Génération de cultures primaires pour l’imagerie de cellules vivantes kératinocytes

Ce protocole décrit la culture de kératinocytes fraîchement obtenus (passage 0) pour une utilisation en imagerie de cellules vivantes.

Le suivi des cellules souches et du comportement des progéniteurs engagés au niveau de la cellule unique dans la peau humaine a été difficile à la fois in vivo et in vitro. L’imagerie des cellules vivantes a permis des progrès significatifs dans la capacité d’identifier les différences entre les cellules souches kératinocytaires et le comportement des progéniteurs engagés. L’imagerie de cellules vivantes est une méthode évolutive et quelque peu difficile pour étudier le comportement des kératinocytes in vitro. Ce protocole a été développé pour cultiver des kératinocytes à faible densité d’ensemencement, permettant une photographie en accéléré à relativement long terme et un suivi du comportement cellulaire individuel. Les kératinocytes de passage 0 sont cultivés à une densité clonale, et la photographie en accéléré permet de documenter les divisions cellulaires individuelles et le moment de leur apparition. Pour une pertinence biologique maximale, des kératinocytes humains fraîchement isolés sont placés in vitro. Cette approche est axée sur la prolifération. Cependant, ce protocole peut être adapté pour être utilisé dans d’autres applications d’imagerie de cellules vivantes mesurant le comportement des cellules individuelles, telles que la mesure de la migration cellulaire, de la cicatrisation des plaies et de la motilité.

L’objectif de ce protocole est de fournir la possibilité de suivre des kératinocytes individuels en culture sur une période relativement longue (plusieurs semaines) grâce à de faibles densités d’ensemencement et à la photographie en accéléré. L’imagerie de cellules vivantes à faible densité offre aux chercheurs la possibilité de visualiser le comportement cellulaire in vitro à un seul niveau cellulaire. Bien qu’elle ne soit pas possible dans la culture cellulaire conventionnelle, l’imagerie des cellules vivantes permet de développer des arbres de lignage en temps réel, sans utiliser de marquage, à partir desquels on peut obtenir des informations sur la cinétique de division, telles que la durée du cycle cellulaire et la proportion de divisions de prolifération et de différenciation dans une colonie. Il permet également d’étudier la migration et la motilité cellulaires. Cela peut être techniquement difficile, avec des aspects qui doivent être optimisés, en fonction du type de cellule et des données à capturer. D’autres laboratoires ont utilisé des kératinocytes néonatals et/ou des kératinocytes passés qui sont plus faciles à cultiver¹.

Cependant, les lignées cellulaires qui subissent des passages répétés ont un comportement et une morphologie significativement différents de leur état in vivo ². Pour la plus grande pertinence biologique afin d’obtenir le comportement le plus proche in vivo , des cellules de passage 0 sont utilisées. Dans les populations de kératinocytes, il est possible de faire la distinction entre la cellule souche et le progéniteur engagé sans tri ni étiquetage, car il existe des différences distinctes dans le comportement de division qui peuvent être observées via l’imagerie de cellules vivantes³.

Nous utilisons l’imagerie de cellules vivantes pour étudier la cinétique de prolifération des kératinocytes. Une approche similaire a été utilisée pour étudier la motilité des cellules de mélanome cutané co-cultivées avec les kératinocytes⁴, la migration cellulaire adhérente des tests de grattage⁵ et la façon dont les inhibiteurs de ROCK affectent la prolifération des kératinocytes⁶. Ce protocole est spécialement conçu pour la culture de cellules afin de faciliter le traçage de la lignée par imagerie de cellules vivantes, bien qu’il puisse être adapté à d’autres fins.

Ce protocole décrit l’isolement des kératinocytes de passage 0 à des fins d’imagerie de cellules vivantes, traite des complications qui peuvent survenir et fournit des considérations qui peuvent nécessiter des modifications au protocole (Figure 1).

L’approbation du Comité de la recherche humaine de l’établissement est requise pour l’utilisation de tissus humains. Les échantillons humains pour la recherche proviennent souvent de sources commerciales (par exemple, ATCC, Lifeline cell technology et Zen-Bio). Nos études utilisent des tissus jetés au moment des interventions chirurgicales ou des échantillons de biopsie cutanée prélevés spécifiquement à des fins d’étude. Ces situations nécessitent des approbations et des procédures de consentement différentes. Tous les tissus sont obtenus après l’approbation du Comité de recherche humaine de l’UCSF, en utilisant un consentement éclairé écrit et conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki.

1. Séparation de l’épiderme du derme

1. S’assurer que les approbations appropriées sont obtenues pour utiliser des tissus humains pour l’étude.
2. Prélevez un échantillon de peau et transportez-le dans un contenant isotherme avec un sac de glace. Placez l’échantillon dans un milieu de prélèvement contenant une concentration 5x de pénicilline, de streptomycine et d’amphotéricine.
   REMARQUE : La quantité requise dépendra de l’application. D’après notre expérience, environ 1 000 000 de kératinocytes par^cm2 sont obtenus à partir de peaux adultes et âgées. Cependant, cela peut varier considérablement pour chaque échantillon.
   1. Placez les prépuces néonatals dans un milieu de culture cellulaire et commencez la procédure d’isolement des kératinocytes au plus tard 48 heures après la circoncision pour minimiser la mort cellulaire. Conservez le mouchoir à 4 °C jusqu’au traitement. Le traitement des échantillons adultes et âgés commence généralement quelques heures après la collecte.
3. Obtenir l’accès à une enceinte de biosécurité avec un équipement de niveau BS2 conçu pour travailler avec des agents qui causent des maladies par ingestion, muqueuse ou exposition percutanée⁷. Assurez-vous que l’enceinte de biosécurité est stérilisée aux UV pendant au moins 15 minutes et que toutes les surfaces sont pulvérisées avec de l’alcool à 70 % avant utilisation.
4. Mettez des gants, vaporisez le récipient de collecte avec de l’alcool à 70 % et placez le récipient dans la hotte. Placez un coussin de refroidissement sous le tissu pour l’empêcher de se réchauffer à température ambiante et pour maintenir son intégrité. Si le tissu est extrêmement gros, coupez une partie pour le traitement et gardez le reste humide dans le récipient de collecte.
   REMARQUE : Comme de nombreux spécimens âgés ont une grosse peau abdominale ou mammaire provenant de chirurgies, il faut du temps pour couper et traiter le tissu. Le mouchoir ne doit jamais être placé directement sur le coussinet, car le froid extrême peut le faire geler. Au lieu de cela, il doit être placé sur une surface intermédiaire, telle qu’une dalle de marbre.
5. Placez deux boîtes de Pétri de 100 mm x 15 mm et un scalpel chirurgical stérile #23 dans la capuche.
6. Ouvrez les boîtes de Pétri et placez-les sur la surface de l’armoire de manière à ce que les surfaces intérieures de chaque boîte soient orientées vers le haut. Ajouter 10 ml de gluconate de chlorhexidine à 10 % dans l’une des boîtes de Pétri. Ajouter 10 ml de 5x pénicilline/streptomycine/amphotéricine/gentamycine dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS ; 5x) à 2 autres moitiés de boîte de Pétri (voir le tableau des matériaux).
7. Préparez une plaque à 6 puits pour l’étape de dispase. Pour les tissus néonatals, utilisez 3 mL de Dispase par puits. Pour les échantillons de tissus âgés, utilisez 4 ml. L’utilisation de quantités insuffisantes de Dispase pour le volume de tissu peut entraîner des difficultés à séparer l’épiderme du derme.
8. À l’aide d’un scalpel, coupez le tissu en petits morceaux afin qu’il soit mieux pénétré par la dispase. La dispase ne pénètre que jusqu’à 5 mm des bords du tissu, alors coupez de longues bandes de tissu de 0,5 à 1 cm de large. S’il n’est pas coupé assez petit, la séparation de l’épiderme du derme ne se produira pas.
   1. Coupez les tissus plus épais en petits morceaux. Coupez le prépuce néonatal en 3 ou 4 morceaux (~5 mm x 7 mm). Utilisez un maximum de deux prépuces entiers par puits de Dispase. Les lambeaux abdominaux superficiels ont tendance à être beaucoup plus minces, avec peu ou pas de tissu sous-cutané, coupez-les en bandes plus longues (bandes de ~5 mm x 15 mm).
   2. Placez un maximum de quatre bandes par puits de Dispase. Si le tissu obtenu a beaucoup de graisse sous-cutanée attachée, coupez le tissu sous-cutané pour aider Dispase à pénétrer complètement dans le tissu. Si le tissu est coupé trop petit, un microscope de dissection peut être nécessaire pour déterminer quel côté est épidermique et quel côté est dermique lors du décollement de l’épiderme. Tirer du mauvais côté de la peau peut entraîner un traumatisme tissulaire supplémentaire.
9. Placez le côté épidermique tissulaire vers le bas dans la première boîte de Pétri préparée à l’étape 1.6, contenant 10 % de gluconate de chlorhexidine, pendant 10 à 20 s, puis transférez le côté épidermique tissulaire vers le bas dans la deuxième boîte de Pétri, contenant 5 fois la pénicilline/streptomycine ou l’amphotéricine (PSA) avec HBSS, et agitez pendant 10 à 20 s. Transférez le tissu du côté épidermique vers le bas dans la troisième boîte de Pétri, contenant à nouveau 5 fois PSA avec HBSS, et agitez pendant 10 secondes supplémentaires. Le traitement de plusieurs échantillons avec la même solution est acceptable.
10. Transférez le tissu, côté épidermique vers le bas, dans la plaque de dispase à 6 puits préparée à l’étape 1.7.
    REMARQUE : Nous recommandons le côté épidermique vers le bas selon notre convention. D’autres protocoles recommandent le derme vers^{le bas 8}. All Dispase n’est pas aussi efficace. Le peeling de l’épiderme d’une peau âgée s’est avéré difficile avec certains produits, même à des concentrations jusqu’à 4 fois le niveau recommandé par le fabricant. Cela a entraîné une perte de temps et d’échantillons. Les entreprises utilisent des unités non normalisées pour Dispase, ce qui rend difficile l’identification des différences de concentration entre les marques. En raison de ces défis, l’utilisation de l’une des marques Dispase répertoriées dans la table des matériaux est fortement recommandée.
11. Étiquetez la plaque à 6 puits contenant la dispase et les échantillons, puis transférez-les à 4 °C. Incuber des échantillons néonatals pendant 16 à 18 h dans Dispase et des échantillons adultes/âgés pendant 24 h.
    REMARQUE : Il existe un protocole alternatif de 2 h qui peut être utilisé pour les échantillons, où l’échantillon est placé dans Dispase à 37 °C pendant 2 h, puis l’épiderme est pelé. Malheureusement, cela ne fonctionne pas toujours et l’intégrité du tissu peut être compromise après l’incubation, ce qui entraîne la perte d’un échantillon. L’incubation d’une nuit est préférable dans la mesure du possible.

2. Isolement des kératinocytes

1. Placez la trypsine-EDTA à 0,05 % (ou TrypLE), la solution neutralisante de trypsine et le milieu kératinocytaire dans un bain-marie à 37 °C 20 minutes avant de commencer la prochaine série d’étapes.
2. Retirez une plaque à 6 puits à 4 °C, vaporisez-la d’éthanol à 70 % et placez-la dans une enceinte de biosécurité préparée (voir étape 1.3).
3. Placez les pinces dentées stériles et les pinces non dentées dans un tube conique de 50 ml contenant 20 ml d’éthanol à 70 %. Si vous êtes à l’extérieur de la hotte au départ, vaporisez une pince avec de l’éthanol à 70 % avant de la mettre dans la hotte.
4. À l’aide d’une pince stérilisée chimiquement, saisissez un morceau de tissu et placez-le sur une surface stérile, côté épidermique vers le haut (à l’aide d’une boîte de Pétri ou de l’intérieur de la moitié supérieure de la plaque à 6 puits). Tenez la partie dermique du tissu à l’aide d’une pince dentée à l’aide de la main non dominante et saisissez fermement l’épiderme avec la pince non dentée et retirez-le d’un bord à l’autre. Il doit se détacher en douceur en un seul morceau.
5. Placez l’épiderme à l’intérieur de la lèvre d’un tube conique de 15 ml. Chaque tube conique de 15 mL doit avoir un épiderme de deux prépuces maximum.
   1. Travailler efficacement ; Si le tissu se dessèche, le rendement sera compromis. Si la dispase n’a pas pénétré correctement dans le tissu, il peut être difficile de décoller l’épiderme. Dans un tel cas, retirez/grattez l’épiderme du derme sous-jacent. Cela entraîne également un rendement beaucoup plus faible et n’est pas recommandé.
6. Ajoutez 4 ml de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le tube conique de 15 ml, puis fermez et retournez le tube en vous assurant que tout l’épiderme est suspendu dans la trypsine et non collé sur le côté du tube/du couvercle. Placer dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 min. Agitez les cellules toutes les 2 minutes à la main.
   REMARQUE : La trypsinisation pendant plus de 10 minutes peut entraîner un rendement cellulaire plus faible. De plus, si l’intégrité des protéines de surface cellulaire est une préoccupation, utilisez TrypLE car il est plus spécifique à son site de clivage, ce qui entraîne moins de dommages aux cellules et il a été démontré qu’il ne diminue pas de manière significative l’expression de l’antigène de surface par rapport à la trypsine-EDTA⁹. De plus, le bain-marie est une source fréquente de contamination, alors assurez-vous qu’il est nettoyé régulièrement. Changez l’eau régulièrement avec de l’eau déminéralisée contenant la solution aquaguard-2.
7. Placez un tube conique de 50 mL dans l’enceinte de sécurité biologique. Dévissez le couvercle et placez une passoire à cellules de 100 μm sur l’ouverture du tube conique.
8. Retirer du bain-marie le tube conique de 15 mL contenant l’échantillon digéré, le sécher à fond et l’asperger d’alcool à 70 % avant de le remettre dans l’enceinte de sécurité biologique. Tapotez le tube conique 3x contre la surface de la hotte puis retournez-le 6x. Répétez le cycle de taraudage-inversion 3x.
9. Ajouter 6 ml de solution neutralisante de trypsine dans le tube conique. Verser à travers la passoire cellulaire dans le tube conique de 50 ml à partir de l’étape 2.7.
10. Rincez le tube conique de 15 mL contenant l’échantillon avec 5 mL de solutions neutralisantes de trypsine (TNS). Verser à travers une passoire à cellule dans le tube conique de 50 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
11. Retirer immédiatement de la centrifugeuse et pipeter le surnageant pour éviter la perte de cellules dans le milieu. Il ne devrait rester que le granulé avec une petite collection de liquide. Il peut être difficile de voir la pastille à partir d’échantillons de tissus plus petits.
    REMARQUE : Il y a de la trypsine présente dans le surnageant, il est donc préférable d’en éliminer autant que possible sans perdre la pastille.
12. Remettre la pastille de kératinocytes en suspension dans 2 mL de milieu kératinocytaire.
    REMARQUE : Il y a deux considérations ici. Tout d’abord, quels médias utiliser. À cette fin, il est recommandé d’utiliser des milieux sans sérum et sans collagène. Historiquement, la norme pour la culture de cellules kératinocytes a été le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco + 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) + le F-12 de Ham sur une couche nourricière de fibroblastes (3t3-J2s)¹⁰. Cependant, avec l’avènement des milieux sans sérum et la disponibilité du collagène, de multiples autres possibilités restent viables (voir discussion)¹¹. La deuxième considération est de savoir si l’utilisation d’antibiotiques dans le milieu de culture est appropriée pour l’application d’imagerie de cellules vivantes. Cela dépendra de la durée de l’imagerie et de l’expérience avec le système d’imagerie. Les colonies sont imagées sur plusieurs semaines à l’aide d’un système d’imagerie partagé, ce qui fait de l’utilisation d’antibiotiques une approche privilégiée malgré l’impact potentiel sur les cultures (voir la discussion). La pénicilline, la streptomycine, l’amphotéricine B et le milieu kératinocytaire contenant de la gentamicine sont utilisés pendant la remise en suspension, suivie d’un passage à un milieu contenant de la pénicilline/streptomycine après le changement initial de milieu. Cette méthode a permis d’empêcher efficacement la contamination lors de l’imagerie prolongée de cellules vivantes.
13. Comptez les cellules et ensemencez la plaque (voir la discussion pour les commentaires sur le choix de la densité d’ensemencement). Pour assurer une distribution uniforme de l’ensemencement, avant l’ensemencement, remettre en suspension les cellules kératinocytes dans la quantité totale de milieu à plaquer. Après une légère agitation par inversion, agiter légèrement pendant 1 à 2 s, et plaquer. Ensuite, déplacez la microplaque en croix (haut-bas, gauche-droite) 3 fois dans l’incubateur.
14. Après 24 h, placez la plaque dans l’incubateur du système d’imagerie de cellules vivantes. Effectuez une imagerie de cellules vivantes à 10x avec des images prises toutes les 20 min. Placez les échantillons à 37 °C et 5 % de CO₂ dans l’incubateur fixé au microscope.

Étant donné les multiples variables qui peuvent être manipulées dans cette méthode et qui aboutissent finalement à une variété de résultats, nous décrivons ici les erreurs courantes et les résultats qui en résultent, ainsi que des résultats exemplaires et les circonstances qui les sous-tendent.

Comme pour toute technique de culture cellulaire, la contamination est une possibilité (Vidéo supplémentaire 1). En plus des techniques...

Ici, nous avons détaillé une méthode de culture primaire de kératinocytes humains à des fins d’imagerie de cellules vivantes. Cette méthode adapte les techniques de culture cellulaire existantes en utilisant un placage à faible densité et une culture à long terme pour permettre des études d’imagerie de cellules vivantes réussies. La méthode privilégiée pour la dissociation de ce type de cellule implique une digestion enzymatique en deux étapes, dont il a été démontr...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un merci spécial à T. Richard Parenteau, MD/PhD, et Alexandra Charruyer, PharmD/PhD, pour m’avoir appris à cultiver des kératinocytes. Merci à Merisa Piper MD de nous avoir fourni des échantillons pour isoler les kératinocytes. Enfin, merci à Michael Rosenblum MD de nous avoir permis d’accéder à son système d’imagerie de cellules vivantes pour réaliser les expériences.