A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يصف البروتوكول الحالي التصوير الفلوري NAD (P) H لعمر أمعاء الفئران المزروعة المصابة بالطفيلي الطبيعي Heligmosomoides polygyrus ، والذي يسمح للمرء بالتحقيق في عمليات التمثيل الغذائي في كل من الأنسجة المضيفة والطفيلية بطريقة محلولة مكانيا.
الطفيليات بشكل عام لها تأثير سلبي على صحة مضيفها. وهي تمثل عبئا صحيا ضخما، لأنها تؤثر على صحة الإنسان أو الموبوء على الصعيد العالمي، وبالتالي تؤثر على النتائج الزراعية والاجتماعية والاقتصادية. ومع ذلك ، فقد تم وصف التأثيرات التنظيمية المناعية التي يحركها الطفيليات ، مع الأهمية العلاجية المحتملة لأمراض المناعة الذاتية. في حين أن التمثيل الغذائي في كل من المضيف والطفيليات يساهم في دفاعهم وهو أساس بقاء الديدان الخيطية في الأمعاء ، إلا أنه ظل غير مدروس إلى حد كبير بسبب نقص التقنيات الكافية. لقد قمنا بتطوير وتطبيق التصوير الفلوري NAD (P) H على أنسجة الأمعاء المزروعة أثناء الإصابة بالديدان الخيطية الطبيعية Heligmosomoides polygyrus لدراسة عمليات التمثيل الغذائي في كل من المضيف والطفيليات بطريقة محلية محلية. يعتمد استغلال العمر الفلوري للإنزيمات المساعدة نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) ونيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الفوسفات (NADPH) ، المشار إليها فيما بعد NAD (P) H ، والتي يتم الحفاظ عليها عبر الأنواع ، على حالة ارتباطها وموقع الارتباط على الإنزيمات التي تحفز عمليات التمثيل الغذائي. مع التركيز على الإنزيمات المعتمدة على NAD (P) H الأكثر تعبيرا عنها بكثرة ، تم تمييز مسارات التمثيل الغذائي المرتبطة بتحلل السكر اللاهوائي ، والفسفرة المؤكسدة / تحلل السكر الهوائي ، والانفجار التأكسدي القائم على أكاسيد النيتروجين ، كآلية دفاع رئيسية ، وتم تمييز الحديث الأيضي بين المضيف والطفيلي أثناء الإصابة.
تفرض العدوى الطفيلية عبئا كبيرا على صحة الإنسان1،2. لوحظ وجود علاقة بين ارتفاع أمراض المناعة الذاتية وانخفاض العدوى الطفيلية في البلدان الصناعية. من المعروف أن الطفيليات يمكن أن يكون لها آثار مفيدة عن طريق تثبيط الاستجابات المناعية المفرطة للمضيف. H. polygyrus هو طفيلي طبيعي موجود في الأمعاء في القوارض ، ومن المعروف أن هذا الطفيلي يحفز آليات التنظيم المناعي التي تقلل من الاستجابة المناعية المضادة للطفيليات للمضيف ، من بين آليات أخرى ، تحريض الخلايا التائية التنظيمية (Treg) في المضيف المصاب3،4،5،6،7،8،9،10،11. هذه الآليات التنظيمية ذات أهمية خاصة في أمراض المناعة الذاتية التنكسية.
لا يزال تحليل الحديث المتبادل الأيضي بين المضيف والديدان الخيطية المعوية مهملا على نطاق واسع ، على الرغم من أن التمثيل الغذائي يلعب دورا مهما في كل من المضيف والطفيليات للدفاع والبقاء والوظيفة. نقترح تكييف وتطبيق التصوير الفلوري NADH و NADPH مدى الحياة على إثارة الفوتون ، وهي تقنية مستخدمة بالفعل على نطاق واسع في المواقف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية المختلفة في خلايا وأنسجة الثدييات12 ، للتحقيق في استقلاب المضيف والديدان الخيطية في الأنسجة الحية بشكل مترابط.
NADH و NADPH ، المشار إليهما باسم NAD (P) H ، هي جزيئات في كل مكان يتم الحفاظ عليها في جميع أشكال الحياة القائمة على الخلايا وتلعب دور الإنزيمات المساعدة في مسارات التمثيل الغذائي المختلفة. على سبيل المثال ، يشاركون في إنتاج الطاقة ، والتخليق الحيوي المختزل ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي بوساطة NADPH أوكسيديز (ROS) ، والتي ترتبط بشكل أساسي بالدفاع الخلوي والاتصال الخلوي13،14،15،16،17،20. ينبعث كلا الإنزيمين المساعدين من التألق عند ~ 450 نانومتر عند إثارة الفوتونين عند 750 نانومتر ، مما يسمح بالتصوير الأيضي الخالي من العلامات في الخلايا والأنسجة19،21. من الممكن إثارة كل من NADH و NADPH بطول موجي واحد فقط بسبب أطياف الإثارة ثنائية الفوتون المتشابهة والواسعةإلى حد ما 21.
يعتمد عمر التألق للإنزيم المساعد NAD (P) H بشكل مباشر على الإنزيم الذي يرتبطبه 18،21،22،23. نظرا لتركيبته الكيميائية التي تسمح بنقل الطاقة داخل الجزيئات ، يفقد جزيء NADH أو NADPH المتحمس الطاقة من خلال عمليات التحويل الداخلية ، بمعدل يعتمد على خصائص الارتباط الخاصة به ، إلى الإنزيمات (المحفز) قبل أن يرتاح وينبعث منه فوتون فلوري. يعطي هذا العمر نظرة ثاقبة لموقع ربط NAD (P) H على الإنزيم ، وبالتالي ، فإن التفاعل الكيميائي الحيوي التفضيلي الذي يحدث19،21،22،23،24،25. يبلغ عمر التألق لجزيئات NADH و NADPH الحرة ~ 450 ps ، في حين أن عمرها المضان عند ربطها بإنزيم يكون أطول بكثير (~ 2,000 ps) ويعتمد على موقع الارتباط على الإنزيمالمعني 21.
هناك أكثر من 370 إنزيما تشارك في العمليات المرتبطة ب NAD (P) H. ومع ذلك ، فإن الأكثر وفرة فقط هي التي ستكون قادرة على المساهمة في عمر مضان NAD (P) H الناتج ضمن نطاق الإثارة للمجهر. باستخدام بيانات RNASeq من خلايا الثدييات ، حددنا الإنزيمات المعتمدة على NAD (P) H الأكثر وفرة وأنشأنا مرجعا لعمر التألق لتفسير البيانات التي تم إنشاؤها في عينات الأنسجة والخلايا18. وبالتالي ، ميز هذا العمل على سبيل المثال بين النشاط التفضيلي لنازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، والذي يرتبط بمسارات التمثيل الغذائي المحلل للسكر اللاهوائية ، ونشاط نازعة هيدروجين الايزوسترات (IDH) ونازعة هيدروجين البيروفات (PDH) ، والتي تشارك بشكل أساسي في مسارات التمثيل الغذائي لتحلل السكر الهوائي / الفسفرة المؤكسدة16،20. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن حل ارتباط NADPH بأكسيدة NADPH ، وهي الإنزيمات المسؤولة بشكل أساسي عن الانفجار التأكسدي ، بسهولة بسبب الموقع المميز لهذه الإنزيمات في الخلية (المرتبطة بالغشاء) وبسبب العمر المضيان الطويل بشكل خاص ل NADPH (3،650 ps) 18،24،29،30،32. تظهر بيانات RNASeq من H. polygyrus أن المرجع الذي تم إنشاؤه لخلايا الثدييات ينطبق أيضا في شكل مكيف على هذه الديدان الخيطية27.
ومن ثم ، في هذا العمل ، من خلال إجراء تصوير العمر المضان NAD (P) H (FLIM) في عينات الاثني عشر المزروعة حديثا للفئران المصابة ب H. polygyrus ، تم الحصول على معلومات عن النسبة بين NAD (P) H الحر والمرتبط بالإنزيم ، والتي تصور النشاط الأيضي العام في جميع الأنسجة ، بالإضافة إلى الإنزيم النشط في الغالب في كل بكسل من الصورة (على سبيل المثال ، الإنزيم الذي يرتبط به NAD (P) H بشكل تفضيلي في هذا الموقع المحدد). يعتمد نجاح هذه التجارب على التحضير الدقيق للعينة من الأمعاء المزروعة ، والتصوير الحي الموثوق به لعمر مضان NAD (P) H بدقة تحت الخلوية ، وتقييم البيانات الموحد ، كما تمت مناقشته في هذا البروتوكول.
تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية لحماية وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الألمانية لأخلاقيات لحماية (G0176/16 و G0207/19). يصف البروتوكول الحصول على بيانات التصوير مدى الحياة NAD (P) H وتقييم البيانات ، مما يسمح للمرء بتقييم نشاط التمثيل الغذائي العام والمسارات الأيضية المحددة في كل من الأمعاء المضيفة والطفيليات عند الإصابة بالديدان الخيطية المعوية الطبيعية للفئران ، H. polygyrus. لهذا الغرض ، أصيبت إناث الفئران C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين 10 و 12 أسبوعا ب 200 يرقات من المرحلة 3 (L3). في نقاط زمنية مختلفة من العدوى ، تم التضحية بالفئران المصابة ، وتم استئصال الاثني عشر وإعدادها للتصوير كما هو موضحسابقا 33. تم تحضير الاثني عشر للفئران غير المصابة والمتطابقة مع العمر والجنس وتصويرها بالمثل لأغراض التحكم. للحفاظ على خصائص الأنسجة اللازمة لمزيد من التصوير والتحليل ، يجب معالجة العينات مباشرة بعد الاستخراج ، ويجب تنفيذ الخطوات التالية (الخطوات 1.1-1.7) بسرعة (الشكل 1 ب).
1. تحضير العينة
2. التصوير
ملاحظة: يتكون نظام المجهر المستخدم لإجراء NAD (P) H-FLIM في عينات أنسجة الاثني عشر المصابة والصحية من الأجهزة المدرجة والموضحة في الشكل 2 وجدول المواد. استخدم ImSpector 208 كبرنامج تحكم لجميع الوحدات النمطية المستخدمة.
3. تحليل البيانات
ملاحظة: بالنسبة لتحليل الطور لصور NAD (P) H-FLIM ، فإن برنامج حساب العمر الافتراضي هو رمز مكتوب حسب الطلب في Python33.
4. تجزئة الأنسجة
ملاحظة: استخدم شبكة قائمة على U-Net مدربة مسبقا (ILASTIK ، انظر جدول المواد) لتجزئة المضيف المعوي وأنسجة الديدان الخيطية ، على التوالي ، وعلاوة على ذلك ، الظهارة والصفيحة المخصوصة في المضيف ومناطق إشارة التألق NAD (P) H العالية ومناطق إشارة مضان NAD (P) H المنخفضة في الديدان الخيطية.
باستخدام إجراء NAD (P) H-FLIMالحالي 28،29،33 جنبا إلى جنب مع طريقة تحليل الفاسور الموصوفة ، تم قياس النشاط الأيضي ومسارات التمثيل الغذائي في الاثني عشر السليمة والمصابة في اليوم 6 واليوم 10 واليوم 12 واليوم 14 بعد الإصابة بالديدان ...
تحدث الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول أثناء الإعداد وعند العثور على عائد الاستثمار. تمثل ألياف الطعام المهضوم جزئيا تحديا للتصوير ، ويرجع ذلك أساسا إلى التلألؤ الداخلي للألياف المتداخلة مع مضان NAD (P) H ، ولكن أيضا بسبب إشارة التوليد التوافقية. من الأهمية بمكان العثور على ...
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
نشكر روبرت غونتر على دعمهم الفني الممتاز. الدعم المالي من مجلس البحوث الألماني (DFG) بموجب المنحة SPP2332 HA2542 / 12-1 (S.H.) ، NI1167 / 7-1 (R.A.N.) ، HA5354 / 11-1 (A.E.H.) ، و RA2544 / 1-1 (S.R.) ، بموجب المنحة SFB1444 ، P14 (R.A.N. ، A.E.H.) ، بموجب المنحة HA5354 / 8-2 (A.E.H.) ، وبموجب المنحة GRK2046 B4 و B5 (S.H. ، S.R.) و HA2542 / 8-1 (S.H.) معترف بها إلى حد كبير. حصل WL على زمالة الدكتوراه من Berliner Hochschule für Technik ، كلية العلوم التطبيقية ، برلين في الفيزياء الطبية / الهندسة الفيزيائية.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Thermo fisher | J32802.22 | ultra pure |
Blunt scissors | FST fine science tools | 14108-09 | blund-blund 14 cm |
Bodipy c12 | thermo fisher | D3822 | 1 mg solid |
Control units, diode, TCSPC | LaVision Biontech | custom | TrimScope II |
DMSO | Thermo fisher | D12345 | 3 mL |
Filters | Chroma | 755 | 466 ± 20, 525 ± 25, 593 ± 20, 655 ± 20 nm |
Foliodrape sheet | Hartmann | 277500 | |
Gloves | Sigma-Aldrich | Z423262 | nitril |
Halogen torch | Leica | This item has been phased out and is no longer available | KL 1500 LCD |
hPMT | Hamamatsu, Germany | H7422 | GaAsP |
Ilastik | Netlify | free Software | Java Backend |
ImageJ | National Institutes of health | free Software | FIJI - standard plugins |
Imspector | LaVision Biontech | - | Vers. 208 |
Intravital stage | LaVision Biontech | custom | TrimScope II |
Lens system 20x | Zeiss | custom | W-plan-apochom 20x Waterimmersion NA 1.05 |
Mercury vapor torch | LaVision Biontech | custom | |
microbrush | Fisher scientific | 22-020-002 | 85 mm |
Microscope | LaVision Biontech | custom | TrimScope II |
Oscilloscope | Rhode & Schwarz | 1326.2000.22 | |
PBS | Sigma-Aldrich | AM9624 | 0.5 L |
Petri dish | Sigma aldrich | P5606 | 40 x 15 mm |
Pipette | thermo fisher | 4651280N | Einkanalpipette |
Pipette tips | thermo fisher | 94056980 | Spitzen mit Filter |
PMT | Hamamatsu, Japan | H7422 | GaAsP |
Python | Python Software foundation | free Software | Anaconda 3.7 Spyder IDE, standard librarys with KYTE |
Sterio microscope | Leica | This item has been phased out and is no longer available | M26, 6.3x zoom |
Ti:Sa LASER CHAMELION ULTRA II | Coherent, APE | - | 690-1080 nm tunable, 80MHz |
Tissueglue | 3M | 51115053603 | 3 mL |
Tweezers | FST fine science tools | 11049-10 | blund, graefe, angeled |
Tweezers | FST fine science tools | 91197-00 | Dumont, curved |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved