Keratinocyte Live Cell Imaging을 위한 1차 배양 생성

이 프로토콜은 살아있는 세포 이미징에 사용하기 위해 갓 채취한(계대 0) 각질세포의 배양을 간략하게 설명합니다.

인간 피부의 단세포 수준에서 줄기세포와 투질된 전구 세포 행동을 추적하는 것은 생체 내 와 체외 모두에서 어려운 일이었습니다. 생세포 이미징은 각질세포 줄기세포와 헌신적인 전구 세포 행동 간의 차이를 식별하는 능력에 상당한 발전을 가져왔습니다. 생세포 이미징은 in vitro에서 각질 세포 거동을 연구하기 위해 진화하고 있지만 다소 어려운 방법입니다. 이 프로토콜은 낮은 파종 밀도에서 각질 세포를 배양하기 위해 개발되어 비교적 장기적인 타임 랩스 사진 촬영 및 개별 세포 행동의 모니터링을 가능하게 합니다. Passage 0 각질세포는 클론 밀도로 성장하며, 타임랩스 사진을 통해 개별 세포 분열과 발생 시간을 문서화할 수 있습니다. 생물학적 관련성을 극대화하기 위해 갓 분리한 인간 각질세포를 in vitro에 배치합니다. 이 접근 방식은 확산에 중점을 둡니다. 그러나 이 프로토콜은 세포 이동, 상처 치유 및 운동성 측정과 같이 개별 세포 거동을 측정하는 다른 라이브 셀 이미징 애플리케이션에 사용하도록 조정할 수 있습니다.

이 프로토콜의 목표는 낮은 파종 밀도와 타임 랩스 사진을 통해 비교적 장기간(몇 주) 동안 배양된 개별 각질 세포를 추적할 수 있는 기능을 제공하는 것입니다. 저밀도의 라이브 셀 이미징은 연구자에게 단일 세포 수준에서 체외에서 세포 거동을 시각화할 수 있는 기회를 제공합니다. 기존의 세포 배양에서는 불가능하지만, 라이브 셀 이미징을 사용하면 라벨링을 사용하지 않고 실시간으로 계통도를 개발할 수 있으며, 이를 통해 세포 주기 지속 시간, 군체의 증식 및 분화 분열 비율과 같은 분열 역학에 관한 정보를 확인할 수 있습니다. 또한 세포 이동 및 운동성에 대한 연구를 가능하게 합니다. 이는 기술적으로 까다로울 수 있으며, 세포 유형과 캡처할 데이터에 따라 최적화가 필요한 측면이 있습니다. 다른 실험실에서는 성장하기 쉬운 신생아 각질세포 및/또는 계대각질세포를 활용했다¹.

그러나 반복적인 passaging을 거친 세포주는 in vivo state²와 거동과 형태가 크게 다릅니다. 생체 내 행동에 가장 가까운 것을 얻기 위해 생물학적 관련성을 극대화하기 위해 계대 0 세포가 사용됩니다. 각질세포 집단에서는 살아있는 세포 이미징을 통해 관찰할 수 있는 분열 행동에 뚜렷한 차이가 있기 때문에 분류나 표지 없이 줄기세포와 투여된 전구세포를 구별할 수 있습니다³.

우리는 각질 세포 증식 역학을 연구하기 위해 라이브 셀 이미징을 활용합니다. 유사한 접근법을 사용하여 각질세포4와 공동배양한 피부 흑색종 세포의 운동^{성, 스크래치} 분석법⁵의 부착 세포 이동, ROCK 억제제가 각질세포 증식에 미치는 영향⁶을 연구했습니다. 이 프로토콜은 살아있는 세포 이미징에 의한 계통 추적을 용이하게 하기 위해 세포를 배양하기 위해 특별히 설계되었지만, 다른 목적에 맞게 조정될 수도 있습니다.

이 프로토콜은 생세포 이미징을 위한 계대 0 각질세포의 분리를 간략하게 설명하고, 발생할 수 있는 합병증에 대해 논의하며, 프로토콜 변경이 필요할 수 있는 고려 사항을 제공합니다(그림 1).

인체 조직을 사용하려면 기관의 인간 연구 위원회(Committee on Human Research)의 승인이 필요합니다. 연구를 위한 인간 샘플은 종종 상업적 출처(예: ATCC, Lifeline cell technology 및 Zen-Bio)에서 얻습니다. 본 연구는 수술 시 폐기된 조직 또는 연구 목적으로 특별히 채취한 피부 생검 샘플을 사용합니다. 이러한 상황에서는 서로 다른 승인 및 동의 절차가 필요합니다. 모든 조직은 UCSF 인체 연구 위원회(UCSF Committee on Human Research)의 승인을 받은 후 획득되며, 서면 동의서를 활용하고 헬싱키 선언의 원칙에 따라 획득됩니다.

1. 진피에서 표피의 별거

1. 연구에 인체 조직을 사용하기 위해 적절한 승인을 받았는지 확인합니다.
2. 피부 샘플을 얻어 얼음 팩과 함께 단열 용기에 넣어 운반합니다. 샘플을 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신의 5배 농도가 포함된 수집 매체에 넣습니다.
   알림: 필요한 수량은 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 우리의 경험에 따르면,^cm2 당 약 1,000,000개의 각질 세포가 성인 및 노화 피부에서 얻어집니다. 그러나 이는 샘플마다 크게 다를 수 있습니다.
   1. 세포 배양 배지에 신생아 포피를 배치하고 세포 사멸을 최소화하기 위해 포경수술 후 48시간 이내에 각질세포 분리 절차를 시작합니다. 처리할 때까지 조직을 4°C에서 보관하십시오. 성체 및 노화된 샘플의 처리는 일반적으로 채취 후 몇 시간 이내에 시작됩니다.
3. 섭취, 점막 또는 경피적 노출로 질병을 유발하는 병원체와 함께 작업하도록 설계된 BS2 수준 장비가 있는 생물 안전 캐비닛에 대한 액세스^{권한 얻기 7}. 생물 안전 캐비닛이 최소 15분 동안 UV 멸균되고 사용하기 전에 모든 표면에 70% 알코올이 분사되었는지 확인하십시오.
4. 장갑을 끼고 수집 용기에 70% 알코올을 분사한 다음 용기를 배기 후드에 넣습니다. 조직 아래에 냉각 패드를 놓아 실온으로 가열되는 것을 방지하고 무결성을 유지합니다. 조직이 매우 크면 처리를 위해 일부를 잘라내고 나머지는 채취 용기에서 촉촉하게 유지하십시오.
   참고: 많은 노화된 표본이 수술로 인한 큰 복부 또는 유방 피부이기 때문에 조직을 절단하고 처리하는 데 시간이 걸립니다. 극심한 추위로 인해 패드가 얼 수 있으므로 티슈를 패드에 직접 올려 놓으면 안 됩니다. 대신 대리석 슬래브와 같은 중간 표면에 배치해야 합니다.
5. 후드에 100mm x 15mm 페트리 접시 2개와 멸균 #23 수술용 메스를 놓습니다.
6. 페트리 접시를 열고 각 접시의 내부 표면이 위쪽을 향하도록 캐비닛 표면에 놓습니다. 10% 클로르헥시딘 글루코네이트 10mL를 페트리 접시 중 하나에 추가합니다. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS, 5x)에 포함된 5x 페니실린/스트렙토마이신/암포테리신/겐타마이신 10mL를 다른 페트리 접시 반쪽 2개에 추가합니다( 재료 표 참조).
7. Dispase 단계를 위해 6웰 플레이트를 준비합니다. 신생아 조직의 경우, 웰당 3mL의 Dispase를 사용합니다. 노화된 조직 샘플의 경우 4mL를 사용합니다. 조직의 부피에 비해 부적절한 양의 Dispase를 사용하면 표피와 진피를 분리하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.
8. 메스를 사용하여 조직을 더 작은 조각으로 잘라 Dispase가 더 잘 침투할 수 있도록 합니다. Dispase는 조직 가장자리에서 최대 5mm까지만 침투하므로 0.5-1cm 너비의 긴 조직 스트립을 자릅니다. 충분히 작게 자르지 않으면 진피에서 표피가 분리되지 않습니다.
   1. 두꺼운 조직을 더 작은 조각으로 자릅니다. 신생아 포피를 3-4개(~5mm x 7mm)로 자릅니다. Dispase의 웰당 최대 2개의 전체 포피를 사용하십시오. 표재성 복부 피판은 훨씬 더 얇은 경향이 있으며 피하 조직이 거의 또는 전혀 없으므로 더 긴 (~ 5mm x 15mm 스트립)으로 자릅니다.
   2. Dispase의 웰당 최대 4개의 스트립을 놓습니다. 채취한 조직에 피하 지방이 많이 붙어 있는 경우, Dispase가 조직을 완전히 관통할 수 있도록 피하 조직을 잘라냅니다. 조직을 너무 작게 자르면 표피를 벗겨내는 동안 어느 쪽이 표피이고 어느 쪽이 진피인지 결정하기 위해 해부 현미경이 필요할 수 있습니다. 피부의 잘못된 쪽을 당기면 추가적인 조직 외상이 발생할 수 있습니다.
9. 10% 클로르헥시딘 글루코네이트를 함유한 1.6단계에서 준비한 첫 번째 페트리 접시에 조직 표피 면을 아래로 향하게 놓고 10-20초 동안 조직 표피 면을 아래로 옮기고 HBSS와 함께 5x 페니실린/스트렙토마이신/암포테리신(PSA)을 함유한 두 번째 페트리 접시에 넣고 10-20초 동안 교반합니다. 조직 표피 쪽을 HBSS와 함께 5x PSA를 다시 포함하는 세 번째 페트리 접시로 옮기고 10초 더 교반합니다. 동일한 용액으로 여러 샘플을 처리하는 것은 허용됩니다.
10. 조직 표피 면을 1.7단계에서 준비한 6-well Dispase plate로 아래로 옮깁니다.
    참고: 우리는 우리의 규칙에 따라 표피를 아래로 향하게 하는 것이 좋습니다. 다른 프로토콜은 진피 다운을 권장합니다⁸. 모든 디스플레이가 동일하게 효과적이지는 않습니다. 노화된 피부에서 표피를 벗겨내는 것은 특정 제품에서 제조업체가 권장하는 수준의 최대 4배까지의 농도에서도 어려운 것으로 나타났습니다. 이로 인해 시간과 표본이 손실되었습니다. 기업은 Dispase에 대해 표준화되지 않은 단위를 사용하므로 브랜드 간의 농도가 어떻게 다른지 식별하기가 어렵습니다. 이러한 문제로 인해 재료 표에 나열된 Dispase 브랜드 중 하나를 사용하는 것이 좋습니다.
11. Dispase 및 샘플이 포함된 6웰 플레이트에 라벨을 붙이고 4°C로 옮깁니다. 신생아 샘플은 Dispase에서 16-18시간 동안 배양하고 성인/노화 샘플은 24시간 동안 배양합니다.
    참고: 샘플에 사용할 수 있는 대체 2시간 프로토콜이 있으며, 여기서 샘플을 37°C의 Dispase에 2시간 동안 배치한 다음 표피를 벗깁니다. 불행히도 이것이 항상 작동하는 것은 아니며 배양 후 조직의 무결성이 손상되어 표본을 잃을 수 있습니다. 가능하면 하룻밤 배양을 선호합니다.

2. 각질 세포의 분리

1. 다음 단계를 시작하기 20분 전에 0.05% 트립신-EDTA(또는 TrypLE), 트립신 중화 용액 및 각질 세포 배지를 37°C 수조에 넣습니다.
2. 6 ° C에서 4 웰 플레이트를 제거하고 70 % 에탄올을 뿌린 다음 준비된 생물 안전 캐비닛에 넣습니다 (1.3 단계 참조).
3. 멸균 톱니 겸자와 톱니가 없는 겸자를 50mL의 70% 에탄올이 들어 있는 20mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 처음에 후드 밖에 있는 경우 후드에 넣기 전에 70% 에탄올을 집게로 분사하십시오.
4. 화학적으로 멸균된 겸자를 사용하여 조직 조각을 잡고 멸균 표면 표피 면이 위로 향하게 놓습니다(페트리 접시 또는 6웰 플레이트의 위쪽 절반 내부 사용). 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 톱니가 있는 집게로 조직의 진피 부분을 잡고 동시에 톱니가 없는 집게로 표피를 단단히 잡고 가장자리에서 가장자리로 잡아당깁니다. 한 조각으로 부드럽게 벗겨져야 합니다.
5. 15mL 원뿔형 튜브의 입술 안쪽에 표피를 놓습니다. 각 15mL 원뿔형 튜브에는 최대 2개의 포피의 표피가 있어야 합니다.
   1. 효율적으로 작업하십시오. 조직이 마르면 수율이 저하됩니다. 원두엽이 조직을 적절하게 관통하지 못하면 표피를 벗겨내는 데 어려움이 있을 수 있습니다. 이 경우 기저 진피에서 표피를 잡아당기거나 긁어냅니다. 이것은 또한 훨씬 더 낮은 수율을 초래하므로 권장되지 않습니다.
6. 15mL 원뿔형 튜브에 0.05% 트립신-EDTA 4mL를 추가한 다음 튜브를 닫고 뒤집어 모든 표피가 트립신에 매달려 있고 튜브/뚜껑 측면에 달라붙지 않도록 합니다. 37°C의 수조에 10분 동안 둡니다. 2분마다 손으로 세포를 교반합니다.
   참고: 10분 이상 트립시나이징하면 세포 수율이 낮아질 수 있습니다. 또한 세포 표면 단백질의 무결성이 우려되는 경우 TrypLE는 절단 부위에 더 특이적이어서 세포 손상이 적고 Trypsin-EDTA⁹에 비해 표면 항원 발현을 크게 감소시키지 않는 것으로 나타났으므로 사용하십시오. 또한 수조는 일반적인 오염원이므로 정기적으로 청소해야 합니다. aquaguard-2 용액이 포함된 탈이온수로 정기적으로 물을 교체하십시오.
7. 생물 안전 작업대에 50mL 원뿔형 튜브를 놓습니다. 뚜껑의 나사를 풀고 원뿔형 튜브의 입구에 100μm 셀 스트레이너를 놓습니다.
8. 소화된 샘플이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브를 수조에서 제거하고 완전히 건조시킨 다음 생물 안전 캐비닛에 다시 넣기 전에 70% 알코올을 스프레이합니다. 원뿔형 튜브를 흄 후드 표면에 3번 두드린 다음 6번 뒤집습니다. 태핑-반전 주기를 3회 반복합니다.
9. 트립신 중화 용액 6mL를 원뿔형 튜브에 추가합니다. 2.7단계에서 Cell Strainer를 통해 50mL 코니컬 튜브에 붓습니다.
10. 샘플이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브를 5mL의 트립신 중화 용액(TNS)으로 헹굽니다. 세포 여과기를 통해 50mL 원뿔형 튜브에 붓습니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기
11. 즉시 원심분리기에서 제거하고 상층액을 피펫팅하여 배지로의 세포 손실을 방지합니다. 펠릿에만 소량의 액체가 남아 있어야 합니다. 더 작은 조직 샘플에서 펠릿을 보기 어려울 수 있습니다.
    참고: 상등액에는 트립신이 존재하므로 펠릿을 잃지 않고 가능한 한 많이 제거하는 것이 가장 좋습니다.
12. 각질세포 pellet을 2mL의 각질세포 배지에 재현탁합니다.
    참고: 여기에는 두 가지 고려 사항이 있습니다. 먼저 사용할 미디어입니다. 이를 위해 콜라겐이 없는 무혈청 배지를 사용하는 것이 좋습니다. 역사적으로 각질세포 배양의 표준은 섬유아세포 공급층(3T3-J2S)에 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium) +10% 소태아혈청(FBS) +Ham의 F-12였습니다¹⁰. 그러나 무혈청 배지의 출현과 콜라겐의 가용성으로 인해 여러 가지 다른 가능성이 여전히 실행 가능합니다(논의 참조)¹¹. 두 번째 고려 사항은 배양 배지에서 항생제를 사용하는 것이 살아있는 세포 이미징 응용 분야에 적합한지 여부입니다. 이는 이미징 시간, 지속 시간 및 이미징 시스템에 대한 경험에 따라 달라집니다. 군집은 공유 이미징 시스템을 사용하여 여러 주에 걸쳐 이미지화되며, 배양에 대한 잠재적인 영향에도 불구하고 항생제를 사용하는 것이 선호되는 접근 방식입니다(논의 참조). 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B 및 겐타마이신 함유 각질세포 배지는 재현탁 중에 사용되며, 이후 초기 배지 변경 후 페니실린/스트렙토마이신 함유 배지로 전환합니다. 이 방법은 확장된 라이브 셀 이미징 중에 오염을 효과적으로 방지했습니다.
13. 세포를 세고 플레이트를 파종합니다(파종 밀도 선택에 대한 설명은 토론 참조). 균일한 파종 분포를 보장하기 위해, 도금하기 전에, 플레이트팅할 배지의 총량에 각질세포 세포를 재현탁합니다. 반전으로 부드럽게 교반한 후 1-2초 동안 가볍게 소용돌이치고 플레이트에 담습니다. 그런 다음 인큐베이터에서 마이크로플레이트를 십자형 패턴(위-아래, 왼쪽-오른쪽)으로 3번 움직입니다.
14. 24시간 후, 플레이트를 라이브 셀 이미징 시스템의 인큐베이터에 놓습니다. 20분마다 촬영한 이미지로 10배로 라이브 셀 이미징을 수행합니다. 샘플을 37°C 및 5% CO₂ 로 현미경에 부착된 인큐베이터에 넣습니다.

이 방법에서 조작될 수 있는 여러 변수가 궁극적으로 다양한 결과를 낳는다는 점을 감안할 때, 여기에서는 일반적인 실수와 그에 따른 결과를 간략하게 설명하고 예시적인 결과와 그 이면의 상황을 제공합니다.

모든 세포 배양 기술과 마찬가지로 오염이 발생할 수 있습니다(보충 동영상 1). 신중한 멸균 기술과 함께, 특히 장기간 배양하?...

여기에서는 생세포 이미징을 목적으로 인간 각질세포의 1차 배양 방법을 자세히 설명했습니다. 이 방법은 저밀도 도금 및 장기 배양을 사용하여 기존 세포 배양 기술을 조정하여 성공적인 라이브 셀 이미징 연구를 가능하게 합니다. 이 세포 유형의 해리를 위해 선호되는 방법은 2단계 효소 분해를 포함하며, 이는 각질세포를 생성하는 것으로 나타났으며, 그 중 3%-4%는 집?...

저자는 공개할 내용이 없습니다.

각질 세포를 배양하는 방법을 가르쳐 주신 T. Richard Parenteau, MD/PhD, Alexandra Charruyer, PharmD/PhD에게 특별한 감사를 드립니다. 각질 세포를 분리할 수 있는 샘플을 제공해 주신 Merisa Piper MD에게 감사드립니다. 마지막으로 실험을 완료할 수 있도록 라이브 셀 이미징 시스템에 액세스할 수 있도록 해준 Michael Rosenblum 박사에게 감사드립니다.