Keratinosit Canlı Hücre Görüntüleme için Primer Kültürlerin Oluşturulması

Bu protokol, canlı hücre görüntülemede kullanılmak üzere taze elde edilen (pasaj 0) keratinositlerin kültürünü ana hatlarıyla belirtir.

İnsan derisinde tek hücre düzeyinde kök hücrelerin ve işlenen progenitör davranışın izlenmesi hem in vivo hem de in vitro olarak zor olmuştur. Canlı hücre görüntüleme, keratinosit kök hücreleri ile işlenmiş progenitör davranış arasındaki farkları belirleme yeteneğinde önemli ilerlemelere izin vermiştir. Canlı hücre görüntüleme, keratinosit davranışını in vitro olarak incelemek için gelişen ve biraz zorlayıcı bir yöntemdir. Bu protokol, keratinositleri düşük tohumlama yoğunluğunda kültürlemek için geliştirilmiştir ve nispeten uzun süreli hızlandırılmış fotoğrafçılık ve bireysel hücre davranışının izlenmesini sağlar. Passage 0 keratinositleri klonal yoğunlukta büyütülür ve hızlandırılmış fotoğrafçılık, tek tek hücre bölünmelerinin ve bunların ortaya çıkma zamanının belgelenmesine izin verir. Maksimum biyolojik alaka için, yeni izole edilmiş insan keratinositleri in vitro olarak yerleştirilir. Bu yaklaşım çoğalmaya odaklanmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol, hücre göçünü, yara iyileşmesini ve motiliteyi ölçmek gibi bireysel hücre davranışını ölçen diğer canlı hücre görüntüleme uygulamalarında kullanım için uyarlanabilir.

Bu protokolün amacı, düşük tohumlama yoğunlukları ve hızlandırılmış fotoğrafçılık ile mümkün kılınan nispeten uzun bir süre (birkaç hafta) boyunca kültürdeki bireysel keratinositleri izleme yeteneği sağlamaktır. Düşük yoğunlukta canlı hücre görüntüleme, araştırmacılara hücre davranışını in vitro olarak tek bir hücre düzeyinde görselleştirme fırsatı verir. Konvansiyonel hücre kültüründe mümkün olmasa da, canlı hücre görüntüleme, hücre döngüsü süresi ve bir kolonideki çoğalma ve farklılaşma bölünmelerinin oranı gibi bölünme kinetiği ile ilgili bilgilerin tespit edilebildiği etiketleme kullanılmadan gerçek zamanlı olarak soy ağaçlarının geliştirilmesini mümkün kılar. Aynı zamanda hücre göçü ve hareketliliğinin incelenmesine de izin verir. Hücre tipine ve yakalanacak verilere bağlı olarak optimizasyon gerektiren yönleriyle teknik olarak zorlayıcı olabilir. Diğer laboratuvarlarda neonatal keratinositler ve/veya büyümesi daha kolay olan pasajlı keratinositler kullanılmıştır¹.

Bununla birlikte, tekrarlanan geçişe uğrayan hücre hatları, davranış ve morfoloji açısından in vivo durumlarından önemli ölçüde farklıdır². En yakın in vivo davranışı elde etmek için en büyük biyolojik alaka düzeyi için, geçiş 0 hücreleri kullanılır. Keratinosit popülasyonlarında, kök hücre ile işlenmiş progenitör arasında sıralama veya etiketleme olmadan ayrım yapmak mümkündür, çünkü canlı hücre görüntüleme ile gözlemlenebilen bölünme davranışında belirgin farklılıklar vardır³.

Keratinosit proliferasyon kinetiğini incelemek için canlı hücre görüntülemeyi kullanıyoruz. Benzer bir yaklaşım, keratinositler⁴ ile birlikte kültürlenen kutanöz melanom hücrelerinin motilitesini, çizik deneylerinin⁵ yapışık hücre göçünü ve ROCK inhibitörlerinin keratinosit proliferasyonunu⁶ nasıl etkilediğini incelemek için kullanılmıştır. Bu protokol, başka amaçlar için uyarlanabilmesine rağmen, canlı hücre görüntüleme ile soy izlemesini kolaylaştırmak için hücrelerin kültürlenmesi için özel olarak tasarlanmıştır.

Bu protokol, canlı hücre görüntüleme amacıyla pasaj 0 keratinositlerinin izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir, ortaya çıkabilecek komplikasyonları tartışır ve protokolde değişiklik gerektirebilecek hususları sağlar (Şekil 1).

İnsan dokusunun kullanımı için kurumun İnsan Araştırmaları Komitesi'nden onay alınması gerekmektedir. Araştırma için insan örnekleri genellikle ticari kaynaklardan elde edilir (örneğin, ATCC, Lifeline hücre teknolojisi ve Zen-Bio). Çalışmalarımızda, ameliyatlar sırasında atılan dokular veya özellikle çalışma amaçları için alınan deri biyopsi örnekleri kullanılmaktadır. Bu durumlar farklı onaylar ve onay prosedürleri gerektirir. Tüm dokular, UCSF İnsan Araştırmaları Komitesi'nin onayından sonra, yazılı bilgilendirilmiş onam kullanılarak ve Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak elde edilir.

1. Epidermisin dermisten ayrılması

1. Çalışma için insan dokusunu kullanmak için uygun onayların alındığından emin olun.
2. Deri örneği alın ve buz torbası ile yalıtımlı bir kapta taşıyın. Numuneyi 5x konsantrasyonda penisilin, streptomisin ve amfoterisin içeren toplama ortamına yerleştirin.
   NOT: Gerekli miktar uygulamaya bağlı olacaktır. Deneyimlerimize göre,^cm2'de yaklaşık 1.000.000 keratinosit yetişkin ve yaşlı ciltten elde edilmektedir. Ancak bu, her numune için önemli ölçüde değişebilir.
   1. Yenidoğan sünnet derilerini hücre kültürü ortamına yerleştirin ve hücre ölümünü en aza indirmek için sünnetten en fazla 48 saat sonra keratinosit izolasyon prosedürüne başlayın. Dokuyu işlenene kadar 4 °C'de saklayın. Yetişkin ve yaşlı numunelerin işlenmesi tipik olarak toplandıktan sonraki birkaç saat içinde başlar.
3. Yutulması, mukoza zarı veya perkütan maruziyet yoluyla hastalığa neden olan ajanlarla çalışmak üzere tasarlanmış BS2 düzeyinde ekipmana sahip bir biyogüvenlik kabinine erişim sağlayın⁷. Kullanmadan önce biyogüvenlik kabininin en az 15 dakika UV ile sterilize edildiğinden ve tüm yüzeylere %70 alkol püskürtüldüğünden emin olun.
4. Eldiven giyin, toplama kabına %70 alkol püskürtün ve kabı çeker ocak içine yerleştirin. Oda sıcaklığına ısınmasını önlemek ve bütünlüğünü korumak için dokunun altına bir soğutma pedi yerleştirin. Doku çok büyükse, işlem için bir kısmını kesin ve geri kalanını toplama kabında nemli tutun.
   NOT: Yaşlı örneklerin çoğu ameliyatlardan kaynaklanan büyük karın veya meme derisi olduğundan, dokunun kesilmesi ve işlenmesi zaman alır. Aşırı soğuk donmasına neden olabileceğinden, doku asla doğrudan pedin üzerine yerleştirilmemelidir. Bunun yerine, mermer levha gibi bir ara yüzeye yerleştirilmelidir.
5. Kaputa iki adet 100 mm x 15 mm Petri kabı ve steril bir #23 cerrahi neşter yerleştirin.
6. Petri kaplarını açın ve her bir kabın iç yüzeyleri yukarı bakacak şekilde kabinin yüzeyine yerleştirin. Petri kaplarından birine 10 mL% 10 klorheksidin glukonat ekleyin. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS; 5x) 10 mL 5x penisilin / streptomisin / amfoterisin / gentamisin ekleyin ve diğer 2 Petri kabı yarısına ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu).
7. Dispase adımı için 6 oyuklu bir plaka hazırlayın. Yenidoğan dokusu için, kuyucuk başına 3 mL Dispase kullanın. Eski doku örnekleri için 4 mL kullanın. Doku hacmi için yetersiz miktarda Dispase kullanmak, epidermisi dermisten ayırmada zorluğa neden olabilir.
8. Dokuyu daha küçük parçalara ayırmak için bir neşter kullanın, böylece Dispase tarafından daha iyi nüfuz eder. Dispase, dokunun kenarlarından sadece 5 mm'ye kadar nüfuz eder, bu nedenle 0,5-1 cm genişliğinde uzun doku şeritleri kesin. Yeterince küçük kesilmezse, epidermisin dermisten ayrılması gerçekleşmez.
   1. Daha kalın dokuyu daha küçük parçalar halinde kesin. Yenidoğan sünnet derilerini 3 veya 4 parçaya (~5 mm x 7 mm) kesin. Dispase oyuğu başına en fazla iki tam sünnet derisi kullanın. Yüzeysel abdominal flepler çok daha ince olma eğilimindedir, deri altı dokusu çok azdır veya hiç yoktur, bunları daha uzun (~ 5 mm x 15 mm şeritler) keser.
   2. Dispase kuyucuğu başına en fazla dört şerit yerleştirin. Elde edilen dokuda çok fazla deri altı yağ varsa, Dispase'in dokuya tam olarak nüfuz etmesine yardımcı olmak için deri altı dokusunu kesin. Doku çok küçük kesilirse, epidermisi soyarken hangi tarafın epidermal ve hangi tarafın dermal olduğunu belirlemek için bir diseksiyon mikroskobu gerekebilir. Cildin yanlış tarafını çekmek ek doku travmasına neden olabilir.
9. Dokuyu epidermal tarafı aşağı bakacak şekilde,% 10 klorheksidin glukonat içeren,% 10 klorheksidin glukonat içeren ilk Petri kabına 10-20 saniye boyunca yerleştirin Daha sonra doku epidermal tarafını HBSS ile 5x penisilin / streptomisin / amfoterisin (PSA) içeren ikinci Petri kabına aktarın ve 10-20 saniye boyunca çalkalayın. Doku epidermal tarafını aşağıya, yine HBSS'li 5x PSA içeren üçüncü Petri kabına aktarın ve 10 saniye daha çalkalayın. Aynı çözelti ile birden fazla numunenin işlenmesi kabul edilebilir.
10. Dokuyu epidermal tarafı aşağı bakacak şekilde adım 1.7'de hazırlanan 6 oyuklu Dispase plakasına aktarın.
    NOT: Konvansiyonumuza göre epidermal tarafı aşağı bakacak şekilde öneriyoruz. Diğer protokoller dermisi aşağı⁸ önermektedir. Tüm Dispase eşit derecede etkili değildir. Yaşlanmış ciltten epidermisin soyulması, üreticinin tavsiye ettiği seviyenin 4 katına kadar konsantrasyonlarda bile bazı ürünlerde zor oldu. Bu da zaman ve numune kaybına neden oldu. Şirketler, Dispase için standartlaştırılmamış birimler kullanır ve bu da konsantrasyonların markalar arasında nasıl farklılık gösterdiğini belirlemeyi zorlaştırır. Bu zorluklar nedeniyle, Malzeme Tablosunda listelenen Dispase markalarından birinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
11. Dispase ve numuneleri içeren 6 oyuklu plakayı etiketleyin ve 4 °C'ye aktarın. Yenidoğan örneklerini Dispase'de 16-18 saat ve yetişkin / yaşlı örnekleri 24 saat inkübe edin.
    NOT: Numuneler için kullanılabilecek alternatif bir 2 saatlik protokol vardır, burada numune 37 ° C'de 2 saat boyunca Dispase'ye yerleştirilir ve ardından epidermisin soyulur. Ne yazık ki, bu her zaman işe yaramaz ve inkübasyondan sonra dokunun bütünlüğü tehlikeye girebilir ve bu da kayıp bir numuneye neden olabilir. Mümkün olduğunca gece inkübasyon tercih edilir.

2. Keratinositlerin izolasyonu

1. % 0.05 Tripsin-EDTA (veya TrypLE), Tripsin nötralize edici çözelti ve keratinosit ortamını bir sonraki adıma başlamadan 20 dakika önce 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin
2. 6 oyuklu bir plakayı 4 °C'den çıkarın, üzerine %70 etanol püskürtün ve hazırlanmış bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin (bkz. adım 1.3).
3. Steril dişli forsepsleri ve dişsiz forsepsleri 20 mL %70 etanol içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Başlangıçta davlumbazın dışındaysa, davlumbaza koymadan önce %70 etanol ile forseps püskürtün.
4. Kimyasal olarak sterilize edilmiş forseps kullanarak, bir doku parçasını kavrayın ve epidermal tarafı yukarı bakacak şekilde steril bir yüzeye koyun (bir Petri kabı veya 6 oyuklu plakanın üst yarısının iç kısmını kullanın). Baskın olmayan elinizi kullanarak dokunun dermal kısmını dişli forseps ile tutun ve aynı anda epidermisi dişli olmayan forseps ile sıkıca kavrayın ve kenardan kenara çekin. Tek parça olarak düzgün bir şekilde çıkmalıdır.
5. Epidermisi 15 mL'lik konik bir tüpün dudağının iç kısmına yerleştirin. Her 15 mL konik tüp, maksimum iki sünnet derisinden oluşan bir epidermise sahip olmalıdır.
   1. Verimli çalışmak; Doku kurursa, verim tehlikeye girecektir. Dispas dokuya uygun şekilde nüfuz etmediyse, epidermisin soyulmasında zorluk olabilir. Böyle bir durumda, epidermisi alttaki dermisten çekin / kazıyın. Bu aynı zamanda çok daha düşük bir verimle sonuçlanır ve önerilmez.
6. 15 mL konik tüpe 4 mL %0.05 Tripsin-EDTA ekleyin, ardından tüpü kapatın ve ters çevirin, tüm epidermisin Tripsin içinde süspanse edildiğinden ve tüpün / kapağın yan tarafına yapışmadığından emin olun. 37 °C'lik bir su banyosunda 10 dakika bekletin. Hücreleri her 2 dakikada bir elle çalkalayın.
   NOT: 10 dakikadan fazla tripsinizleme, daha düşük hücre verimine neden olabilir. Ayrıca, hücre yüzey proteinlerinin bütünlüğü bir endişe ise, bölünme bölgesi için daha spesifik olduğu için TrypLE'yi kullanın, bu da hücrelere daha az zarar verir ve Tripsin-EDTA^9'a kıyasla yüzey antijen ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmadığı gösterilmiştir. Ayrıca, su banyosu yaygın bir kirlilik kaynağıdır, bu nedenle düzenli olarak temizlendiğinden emin olun. Aquaguard-2 solüsyonu içeren deiyonize su ile suyu düzenli olarak değiştirin.
7. Biyogüvenlik kabinine 50 mL'lik bir konik tüp yerleştirin. Kapağı sökün ve konik borunun açıklığına 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin.
8. Sindirilmiş numuneyi içeren 15 mL'lik konik tüpü su banyosundan çıkarın, iyice kurulayın ve biyogüvenlik kabinine geri yerleştirmeden önce %70 alkol püskürtün. Konik boruyu çeker ocakın yüzeyine 3x hafifçe vurun ve ardından 6x'i ters çevirin. Kılavuz çekme-ters çevirme döngüsünü 3 kez tekrarlayın.
9. Konik tüpe 6 mL tripsin nötralize edici çözelti ekleyin. Hücre süzgecinden 2.7. adımdan itibaren 50 mL'lik konik tüpe dökün.
10. Numuneyi içeren 15 mL konik tüpü 5 mL tripsin nötralize edici solüsyon (TNS) ile durulayın. Bir hücre süzgecinden 50 mL'lik konik tüpe dökün. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
11. Hemen santrifüjden çıkarın ve ortama hücre kaybını önlemek için süpernatanı pipetleyin. Sadece küçük bir sıvı koleksiyonu ile pelet bırakılmalıdır. Peleti daha küçük doku örneklerinden görmek zor olabilir.
    NOT: Süpernatantta Tripsin bulunur, bu nedenle peleti kaybetmeden mümkün olduğunca çıkarmak en iyisidir.
12. Keratinosit peletini 2 mL keratinosit ortamında yeniden süspanse edin.
    NOT: Burada dikkat edilmesi gereken iki husus vardır. İlk olarak, hangi medyayı kullanacağınız. Bu amaçla kolajen içermeyen serumsuz besiyerleri önerilir. Tarihsel olarak, keratinosit hücre kültürü için standart, bir fibroblast besleyici tabakası (3t3-J2s) üzerinde Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM) +% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) + Ham'ın ^{F-12'si olmuştur10}. Bununla birlikte, serumsuz ortamın ortaya çıkması ve kollajenin mevcudiyeti ile, diğer birçok olasılık geçerli olmaya devam etmektedir (tartışmaya bakınız)¹¹. İkinci husus, kültür ortamında antibiyotik kullanımının canlı hücre görüntüleme uygulaması için uygun olup olmadığıdır. Bu, görüntüleme süresine, süreye ve görüntüleme sistemiyle ilgili deneyime bağlı olacaktır. Koloniler, ortak bir görüntüleme sistemi kullanılarak birkaç hafta boyunca görüntülenir, bu da kültürler üzerindeki potansiyel etkisine rağmen antibiyotik kullanımını tercih edilen bir yaklaşım haline getirir (tartışmaya bakınız). Resüspanse sırasında penisilin, streptomisin, amfoterisin B ve gentamisin içeren keratinosit ortamı kullanılır, ardından ilk ortam değişikliğinden sonra penisilin / streptomisin içeren ortama geçilir. Bu yöntem, genişletilmiş canlı hücre görüntüleme sırasında kontaminasyonu etkili bir şekilde önlemiştir.
13. Hücreleri sayın ve plakayı tohumlayın (tohumlama yoğunluğunun seçilmesiyle ilgili yorumlar için tartışmaya bakın). Düzgün tohumlama dağılımını sağlamak için, kaplamadan önce, kaplanacak toplam ortam miktarındaki keratinosit hücrelerini yeniden süspanse edin. Ters çevirerek hafifçe çalkaladıktan sonra, 1-2 saniye boyunca hafifçe girdap yapın ve plaka. Ardından, mikroplakayı inkübatörde 3x çapraz benzeri bir düzende (yukarı-aşağı, sol-sağ) hareket ettirin.
14. 24 saat sonra, plakayı canlı hücre görüntüleme sisteminin inkübatörüne yerleştirin. Her 20 dakikada bir çekilen görüntülerle 10x'te canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Numuneleri mikroskoba bağlı inkübatöre 37 °C ve %5 CO_2'de yerleştirin.

Bu yöntemde manipüle edilebilecek ve sonuçta çeşitli sonuçlarla sonuçlanabilecek çok sayıda değişken göz önüne alındığında, burada yaygın yanlış adımları ve bunların sonucunda ortaya çıkan sonuçları özetliyor, ayrıca örnek sonuçlar ve bunların arkasındaki koşulları sağlıyoruz.

Herhangi bir hücre kültürü tekniğinde olduğu gibi, kontaminasyon bir olasılıktır (Ek Video 1). Dikkatli steril tekniklerin...

Burada, canlı hücre görüntüleme amacıyla insan keratinositlerinin birincil kültürü için bir yöntemi detaylandırdık. Bu yöntem, başarılı canlı hücre görüntüleme çalışmalarına izin vermek için düşük yoğunluklu kaplama ve uzun süreli kültür kullanarak mevcut hücre kültürü tekniklerini uyarlar. Bu hücre tipinin ayrışması için tercih edilen yöntem, %3-4'ü koloni oluşturan birimler haline gelebilen keratinositlerle sonuçlandığı gösterilen iki ...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bana keratinositleri nasıl kültürleyeceğimi öğrettikleri için T. Richard Parenteau, MD / PhD ve Alexandra Charruyer, PharmD / PhD'ye özel teşekkürler. Keratinositleri izole etmek için bize örnekler sağladığı için Merisa Piper MD'ye teşekkür ederiz. Son olarak, deneyleri tamamlamak için canlı hücre görüntüleme sistemine erişmemize izin verdiği için Michael Rosenblum'a teşekkür ederiz.