Geração de culturas primárias para imagens de células vivas de queratinócitos

Este protocolo descreve a cultura de queratinócitos recém-obtidos (passagem 0) para uso em imagens de células vivas.

O rastreamento de células-tronco e o comportamento progenitor comprometido no nível de uma única célula na pele humana tem sido um desafio tanto in vivo quanto in vitro. A imagem de células vivas permitiu avanços significativos na capacidade de identificar diferenças entre as células-tronco de queratinócitos e o comportamento progenitor comprometido. A imagem de células vivas é um método em evolução e um tanto desafiador para estudar o comportamento dos queratinócitos in vitro. Este protocolo foi desenvolvido para cultivar queratinócitos em baixa densidade de semeadura, permitindo fotografia de lapso de tempo de longo prazo e monitoramento do comportamento celular individual. Os queratinócitos da passagem 0 são cultivados em densidade clonal, e a fotografia de lapso de tempo permite a documentação de divisões celulares individuais e o tempo de sua ocorrência. Para máxima relevância biológica, os queratinócitos humanos recém-isolados são colocados in vitro. Essa abordagem se concentra na proliferação. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para uso em outras aplicações de imagem de células vivas que medem o comportamento celular individual, como medir a migração celular, cicatrização de feridas e motilidade.

O objetivo deste protocolo é fornecer a capacidade de rastrear queratinócitos individuais em cultura por um período relativamente longo (várias semanas) possibilitado por baixas densidades de semeadura e fotografia de lapso de tempo. A imagem de células vivas em baixa densidade oferece aos investigadores a oportunidade de visualizar o comportamento celular in vitro em um único nível de célula. Embora não seja possível na cultura celular convencional, a imagem de células vivas possibilita o desenvolvimento de árvores de linhagem em tempo real, sem o uso de marcação, a partir da qual se pode verificar informações sobre a cinética de divisão, como a duração do ciclo celular e a proporção de divisões de proliferação e diferenciação em uma colônia. Também permite o estudo da migração e motilidade celular. Pode ser tecnicamente desafiador, com aspectos que precisam de otimização, dependendo do tipo de célula e dos dados a serem capturados. Outros laboratórios utilizaram queratinócitos neonatais e / ou queratinócitos passados que são mais fáceis de cultivar¹.

No entanto, as linhagens celulares que sofrem passagens repetidas são significativamente diferentes em comportamento e morfologia de seu estado in vivo ². Para a maior relevância biológica, a fim de obter o comportamento mais próximo do in vivo , são utilizadas células de passagem 0. Em populações de queratinócitos, é possível distinguir entre a célula-tronco e o progenitor comprometido sem classificação ou rótulos, porque existem diferenças distintas no comportamento de divisão que podem ser observadas por meio de imagens de células vivas³.

Utilizamos imagens de células vivas para estudar a cinética de proliferação de queratinócitos. Uma abordagem semelhante tem sido usada para estudar a motilidade de células de melanoma cutâneo cocultivadas com queratinócitos⁴, migração celular aderente de ensaios de arranhões⁵ e como os inibidores de ROCK afetam a proliferação de queratinócitos⁶. Este protocolo é projetado especificamente para a cultura de células para facilitar o rastreamento da linhagem por imagens de células vivas, embora possa ser adaptado para outros fins.

Este protocolo descreve o isolamento de queratinócitos de passagem 0 para fins de imagem de células vivas, discute complicações que podem surgir e fornece considerações que podem exigir alterações no protocolo (Figura 1).

A aprovação do Comitê de Pesquisa Humana da instituição é necessária para o uso de tecido humano. Amostras humanas para pesquisa são frequentemente obtidas de fontes comerciais (por exemplo, ATCC, tecnologia de células Lifeline e Zen-Bio). Nossos estudos usam tecido descartado no momento das cirurgias ou amostras de biópsia de pele coletadas especificamente para fins de estudo. Essas situações exigem diferentes aprovações e procedimentos de consentimento. Todos os tecidos são obtidos após a aprovação do Comitê de Pesquisa Humana da UCSF, utilizando consentimento informado por escrito e seguindo os princípios da Declaração de Helsinque.

1. Separação da epiderme da derme

1. Garantir que as aprovações apropriadas sejam obtidas para usar tecido humano para o estudo.
2. Obtenha uma amostra de pele e transporte-a em um recipiente isolado com uma bolsa de gelo. Coloque a amostra em meio de coleta contendo concentração de 5x de penicilina, estreptomicina e anfotericina.
   NOTA: A quantidade necessária dependerá da aplicação. Em nossa experiência, aproximadamente 1.000.000 de queratinócitos por^cm2 são obtidos de pele adulta e envelhecida. No entanto, isso pode variar significativamente para cada amostra.
   1. Coloque os prepúcios neonatais em meios de cultura de células e inicie o procedimento de isolamento de queratinócitos no máximo 48 h após a circuncisão para minimizar a morte celular. Conservar o tecido a 4 °C até ao processamento. O processamento de amostras adultas e envelhecidas geralmente começa algumas horas após a coleta.
3. Obtenha acesso a um gabinete de biossegurança com equipamento de nível BS2 projetado para trabalhar com agentes que causam doenças por ingestão, membrana mucosa ou exposição percutânea⁷. Certifique-se de que o gabinete de biossegurança seja esterilizado por UV por pelo menos 15 min e que todas as superfícies sejam pulverizadas com álcool 70% antes do uso.
4. Coloque luvas, borrife o recipiente de coleta com álcool 70% e coloque o recipiente na hotte. Coloque uma almofada de resfriamento sob o tecido para evitar que ele aqueça até a temperatura ambiente e para manter sua integridade. Se o tecido for extremamente grande, corte uma porção para processamento e mantenha o restante úmido no recipiente de coleta.
   NOTA: Como muitos dos espécimes envelhecidos são grandes abdominais ou de pele mamária de cirurgias, leva tempo para cortar e processar o tecido. O lenço de papel nunca deve ser colocado diretamente sobre a almofada, pois o frio extremo pode fazer com que ela congele. Em vez disso, deve ser colocado em uma superfície intermediária, como uma laje de mármore.
5. Coloque duas placas de Petri de 100 mm x 15 mm e um bisturi cirúrgico estéril #23 no exaustor.
6. Abra as placas de Petri e coloque-as na superfície do armário de forma que as superfícies internas de cada placa fiquem voltadas para cima. Adicione 10 mL de gluconato de clorexidina a 10% a uma das placas de Petri. Adicione 10 mL de 5x penicilina / estreptomicina / anfotericina / gentamicina na solução salina balanceada de Hank (HBSS; 5x) a 2 outras metades da placa de Petri (consulte a Tabela de Materiais).
7. Prepare uma placa de 6 poços para a etapa Dispase. Para tecido neonatal, use 3 mL de Dispase por poço. Para amostras de tecido envelhecido, use 4 mL. O uso de quantidades inadequadas de Dispase para o volume de tecido pode resultar em dificuldade em separar a epiderme da derme.
8. Use um bisturi para cortar o tecido em pedaços menores para que ele seja melhor penetrado pelo Dispase. Dispase penetra apenas até 5 mm das bordas do tecido, então corte longas tiras de tecido com 0,5-1 cm de largura. Se não for cortado pequeno o suficiente, a separação da epiderme da derme não ocorrerá.
   1. Corte o tecido mais grosso em pedaços menores. Corte os prepúcios neonatais em 3 ou 4 pedaços (~5 mm x 7 mm). Use no máximo dois prepúcios inteiros por poço de Dispase. Os retalhos abdominais superficiais tendem a ser muito mais finos, com pouco ou nenhum tecido subcutâneo, corte-os em tiras mais longas (~ 5 mm x 15 mm).
   2. Coloque no máximo quatro tiras por poço de Dispase. Se o tecido obtido tiver muita gordura subcutânea aderida, corte o tecido subcutâneo para ajudar Dispase a penetrar totalmente no tecido. Se o tecido for cortado muito pequeno, um microscópio de dissecação pode ser necessário para determinar qual lado é epidérmico e qual lado é dérmico ao descascar a epiderme. Puxar o lado errado da pele pode resultar em trauma tecidual adicional.
9. Coloque o lado epidérmico do tecido voltado para baixo na primeira placa de Petri preparada na etapa 1.6, contendo 10% de gluconato de clorexidina, por 10-20 s Em seguida, transfira o lado epidérmico do tecido para a segunda placa de Petri, contendo 5x penicilina / estreptomicina / anfotericina (PSA) com HBSS, e agite por 10-20 s. Transfira o lado epidérmico do tecido para a terceira placa de Petri, novamente contendo 5x PSA com HBSS, e agite por mais 10 s. O processamento de várias amostras com a mesma solução é aceitável.
10. Transfira o lado epidérmico do tecido para baixo para a placa Dispase de 6 poços preparada na etapa 1.7.
    NOTA: Recomendamos o lado epidérmico para baixo por nossa convenção. Outros protocolos recomendam derme para baixo⁸. Nem todo Dispase é igualmente eficaz. A descamação da epiderme da pele envelhecida provou ser um desafio com certos produtos, mesmo em concentrações de até 4x o nível recomendado pelo fabricante. Isso resultou na perda de tempo e espécimes. As empresas usam unidades não padronizadas para Dispase, dificultando a identificação de como as concentrações diferem entre as marcas. Devido a esses desafios, o uso de uma das marcas Dispase listadas na Tabela de Materiais é altamente recomendado.
11. Rotular a placa de 6 poços contendo o Dispase e as amostras e transferir para 4 °C. Incubar amostras neonatais por 16-18 h em Dispase e amostras de adultos/idosos por 24 h.
    NOTA: Existe um protocolo alternativo de 2 h que pode ser usado para amostras, onde a amostra é colocada em Dispase a 37 ° C por 2 h e, em seguida, a epiderme é descascada. Infelizmente, isso nem sempre funciona e a integridade do tecido pode ser comprometida após a incubação, resultando em uma amostra perdida. A incubação noturna é preferida sempre que possível.

2. Isolamento de queratinócitos

1. Coloque 0,05% de tripsina-EDTA (ou TrypLE), solução neutralizadora de tripsina e meio de queratinócitos em banho-maria a 37 °C 20 minutos antes de iniciar o próximo conjunto de etapas
2. Remova uma placa de 6 poços de 4 °C, borrife-a com etanol a 70% e coloque-a em um gabinete de biossegurança preparado (consulte a etapa 1.3).
3. Coloque a pinça dentada estéril e a pinça não dentada em um tubo cônico de 50 mL contendo 20 mL de etanol a 70%. Se estiver fora do capô inicialmente, pulverize uma pinça com etanol 70% antes de colocá-lo no capô.
4. Usando uma pinça quimicamente esterilizada, segure um pedaço de tecido e coloque-o em uma superfície estéril com o lado epidérmico voltado para cima (use uma placa de Petri ou o interior da metade superior da placa de 6 poços). Segure a porção dérmica do tecido com pinça dentada usando a mão não dominante e, simultaneamente, segure firmemente a epiderme com a pinça não dentada e puxe-a de ponta a ponta. Deve sair suavemente como uma peça.
5. Coloque a epiderme na parte interna do lábio de um tubo cônico de 15 mL. Cada tubo cônico de 15 mL deve ter uma epiderme de no máximo dois prepúcios.
   1. Trabalhe com eficiência; Se o tecido secar, o rendimento será comprometido. Se o Dispase não penetrar adequadamente no tecido, pode haver dificuldade em descascar a epiderme. Nesse caso, puxe/raspe a epiderme da derme subjacente. Isso também resulta em um rendimento muito menor e não é recomendado.
6. Adicione 4 mL de tripsina-EDTA a 0,05% no tubo cônico de 15 mL, feche e inverta o tubo, garantindo que toda a epiderme fique suspensa na tripsina e não grude na lateral do tubo/tampa. Colocar em banho-maria a 37 °C durante 10 min. Agite as células a cada 2 minutos com a mão.
   NOTA: A tripsinização por mais de 10 min pode resultar em um menor rendimento celular. Além disso, se a integridade das proteínas da superfície celular for uma preocupação, use TrypLE, pois é mais específico para seu local de clivagem, resultando em menos danos às células e demonstrou não diminuir significativamente a expressão do antígeno de superfície em comparação com a tripsina-EDTA⁹. Além disso, o banho-maria é uma fonte comum de contaminação, portanto, certifique-se de limpá-lo regularmente. Troque a água regularmente com água deionizada contendo solução de aquaguard-2.
7. Coloque um tubo cônico de 50 mL no gabinete de biossegurança. Desaperte a tampa e coloque um filtro de células de 100 μm na abertura do tubo cônico.
8. Remova o tubo cônico de 15 mL contendo a amostra digerida do banho-maria, seque bem e borrife com álcool 70% antes de colocá-lo de volta no gabinete de biossegurança. Bata o tubo cônico 3x contra a superfície da hotte e inverta 6x. Repita o ciclo de inversão de rosqueamento 3x.
9. Adicione 6 mL de solução neutralizadora de tripsina no tubo cônico. Despeje através do filtro de células no tubo cônico de 50 mL da etapa 2.7.
10. Enxágue o tubo cônico de 15 mL contendo a amostra com 5 mL de soluções neutralizadoras de tripsina (TNS). Despeje através de um filtro de células no tubo cônico de 50 mL. Centrifugue a 300 x g por 5 min.
11. Retirar imediatamente da centrifugadora e pipetar o sobrenadante para evitar a perda de células para o meio. Deve haver apenas o pellet deixado com uma pequena coleção de fluido. Pode ser difícil ver o pellet de amostras de tecido menores.
    NOTA: Há tripsina presente no sobrenadante, por isso é melhor remover o máximo possível sem perder o pellet.
12. Ressuspenda o pellet de queratinócitos em 2 mL de meio de queratinócitos.
    NOTA: Há duas considerações aqui. Primeiro, qual mídia usar. Para isso, recomenda-se um meio sem soro sem colágeno. Historicamente, o padrão para cultura de células de queratinócitos tem sido o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de soro fetal bovino (FBS) + F-12 de Ham em uma camada alimentadora de fibroblastos (3t3-J2s) ¹⁰ . No entanto, com o advento dos meios sem soro e a disponibilidade de colágeno, várias outras possibilidades permanecem viáveis (ver discussão)¹¹. A segunda consideração é se o uso de antibióticos no meio de cultura é apropriado para aplicação em imagens de células vivas. Isso dependerá do tempo de imagem, duração e experiência com o sistema de imagem. As colônias são fotografadas ao longo de várias semanas usando um sistema de imagem compartilhado, tornando o uso de antibióticos uma abordagem preferida, apesar do impacto potencial nas culturas (ver discussão). Penicilina, estreptomicina, anfotericina B e meio de queratinócitos contendo gentamicina são usados durante a ressuspensão, seguida por uma mudança para meio contendo penicilina/estreptomicina após a troca inicial de meio. Este método evitou efetivamente a contaminação durante imagens estendidas de células vivas.
13. Conte as células e semeie a placa (consulte a discussão para comentários sobre a seleção da densidade de semeadura). Para garantir uma distribuição uniforme da semeadura, antes do plaqueamento, ressuspenda as células dos queratinócitos na quantidade total de meio a ser plaqueado. Após agitação suave por inversão, vórtice levemente por 1-2 s e placa. Em seguida, mova a microplaca em um padrão cruzado (para cima e para baixo, esquerda-direita) 3x na incubadora.
14. Após 24 h, coloque a placa na incubadora do sistema de imagem de células vivas. Realize imagens de células vivas em 10x com imagens tiradas a cada 20 minutos. Colocar as amostras a 37 °C e 5% de CO₂ na incubadora ligada ao microscópio.

Dadas as múltiplas variáveis que podem ser manipuladas neste método que, em última análise, resultam em uma variedade de resultados, aqui descrevemos erros comuns e seus resultados resultantes, bem como fornecemos resultados exemplares e as circunstâncias por trás deles.

Como em qualquer técnica de cultura de células, a contaminação é uma possibilidade (Vídeo Suplementar 1). Juntamente com técnicas estéreis cuidadosas, considere...

Aqui, detalhamos um método para a cultura primária de queratinócitos humanos para fins de imagem de células vivas. Este método adapta as técnicas de cultura de células existentes usando plaqueamento de baixa densidade e cultura de longo prazo para permitir estudos de imagem de células vivas bem-sucedidos. O método preferido para a dissociação desse tipo de célula envolve uma digestão enzimática em duas etapas, que demonstrou resultar em queratinócitos, dos quais 3% a 4% s?...

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos especiais a T. Richard Parenteau, MD / PhD, e Alexandra Charruyer, PharmD / PhD, por me ensinar a cultivar queratinócitos. Obrigado a Merisa Piper MD por nos fornecer amostras para isolar queratinócitos. Agradecimentos finais a Michael Rosenblum MD por nos permitir acesso ao seu sistema de imagem de células vivas para concluir os experimentos.