuto del nematode e, inoltre, l'epitelio e la lamina propria nell'ospite e le aree del segnale di fluorescenza ad alto NAD(P)H e le aree del segnale di fluorescenza a basso NAD(P)H nel nematode.
Utilizzando l'attuale procedura NAD(P)H-FLIM 28,29,33 combinata con il metodo di analisi dei fasori descritto, l'attività metabolica e le vie metaboliche nei duodeni sani e infetti sono state misurate al giorno 6, al giorno 10, al giorno 12 e al giorno 14 dopo l'infezione con il nematode intestinale murino H. polygyrus.
Preservata vitalità del tess...
I passaggi critici all'interno del protocollo si verificano durante la preparazione e quando si trova il ROI. Le fibre di cibo parzialmente digerito rappresentano una sfida per l'imaging, principalmente a causa della luminescenza endogena delle fibre che si sovrappongono alla fluorescenza NAD(P)H, ma anche a causa del loro segnale di generazione armonica. È di grande importanza trovare ROI privi di feci. Abbiamo cercato di evitare di misurare le aree contenenti feci. Il lavaggio è stat...
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamo Robert Günther per l'eccellente supporto tecnico. Sostegno finanziario del Consiglio tedesco della ricerca (DFG) nell'ambito delle sovvenzioni SPP2332 HA2542/12-1 (S.H.), NI1167/7-1 (R.A.N.), HA5354/11-1 (A.E.H.) e RA2544/1-1 (S.R.), nell'ambito della sovvenzione SFB1444, P14 (R.A.N., A.E.H.), della sovvenzione HA5354/8-2 (A.E.H.) e delle sovvenzioni GRK2046 B4 e B5 (S.H., S.R.) e HA2542/8-1 (S.H.) sono molto riconosciuti. W.L. ha ricevuto una borsa di dottorato presso la Berliner Hochschule für Technik, School of Applied Sciences, Berlino, in Fisica Medica/Ingegneria Fisica.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Thermo fisher | J32802.22 | ultra pure |
Blunt scissors | FST fine science tools | 14108-09 | blund-blund 14 cm |
Bodipy c12 | thermo fisher | D3822 | 1 mg solid |
Control units, diode, TCSPC | LaVision Biontech | custom | TrimScope II |
DMSO | Thermo fisher | D12345 | 3 mL |
Filters | Chroma | 755 | 466 ± 20, 525 ± 25, 593 ± 20, 655 ± 20 nm |
Foliodrape sheet | Hartmann | 277500 | |
Gloves | Sigma-Aldrich | Z423262 | nitril |
Halogen torch | Leica | This item has been phased out and is no longer available | KL 1500 LCD |
hPMT | Hamamatsu, Germany | H7422 | GaAsP |
Ilastik | Netlify | free Software | Java Backend |
ImageJ | National Institutes of health | free Software | FIJI - standard plugins |
Imspector | LaVision Biontech | - | Vers. 208 |
Intravital stage | LaVision Biontech | custom | TrimScope II |
Lens system 20x | Zeiss | custom | W-plan-apochom 20x Waterimmersion NA 1.05 |
Mercury vapor torch | LaVision Biontech | custom | |
microbrush | Fisher scientific | 22-020-002 | 85 mm |
Microscope | LaVision Biontech | custom | TrimScope II |
Oscilloscope | Rhode & Schwarz | 1326.2000.22 | |
PBS | Sigma-Aldrich | AM9624 | 0.5 L |
Petri dish | Sigma aldrich | P5606 | 40 x 15 mm |
Pipette | thermo fisher | 4651280N | Einkanalpipette |
Pipette tips | thermo fisher | 94056980 | Spitzen mit Filter |
PMT | Hamamatsu, Japan | H7422 | GaAsP |
Python | Python Software foundation | free Software | Anaconda 3.7 Spyder IDE, standard librarys with KYTE |
Sterio microscope | Leica | This item has been phased out and is no longer available | M26, 6.3x zoom |
Ti:Sa LASER CHAMELION ULTRA II | Coherent, APE | - | 690-1080 nm tunable, 80MHz |
Tissueglue | 3M | 51115053603 | 3 mL |
Tweezers | FST fine science tools | 11049-10 | blund, graefe, angeled |
Tweezers | FST fine science tools | 91197-00 | Dumont, curved |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon