יצירת תרביות ראשוניות להדמיית תאים חיים של קרטינוציטים

פרוטוקול זה מתאר את התרבית של קרטינוציטים טריים שהושגו (מעבר 0) לשימוש בהדמיית תאים חיים.

מעקב אחר תאי גזע והתנהגות אב מחויבת ברמת התא הבודד בעור האנושי היה מאתגר הן in vivo והן in vitro. הדמיית תאים חיים אפשרה התקדמות משמעותית ביכולת לזהות הבדלים בין תאי גזע של קרטינוציטים והתנהגות אב מחויבת. הדמיית תאים חיים היא שיטה מתפתחת ומאתגרת במקצת לחקר התנהגות קרטינוציטים במבחנה. פרוטוקול זה פותח לתרבית קרטינוציטים בצפיפות זריעה נמוכה, מה שמאפשר צילום ארוך טווח יחסית וניטור של התנהגות תאים בודדים. קרטינוציטים במעבר 0 גדלים בצפיפות משובטת, וצילום דולג זמן מאפשר תיעוד של חלוקות תאים בודדות וזמן התרחשותן. לקבלת רלוונטיות ביולוגית מקסימלית, קרטינוציטים אנושיים מבודדים טריים ממוקמים במבחנה. גישה זו מתמקדת בהפצה. עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה לשימוש ביישומי הדמיית תאים חיים אחרים המודדים התנהגות תאים בודדים, כגון מדידת נדידת תאים, ריפוי פצעים ותנועתיות.

מטרת פרוטוקול זה היא לספק את היכולת לעקוב אחר קרטינוציטים בודדים בתרבית לאורך תקופה ארוכה יחסית (מספר שבועות) המתאפשרת על ידי צפיפות זריעה נמוכה וצילום דולג זמן. הדמיית תאים חיים בצפיפות נמוכה מעניקה לחוקרים את ההזדמנות לדמיין את התנהגות התא במבחנה ברמת תא בודד. אמנם לא אפשרי בתרבית תאים קונבנציונלית, אך הדמיית תאים חיים מאפשרת לפתח עצי שושלת בזמן אמת, ללא שימוש בתיוג, שממנו ניתן לברר מידע לגבי קינטיקה של חלוקה, כגון משך מחזור התא ושיעור חלוקות השגשוג וההתמיינות במושבה. זה גם מאפשר לחקור את נדידת התאים והתנועתיות. זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, עם היבטים הזקוקים לאופטימיזציה, בהתאם לסוג התא ולנתונים שיש ללכוד. מעבדות אחרות השתמשו בקרטינוציטים יילודים ו/או קרטינוציטים שקל יותר לגדל¹.

עם זאת, קווי תאים שעוברים מעבר חוזר שונים באופן משמעותי בהתנהגות ובמורפולוגיה ממצבם in vivo ². לקבלת הרלוונטיות הביולוגית הגדולה ביותר על מנת להשיג את ההתנהגות הקרובה ביותר ל-in vivo , נעשה שימוש בתאי מעבר 0. באוכלוסיות קרטינוציטים, ניתן להבחין בין תא הגזע לאב הקדמון המחויב ללא מיון או תוויות מכיוון שישנם הבדלים ברורים בהתנהגות החלוקה שניתן לראות באמצעות הדמיית תאים חיים³.

אנו משתמשים בהדמיית תאים חיים כדי לחקור קינטיקה של התפשטות קרטינוציטים. גישה דומה שימשה לחקר התנועתיות של תאי מלנומה עורית בתרבית משותפת עם קרטינוציטים⁴, נדידת תאים דבקים של מבחני שריטות⁵, וכיצד מעכבי ROCK משפיעים על התפשטות קרטינוציטים⁶. פרוטוקול זה תוכנן במיוחד לתרבית תאים כדי להקל על מעקב אחר שושלת על ידי הדמיית תאים חיים, אם כי הוא עשוי להיות מותאם למטרות אחרות.

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של קרטינוציטים ממעבר 0 למטרת הדמיית תאים חיים, דן בסיבוכים שעלולים להתעורר ומספק שיקולים שעשויים לדרוש שינויים בפרוטוקול (איור 1).

נדרש אישור מהוועדה למחקר בבני אדם של המוסד לשימוש ברקמות אנושיות. דגימות אנושיות למחקר מתקבלות לרוב ממקורות מסחריים (לדוגמה, ATCC, טכנולוגיית תאי Lifeline ו-Zen-Bio). המחקרים שלנו משתמשים ברקמות שהושלכו בזמן ניתוחים או בדגימות ביופסיה של העור שנלקחו במיוחד למטרות המחקר. מצבים אלה דורשים אישורים שונים ונהלי הסכמה. כל הרקמות מתקבלות לאחר אישור הוועדה למחקר בבני אדם של UCSF, תוך שימוש בהסכמה מדעת בכתב ובהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי.

1. הפרדת האפידרמיס מהדרמיס

1. ודא שהתקבלו אישורים מתאימים לשימוש ברקמה אנושית למחקר.
2. השג דגימת עור והובל אותה במיכל מבודד עם שקית קרח. הנח את הדגימה באמצעי איסוף המכיל ריכוז פי 5 של פניצילין, סטרפטומיצין ואמפוטריצין.
   הערה: הכמות הנדרשת תהיה תלויה ביישום. מניסיוננו, כ-1,000,000 קרטינוציטים^לסמ" ר מתקבלים מעור בוגר ומבוגר. עם זאת, זה יכול להשתנות באופן משמעותי עבור כל מדגם.
   1. הנח עורלות יילודים במצע תרבית תאים והתחל בהליך בידוד הקרטינוציטים לא יותר מ-48 שעות לאחר ברית המילה כדי למזער את מוות התאים. אחסן את הרקמה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד. עיבוד דגימות בוגרות ומיושנות מתחיל בדרך כלל תוך מספר שעות מרגע האיסוף.
3. קבל גישה לארון בטיחות ביולוגית עם ציוד ברמת BS2 המיועד לעבודה עם חומרים הגורמים למחלות על ידי בליעה, קרום רירי או חשיפה מלעורית⁷. ודא כי ארון הבטיחות הביולוגית מעוקר UV למשך 15 דקות לפחות וכי כל המשטחים מרוססים ב-70% אלכוהול לפני השימוש.
4. לבש כפפות, רסס את מיכל האיסוף ב-70% אלכוהול והניח את המיכל במכסה האדים. הניחו כרית קירור מתחת לרקמה כדי למנוע ממנה להתחמם לטמפרטורת החדר וכדי לשמור על שלמותה. אם הרקמה גדולה במיוחד, חתכו חלק לעיבוד ושמרו את השאר לחים במיכל האיסוף.
   הערה: מכיוון שרבות מהדגימות המבוגרות הן עור בטן או שד גדול מניתוחים, לוקח זמן לחתוך ולעבד את הרקמה. לעולם אין להניח רקמה ישירות על הכרית, מכיוון שהקור הקיצוני עלול לגרום לה להקפיא. במקום זאת, יש להניח אותו על משטח ביניים, כגון לוח שיש.
5. הניחו שתי צלחות פטרי בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ ואזמל כירורגי סטרילי #23 במכסה המנוע.
6. פתחו את צלחות הפטרי והניחו אותן על פני הארון כך שהמשטחים הפנימיים של כל מנה פונים כלפי מעלה. הוסף 10 מ"ל של 10% כלורהקסידין גלוקונאט לאחת ממנות הפטרי. הוסף 10 מ"ל של 5x פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוטריצין/גנטמיצין בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS; 5x) ל-2 חצאי צלחת פטרי אחרים (ראה טבלת חומרים).
7. הכן צלחת 6 בארות לשלב Dispase. עבור רקמות יילודים, השתמש ב-3 מ"ל של Dispase לכל באר. לדגימות רקמות מיושנות, השתמש ב-4 מ"ל. שימוש בכמויות לא מספקות של Dispase לנפח הרקמה עלול לגרום לקושי בהפרדת האפידרמיס מהדרמיס.
8. השתמש באזמל כדי לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות יותר כך שהיא תחדור טוב יותר על ידי Dispase. Dispase חודר רק עד 5 מ"מ מקצוות הרקמה, לכן חותכים רצועות רקמה ארוכות ברוחב 0.5-1 ס"מ. אם לא נחתך מספיק קטן, לא תתרחש הפרדה של האפידרמיס מהדרמיס.
   1. חותכים רקמה עבה יותר לחתיכות קטנות יותר. חותכים עורלות יילודים ל -3 או 4 חלקים (~ 5 מ"מ x 7 מ"מ). יש להשתמש בשתי עורלות שלמות לכל היותר לכל באר של Dispase. דשי בטן שטחיים נוטים להיות דקים בהרבה, עם רקמה תת עורית מינימלית או ללא רקמה תת עורית, חותכים אותם לרצועות ארוכות יותר (~5 מ"מ על 15 מ"מ).
   2. יש להניח מקסימום ארבע רצועות לכל באר של Dispase. אם ברקמה המתקבלת מחובר הרבה שומן תת עורי, חתוך את הרקמה התת עורית כדי לעזור ל-Dispase לחדור באופן מלא לרקמה. אם הרקמה נחתכת קטנה מדי, ייתכן שיהיה צורך במיקרוסקופ מנתח כדי לקבוע איזה צד הוא אפידרמיס ואיזה צד הוא עורי תוך קילוף האפידרמיס. משיכת הצד הלא נכון של העור עלולה לגרום לטראומה נוספת לרקמות.
9. מניחים את צד האפידרמיס של הרקמה כלפי מטה בצלחת הפטרי הראשונה שהוכנה בשלב 1.6, המכילה 10% כלורהקסידין גלוקונאט, למשך 10-20 שניות ואז מעבירים את צד האפידרמיס של הרקמה כלפי מטה לצלחת הפטרי השנייה, המכילה פי 5 פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוטריצין (PSA) עם HBSS, ומערבבים במשך 10-20 שניות. העבירו את צד האפידרמיס של הרקמה כלפי מטה אל צלחת הפטרי השלישית, המכילה שוב 5x PSA עם HBSS, וערבבו עוד 10 שניות. עיבוד מספר דגימות עם אותו פתרון מקובל.
10. העבירו את צד האפידרמיס של הרקמה כלפי מטה אל צלחת ה-Dispase בעלת 6 הבארות שהוכנה בשלב 1.7.
    הערה: אנו ממליצים על צד האפידרמיס כלפי מטה על פי הכנס שלנו. פרוטוקולים אחרים ממליצים על דרמיס⁸. All Dispase אינו יעיל באותה מידה. קילוף האפידרמיס מעור מבוגר התגלה כמאתגר עם מוצרים מסוימים, אפילו בריכוזים של עד פי 4 מהרמה המומלצת על ידי היצרן. זה הביא לאובדן זמן ודגימות. חברות משתמשות ביחידות לא סטנדרטיות עבור Dispase, מה שמקשה על זיהוי ההבדלים בין ריכוזים בין מותגים. בשל אתגרים אלה, מומלץ מאוד להשתמש באחד ממותגי Dispase המפורטים בטבלת החומרים .
11. סמן את צלחת 6 הבארות המכילה את ה-Dispase והדגימות, והעביר ל-4 מעלות צלזיוס. דגירה של דגימות יילודים למשך 16-18 שעות בדגימות Dispase ודגימות בוגרים/מבוגרים למשך 24 שעות.
    הערה: קיים פרוטוקול חלופי של שעתיים שניתן להשתמש בו עבור דגימות, כאשר הדגימה מונחת ב-Dispase ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ולאחר מכן מקלפים את האפידרמיס. למרבה הצער, זה לא תמיד עובד, ושלמות הרקמה עלולה להיפגע לאחר הדגירה, וכתוצאה מכך דגימה אבודה. דגירה של לילה עדיפה במידת האפשר.

2. בידוד של קרטינוציטים

1. יש להניח 0.05% טריפסין-EDTA (או TrypLE), תמיסת נטרול טריפסין וחומר קרטינוציטים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 20 דקות לפני תחילת סדרת השלבים הבאה
2. הסר צלחת של 6 בארות מ-4 מעלות צלזיוס, רסס אותה ב-70% אתנול והנח אותה בארון בטיחות ביולוגית מוכן (ראה שלב 1.3).
3. הנח מלקחיים סטריליים עם שיניים ומלקחיים ללא שיניים בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל של 70% אתנול. אם מחוץ למכסה המנוע בתחילה, ריססו מלקחיים עם 70% אתנול לפני הכנסתו למכסה המנוע.
4. בעזרת מלקחיים מעוקרים כימית, תפסו פיסת רקמה והניחו אותה על משטח סטרילי עם צד האפידרמיס כלפי מעלה (השתמשו בצלחת פטרי או בחלק הפנימי של החצי העליון של צלחת 6 הבארות). החזיקו את החלק העורי של הרקמה בעזרת מלקחיים משוננים באמצעות היד הלא דומיננטית ובמקביל אחזו בחוזקה באפידרמיס עם המלקחיים ללא שיניים ומשכו אותו מקצה לקצה. זה אמור לצאת בצורה חלקה כמקשה אחת.
5. הנח את האפידרמיס בחלק הפנימי של השפה של צינור חרוטי של 15 מ"ל. לכל צינור חרוטי של 15 מ"ל צריך להיות אפידרמיס של שתי עורלות לכל היותר.
   1. עבוד ביעילות; אם הרקמה תתייבש, התשואה תיפגע. אם ה-Dispase לא חדר כראוי לרקמה, ייתכן שיהיה קושי לקלף את האפידרמיס. במקרה כזה, משוך/גרד את האפידרמיס מהדרמיס הבסיסי. זה גם מביא לתשואה נמוכה בהרבה ואינו מומלץ.
6. הוסף 4 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA בצינור החרוטי של 15 מ"ל, ולאחר מכן סגור והפוך את הצינור וודא שכל האפידרמיס תלוי בטריפסין ולא תקוע בצד הצינור/המכסה. מניחים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מערבבים תאים כל 2 דקות ביד.
   הערה: טריפסיניזציה במשך יותר מ-10 דקות עלולה לגרום לתפוקת תאים נמוכה יותר. כמו כן, אם שלמות חלבוני פני התא מדאיגה, השתמש ב-TrypLE מכיוון שהוא ספציפי יותר לאתר המחשוף שלו, וכתוצאה מכך פחות נזק לתאים והוכח כלא מפחית משמעותית את ביטוי האנטיגן על פני השטח בהשוואה ל-Trypsin-EDTA⁹. יתר על כן, אמבט המים הוא מקור זיהום נפוץ, לכן יש להקפיד לנקות אותו באופן קבוע. החלף את המים באופן קבוע במים נטולי יונים המכילים תמיסת aquaguard-2.
7. הנח צינור חרוטי של 50 מ"ל בארון הבטיחות הביולוגית. הברג את המכסה והנח מסננת תאים של 100 מיקרומטר על פתח הצינור החרוטי.
8. הסר את הצינור החרוטי בנפח 15 מ"ל המכיל את הדגימה המעוכלת מאמבט המים, יבש היטב ורסס עם 70% אלכוהול לפני החזרתו לארון הבטיחות הביולוגית. הקש על הצינור החרוטי פי 3 על פני מכסה המנוע ואז הפוך פי 6. חזור על מחזור היפוך הקשה פי 3.
9. הוסף 6 מ"ל של תמיסה מנטרלת טריפסין לתוך הצינור החרוטי. יוצקים דרך מסננת תאים לתוך הצינור החרוטי של 50 מ"ל משלב 2.7.
10. שטפו את הצינור החרוטי בנפח 15 מ"ל המכיל את הדגימה עם 5 מ"ל של תמיסות מנטרלות טריפסין (TNS). יוצקים דרך מסננת תאים לתוך הצינור החרוטי של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות.
11. הסר מיד מהצנטריפוגה ופיפטה את הסופרנטנט כדי למנוע אובדן תאים לתוך המדיום. צריך להישאר רק את הגלולה עם אוסף קטן של נוזלים. זה יכול להיות קשה לראות את הגלולה מדגימות רקמה קטנות יותר.
    הערה: יש טריפסין בסופרנטנט, ולכן עדיף להסיר כמה שיותר מבלי לאבד את הכדור.
12. השעו מחדש את גלולת הקרטינוציטים ב-2 מ"ל של מדיה קרטינוציטים.
    הערה: יש כאן שני שיקולים. ראשית, באיזו מדיה להשתמש. למטרה זו, מומלץ להשתמש בחומר ללא סרום ללא קולגן. מבחינה היסטורית, התקן לתרבית תאי קרטינוציטים היה מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) +10% סרום בקר עוברי (FBS) + F-12 של Ham על שכבת הזנה פיברובלסטים (3t3-J2s)¹⁰. עם זאת, עם הופעת המדיה נטולת הסרום והזמינות של קולגן, אפשרויות רבות אחרות נותרו ברות קיימא (ראה דיון)¹¹. השיקול השני הוא האם השימוש באנטיביוטיקה במדיום התרבית מתאים ליישום הדמיית תאים חיים. זה יהיה תלוי בזמן ההדמיה, משך הזמן והניסיון עם מערכת ההדמיה. מושבות מצולמות במשך מספר שבועות באמצעות מערכת הדמיה משותפת, מה שהופך את השימוש באנטיביוטיקה לגישה מועדפת למרות ההשפעה הפוטנציאלית על תרביות (ראה דיון). פניצילין, סטרפטומיצין, אמפוטריצין B ומדיום קרטינוציטים המכיל גנטמיצין משמשים במהלך ההשעיה, ולאחר מכן מעבר למדיה המכילה פניצילין/סטרפטומיצין לאחר שינוי המדיה הראשוני. שיטה זו מנעה ביעילות זיהום במהלך הדמיה ממושכת של תאים חיים.
13. ספור תאים וזרע את הצלחת (ראה דיון להערות על בחירת צפיפות הזריעה). כדי להבטיח פיזור זריעה אחיד, לפני הציפוי, השעו מחדש את תאי הקרטינוציטים בכמות הכוללת של המדיום שיש לצפות. לאחר תסיסה עדינה על ידי היפוך, מערבולת קלות למשך 1-2 שניות, וצלחת. לאחר מכן, הזיזו את המיקרו-צלחת בתבנית דמוית צלב (למעלה-למטה, שמאלה-ימינה) פי 3 בחממה.
14. לאחר 24 שעות, הנח את הצלחת באינקובטור של מערכת הדמיית התאים החיים. בצע הדמיית תאים חיים במהירות של פי 10 עם תמונות שצולמו כל 20 דקות. הנח את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ בחממה המחוברת למיקרוסקופ.

בהתחשב במשתנים המרובים שניתן לתמרן בשיטה זו שבסופו של דבר מביאים למגוון תוצאות, כאן אנו מתארים טעויות נפוצות ואת התוצאות הנובעות מהן, כמו גם מספקים תוצאות לדוגמה והנסיבות שמאחוריהן.

כמו בכל טכניקת תרבית תאים, זיהום הוא אפשרות (סרטון משלים 1). יחד ע...

כאן, פירטנו שיטה לתרבית ראשונית של קרטינוציטים אנושיים לצורך הדמיית תאים חיים. שיטה זו מתאימה טכניקות קיימות של תרבית תאים באמצעות ציפוי בצפיפות נמוכה ותרבית ארוכת טווח כדי לאפשר מחקרי הדמיה מוצלחים של תאים חיים. השיטה המועדפת לדיסוציאציה מסוג תאים זה כוללת עיכול אנזימ...

למחברים אין מה לחשוף.

תודה מיוחדת ל-T. Richard Parenteau, MD/PhD, ולאלכסנדרה צ'ארוייר, PharmD/PhD, שלימדו אותי כיצד לתרבת קרטינוציטים. תודה למריסה פייפר MD שסיפקה לנו דגימות לבידוד קרטינוציטים. תודה אחרונה למייקל רוזנבלום, MD, על שאיפשר לנו גישה למערכת הדמיית התאים החיים שלו כדי להשלים את הניסויים.