ケラチノサイト生細胞イメージングのための初代培養物の生成

このプロトコールは、生細胞イメージングで使用するための新たに得られた(継代0)ケラチノサイトの培養を概説しています。

ヒトの皮膚における幹細胞とコミットされた前駆細胞の挙動を単一細胞レベルで追跡することは、 in vivo と in vitroの両方で困難でした。生細胞イメージングにより、ケラチノサイト幹細胞と確定した前駆細胞の挙動との違いを特定する能力が大幅に向上しました。生細胞イメージングは、 in vitroでケラチノサイトの挙動を研究するための進化途上の、やや挑戦的な方法です。このプロトコルは、ケラチノサイトを低播種密度で培養するために開発されたもので、比較的長期間のタイムラプス撮影と個々の細胞挙動のモニタリングを可能にします。継代0のケラチノサイトはクローン密度で増殖し、タイムラプス撮影により個々の細胞分裂とその発生時間を記録することができます。生物学的関連性を最大限に高めるために、新たに単離されたヒトケラチノサイトを in vitroで配置します。このアプローチは、増殖に焦点を当てています。しかし、このプロトコルは、細胞移動、創傷治癒、および運動性の測定など、個々の細胞の挙動を測定する他のライブセルイメージングアプリケーションでの使用に適合させることができます。

このプロトコルの目標は、低播種密度とタイムラプス写真により、比較的長い期間(数週間)にわたって培養中の個々のケラチノサイトを追跡する能力を提供することです。低密度でのライブセルイメージングにより、研究者は in vitro で細胞の挙動を単一細胞レベルで視覚化する機会を得ることができます。従来の細胞培養では不可能でしたが、ライブセルイメージングでは、標識を使用せずにリアルタイムで系統樹を作成することができ、細胞周期の持続時間やコロニー内の増殖・分化分裂の割合など、分裂速度に関する情報を確認することができます。また、細胞の遊走と運動性の研究も可能にします。これは技術的に困難な場合があり、セルの種類やキャプチャするデータによっては最適化が必要な側面があります。他の研究室では、成長が容易な新生児ケラチノサイトおよび/または継代ケラチノサイトを利用しています¹。

しかし、継代を繰り返す細胞株は、 in vivo の状態とは挙動や形態が大きく異なる²。 in vivo の挙動に最も近いものを得るために、最大の生物学的関連性を得るために、継代0細胞が利用される。ケラチノサイト集団では、生^{細胞イメージング3}を通じて観察できる分裂挙動に明確な違いがあるため、選別や標識なしで幹細胞とコミットされた前駆細胞を区別することが可能です。

私たちは、ライブセルイメージングを利用して、ケラチノサイトの増殖速度を研究しています。同様のアプローチを用いて、ケラチノサイト^4と共培養した皮膚黒色腫細胞の運動性、スクラッチアッセイ⁵の接着性細胞移動5、およびROCK阻害剤がケラチノサイト増殖6にどのように影響するかを研究し^{ています。}このプロトコルは、生細胞イメージングによる系統追跡を容易にするために細胞を培養するために特別に設計されていますが、他の目的にも適合させることができます。

このプロトコルでは、生細胞イメージングを目的とした継代0ケラチノサイトの単離を概説し、発生する可能性のある合併症について説明し、プロトコルの変更が必要になる可能性のある考慮事項を提供します(図1)。

ヒト組織の使用には、機関のヒト研究委員会からの承認が必要です。研究用のヒトサンプルは、多くの場合、市販の供給源(ATCC、Lifeline細胞技術、Zen-Bioなど)から入手されます。私たちの研究では、手術時に廃棄された組織や、研究目的で特別に採取された皮膚生検サンプルを使用します。このような状況では、異なる承認と同意手続きが必要です。すべての組織は、書面によるインフォームドコンセントを利用し、ヘルシンキ宣言の信条に従って、UCSFヒト研究委員会からの承認後に取得されます。

1.真皮からの表皮の分離

1. 研究にヒト組織を使用するための適切な承認が得られていることを確認してください。
2. 皮膚サンプルを採取し、保冷剤付きの断熱容器に入れて輸送します。サンプルを、5倍濃度のペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンを含む収集培地に入れます。
   注:必要な数量はアプリケーションによって異なります。私たちの経験では、cm² あたり約1,000,000個のケラチノサイトが成人および老化した皮膚から得られます。ただし、これはサンプルごとに大きく異なる場合があります。
   1. 新生児包皮を細胞培養培地に入れ、割礼後48時間以内にケラチノサイト単離手順を開始して、細胞死を最小限に抑えます。処理までティッシュを4°Cで保存します。成人サンプルと老化サンプルの処理は、通常、収集から数時間以内に開始されます。
3. 摂取、粘膜、または経^皮的曝露によって病気を引き起こす薬剤を扱うために設計されたBS2レベルの機器を備えたバイオセーフティキャビネットへのアクセスを取得します7。バイオセーフティキャビネットが少なくとも15分間UV滅菌されていること、および使用前にすべての表面に70%アルコールが噴霧されていることを確認してください。
4. 手袋を着用し、収集容器にアルコール70%をスプレーし、容器をドラフトに入れます。ティッシュの下に冷却パッドを置き、ティッシュが室温まで温まるのを防ぎ、その完全性を維持します。ティッシュが極端に大きい場合は、一部を切り取って処理し、残りは収集容器で湿らせておきます。
   注:老朽化した標本の多くは手術による大きな腹部または乳房の皮膚であるため、組織の切断と処理には時間がかかります。ティッシュは、極度の寒さで凍結する可能性があるため、パッドに直接置かないでください。代わりに、大理石のスラブなどの中間面に配置する必要があります。
5. フードに100 mm x 15 mmのペトリ皿2枚と滅菌済みの#23外科用メスを入れます。
6. ペトリ皿を開き、各皿の内面が上を向くようにキャビネットの表面に置きます。10 mLの10%グルコン酸クロルヘキシジンをペトリ皿の1つに加えます。.ハンク平衡塩溶液(HBSS;5x)中の5倍ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシン/ゲンタマイシン10mLを他の2つのシャーレ( 材料の表を参照)に加えます。.
7. ディスパーゼステップ用の6ウェルプレートを準備します。新生児組織には、ウェルあたり3 mLのディスパーゼを使用します。老化組織サンプルの場合は、4 mLを使用します。組織の体積に対して不適切な量のディスパーゼを使用すると、表皮と真皮を分離するのが難しくなる可能性があります。
8. メスを使用して組織を小さく切り、ディスパーゼによる浸透性を高めます。ディスパーゼは組織の端から最大5 mmまでしか浸透しないため、幅0.5〜1 cmの長いティッシュストリップをカットします。十分に小さく切らないと、真皮から表皮が分離することはありません。
   1. 厚い組織を小さく切ります。新生児包皮を3つまたは4つ(~5 mm x 7 mm)に切ります。ディスパーゼのウェルごとに最大2つの包皮全体を使用します。表在性腹部フラップははるかに薄くなる傾向があり、皮下組織は最小限またはまったくなく、これらを長め(~5 mm x 15 mmのストリップ)に切ります。
   2. ディスパーゼのウェルごとに最大4つのストリップを配置します。得られた組織に皮下脂肪がたくさん付着している場合は、皮下組織を切り取り、ディスパーズが組織に完全に浸透するのを助けます。組織が小さく切り取られすぎると、表皮を剥がしながら、どちらが表皮でどちらが真皮であるかを判断するために、解剖顕微鏡が必要になる場合があります。皮膚の反対側を引っ張ると、追加の組織外傷を引き起こす可能性があります。
9. ステップ1.6で調製した、10%グルコン酸クロルヘキシジンを含む最初のペトリ皿に組織の表皮面を下にして置き、10〜20秒間次に、組織の表皮面を下にして、HBSSを含む5xペニシリン/ストレプトマイシン/アムホテリシン(PSA)を含む2番目のシャーレに移し、10〜20秒間攪拌します。組織の表皮側を下にして、再びHBSSを含む5x PSAを含む3番目のシャーレに移し、さらに10秒間攪拌します。同じ溶液で複数のサンプルを処理することは許容されます。
10. ステップ1.7で調製した6ウェルディスパーゼプレートに組織の表皮側を下にして移します。
    注:私たちのコンベンションでは、表皮面を下にして行うことをお勧めします。他のプロトコルでは、真^皮を8つ減らすことをお勧めします。すべてのディスパーゼが等しく有効であるわけではありません。老化した皮膚から表皮を剥がすことは、特定の製品では、メーカーが推奨するレベルの4倍までの濃度であっても困難であることが証明されました。その結果、時間と標本が失われました。企業はDispaseに標準化されていない単位を使用しているため、ブランド間で濃度がどのように異なるかを特定するのが困難です。これらの課題のため、 材料表 に記載されているDispaseブランドの1つを使用することを強くお勧めします。
11. ディスパーゼとサンプルを含む6ウェルプレートを標識し、4°Cに移します。 新生児サンプルをディスパーゼで16〜18時間インキュベートし、成人/老化サンプルを24時間インキュベートします。
    注:サンプルに使用できる別の2時間プロトコルがあり、サンプルを37°Cのディスパーゼに2時間置き、その後、表皮を剥離します。残念ながら、これは常に機能するわけではなく、インキュベーション後に組織の完全性が損なわれ、標本が失われる可能性があります。可能な限り一晩のインキュベーションが望ましいです。

2. ケラチノサイトの単離

1. 0.05%トリプシン-EDTA(またはTrypLE)、トリプシン中和液、およびケラチノサイト培地を37°Cのウォーターバスに20分置いてから、次のステップを開始します
2. 6ウェルプレートを4°Cから取り出し、70%エタノールを噴霧し、準備したバイオセーフティキャビネットに入れます(ステップ1.3を参照)。
3. 滅菌歯付き鉗子と歯なし鉗子を、20mLの70%エタノールを含む50mLの円錐形チューブに入れます。最初にフードの外側にある場合は、ボンネットに入れる前に70%エタノールで鉗子をスプレーダウンします。
4. 化学的に滅菌した鉗子を使用して、組織片をつかみ、滅菌表面の表皮面を上にして置きます(ペトリ皿または6ウェルプレートの上半分の内側を使用します)。利き手ではない方の手で歯付き鉗子で組織の真皮部分を押さえると同時に、歯のない鉗子で表皮をしっかりとつかみ、端から端まで引き抜きます。一枚としてスムーズに剥がれるはずです。
5. 表皮を15mLの円錐形チューブの唇の内側に置きます。.各15 mLの円錐管には、最大2つの包皮の表皮が必要です。
   1. 効率的に作業します。組織が乾燥すると、歩留まりが損なわれます。ディスパーゼが組織に適切に浸透しなかった場合、表皮を剥がすのが困難になる可能性があります。このような場合は、下にある真皮から表皮を引き抜く/削り取ります。これにより、歩留まりも大幅に低下するため、お勧めしません。
6. 15 mLの円錐管に0.05%トリプシンEDTAを4 mL加え、チューブを閉じて反転させ、すべての表皮がトリプシンに懸濁し、チューブ/蓋の側面に詰まらないようにします。37°Cのウォーターバスに10分間入れます。2分ごとに手で細胞を攪拌します。
   注:10分以上トリプシン化すると、細胞収量が低下する可能性があります。また、細胞表面タンパク質の完全性が懸念される場合は、切断部位により特異的であるため、細胞への損傷が少なく、Trypsin-EDTA⁹と比較して表面抗原発現を有意に減少させないことが示されています。さらに、ウォーターバスは一般的な汚染源であるため、定期的に清掃するようにしてください。aquaguard-2溶液を含む脱イオン水で定期的に水を交換してください。
7. 50 mLのコニカルチューブをバイオセーフティキャビネットに入れます。蓋を緩め、100 μmのセルストレーナーを円錐形チューブの開口部に置きます。
8. 消化されたサンプルが入った15 mLのコニカルチューブをウォーターバスから取り出し、完全に乾かし、70%アルコールをスプレーしてからバイオセーフティキャビネットに戻します。円錐形のチューブをドラフトの表面に3回軽くたたいてから、6回反転させます。タッピング反転サイクルを3回繰り返します。
9. 6 mLのトリプシン中和溶液をコニカルチューブに加えます。.ステップ2.7からセルストレーナーを通して50mLのコニカルチューブに注ぎます。
10. サンプルが入った15 mLのコニカルチューブを5 mLのトリプシン中和溶液(TNS)ですすいでください。細胞ストレーナーを通して50mLの円錐管に注ぎます。300 x g で5分間遠心分離します。
11. すぐに遠心分離機から取り出し、上清をピペットで動かして、細胞が培地に失われるのを防ぎます。ペレットだけが残っているはずです。そこには、少量の液体が溜まっています。小さな組織サンプルからペレットを見るのは難しい場合があります。
    注:上清にはトリプシンが含まれているため、ペレットを失わずにできるだけ除去するのが最善です。
12. ケラチノサイトペレットを2mLのケラチノサイト培地に再懸濁します。
    注: ここでは 2 つの考慮事項があります。まず、どのメディアを使用するか。この目的のために、コラーゲンを含まない無血清培地が推奨されます。歴史的に、ケラチノサイト細胞培養の標準は、線維芽細胞フィーダー層(3t3-J2s)10上のダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)+10%ウシ胎児血清(FBS)+ハムF-12であった¹⁰。しかし、無血清培地の出現とコラーゲンの利用可能性により、他の複数の可能性が依然として実行可能です(議論を参照)¹¹。2つ目の考慮事項は、培養液中の抗生物質の使用が生細胞イメージングアプリケーションに適しているかどうかです。これは、イメージング時間、期間、およびイメージングシステムの経験によって異なります。コロニーは、共有イメージングシステムを使用して数週間にわたってイメージングされるため、培養物に潜在的な影響を与えるにもかかわらず、抗生物質の使用が好ましいアプローチとなっています(ディスカッションを参照)。再懸濁時には、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンB、およびゲンタマイシン含有ケラチノサイト培地を使用し、最初の培地交換後にペニシリン/ストレプトマイシン含有培地に切り替えます。この方法は、長時間の生細胞イメージング中の汚染を効果的に防ぎました。
13. 細胞を数え、プレートに播種します(播種密度の選択に関するコメントについては、ディスカッションを参照してください)。播種分布を均一にするために、播種する前に、播種する培地の総量にケラチノサイト細胞を再懸濁します。反転による穏やかな撹拌後、1〜2秒間軽く渦巻き、プレート化します。次に、インキュベーター内でマイクロプレートを十字型(上下、左から右)に3回動かします。
14. 24時間後、プレートをライブセルイメージングシステムのインキュベーターに置きます。20分ごとに画像を撮影し、10倍でライブセルイメージングを行います。サンプルを37°C、5%_CO2 に顕微鏡に取り付けたインキュベーターに入れます。

この方法で操作される可能性のある複数の変数が最終的にさまざまな結果をもたらすことを考えると、ここでは、一般的な失敗とその結果について概説し、例示的な結果とその背後にある状況を提供します。

他の細胞培養技術と同様に、コンタミネーションの可能性があります(補足ビデオ1)。慎重な滅菌技術に加えて、特に長期間?...

ここでは、生細胞イメージングを目的としたヒトケラチノサイトの初代培養法について詳述しました。この方法は、低密度プレーティングと長期培養を使用した既存の細胞培養技術を適応させ、ライブセルイメージング研究を成功させます。この細胞型の解離のための好ましい方法は、2段階の酵素消化を含み、これはケラチノサイトをもたらすことが示されており?...

著者は何も開示していません。

ケラチノサイトの培養方法を教えてくれたT. Richard Parenteau, MD/PhDとAlexandra Charruyer, PharmD/PhDに感謝します。ケラチノサイトを分離するためのサンプルを提供してくれたMerisa Piper MDに感謝します。最後に、実験を完了するために彼のライブセルイメージングシステムへのアクセスを許可してくれたMichael Rosenblum医学博士に感謝します。