生成用于角质形成细胞活细胞成像的原代培养物

该方案概述了用于活细胞成像的新鲜获得（第 0 代）角质形成细胞的培养物。

在人类皮肤的单细胞水平上追踪干细胞和承诺的祖细胞行为在 体内 和 体外都具有挑战性。活细胞成像在识别角质形成细胞干细胞和定型祖细胞行为之间差异的能力方面取得了重大进展。活细胞成像是一种不断发展且具有一定挑战性的方法，用于研究 体外角质形成细胞的行为。该方案已被开发用于以低接种密度培养角质形成细胞，从而能够对单个细胞行为进行相对长期的延时摄影和监测。第 0 代角质形成细胞以克隆密度生长，延时摄影可以记录单个细胞分裂及其发生时间。为了获得最大的生物学相关性，将新鲜分离的人角质形成细胞置于 体外。这种方法侧重于增殖。然而，该协议可以适用于其他测量单个细胞行为的活细胞成像应用，例如测量细胞迁移、伤口愈合和运动。

该协议的目标是提供在相对较长的时间（几周）内跟踪培养物中单个角质形成细胞的能力，这是通过低接种密度和延时摄影实现的。低密度活细胞成像为研究人员提供了在单个细胞水平上可视化 体外 细胞行为的机会。虽然在传统细胞培养中是不可能的，但活细胞成像可以在不使用标记的情况下实时开发谱系树，从中可以确定有关分裂动力学的信息，例如细胞周期持续时间以及菌落中增殖和分化分裂的比例。它还允许研究细胞迁移和运动。这在技术上可能具有挑战性，需要优化的各个方面，具体取决于细胞类型和要捕获的数据。其他实验室利用了更容易生长的新生角质形成细胞和/或传代角质形成细胞¹。

然而，经历重复传代的细胞系在行为和形态上与其 体内 状态² 显著不同。为了获得最接近 体内 行为的最大生物学相关性，使用传代 0 细胞。在角质形成细胞群中，无需分类或标记即可区分干细胞和定型祖细胞，因为可以通过活细胞成像观察到分裂行为的明显差异³。

我们利用活细胞成像来研究角质形成细胞增殖动力学。类似的方法已被用于研究与角质形成细胞共培养的皮肤黑色素瘤细胞的运动⁴、划痕测定⁵ 的贴壁细胞迁移以及 ROCK 抑制剂如何影响角质形成细胞增殖⁶。该方案专为培养细胞而设计，以促进通过活细胞成像进行谱系追踪，尽管它可能适用于其他目的。

该方案概述了用于活细胞成像目的的第 0 代角质形成细胞的分离，讨论了可能出现的并发症，并提供了可能需要更改方案的注意事项（图 1）。

使用人体组织需要获得该机构人类研究委员会的批准。用于研究的人类样本通常从商业来源（例如 ATCC、Lifeline cell technology 和 Zen-Bio）获得。我们的研究使用手术时丢弃的组织或专门为研究目的采集的皮肤活检样本。这些情况需要不同的批准和同意程序。所有组织均在获得 UCSF 人类研究委员会的批准后获得，使用书面知情同意并遵循赫尔辛基宣言的原则。

1. 表皮与真皮分离

1. 确保获得适当的批准以使用人体组织进行研究。
2. 获取皮肤样本并将其放入带有冰袋的绝缘容器中运输。将样品置于含有 5 倍浓度青霉素、链霉素和两性霉素的收集培养基中。
   注意： 所需数量将取决于应用程序。根据我们的经验，每厘米² 大约有 1,000,000 个角质形成细胞来自成人和老年皮肤。但是，每个样品的阈值可能会有很大差异。
   1. 将新生儿包皮置于细胞培养基中，并在包皮环切术后不超过 48 小时开始角质形成细胞分离程序，以尽量减少细胞死亡。将组织储存在 4 °C 直至处理。成人和老年样本的处理通常在采集后几个小时内开始。
3. 使用带有 BS2 级设备的生物安全柜，该设备设计用于处理通过摄入、粘膜或经皮暴露引起疾病的试剂⁷。确保生物安全柜经过紫外线消毒至少 15 分钟，并且在使用前所有表面都喷洒了 70% 的酒精。
4. 戴上手套，用 70% 酒精喷洒收集容器，然后将容器放入通风橱中。在纸巾下方放置一个冷却垫，以防止其升温至室温并保持其完整性。如果组织非常大，请切下一部分进行处理，并在收集容器中保持其余部分湿润。
   注意：由于许多老化标本是手术留下的大腹部或乳房皮肤，因此切割和处理组织需要时间。切勿将纸巾直接放在垫子上，因为极冷会导致它结冰。相反，它应该放置在中间表面上，例如大理石板。
5. 将两个 100 mm x 15 mm 培养皿和一把无菌 #23 手术刀放入罩中。
6. 打开培养皿并将其放在橱柜表面，使每个培养皿的内表面朝上。将 10 mL 10% 葡萄糖酸氯己定添加到其中一个培养皿中。将 10 mL 5x 青霉素/链霉素/两性霉素/庆大霉素在 Hank 平衡盐溶液 （HBSS;5x） 中加入到其他 2 个培养皿中（参见 材料表）。
7. 为 Dispase 步骤准备一个 6 孔板。对于新生儿组织，每孔使用 3 mL 分散酶。对于老化的组织样品，使用 4 mL。使用与组织体积相称的 Dispase 量不足会导致难以将表皮与真皮分离。
8. 使用手术刀将组织切成更小的碎片，以便更好地被 Dispase 渗透。分散酶只能从组织边缘穿透最多 5 毫米，因此请切割 0.5-1 厘米宽的长条组织。如果切割得不够小，则不会发生表皮与真皮的分离。
   1. 将较厚的组织切成小块。将新生儿包皮切成 3 或 4 块 （~5 mm x 7 mm）。每孔 Dispase 最多使用两个完整的包皮。浅表腹皮瓣往往更薄，皮下组织很少或没有，将它们切成更长的（~5 mm x 15 mm 条带）。
   2. 每个 Dispase 孔最多放置 4 个试纸条。如果获得的组织附着了大量皮下脂肪，请修剪皮下组织以帮助 Dispase 完全渗透组织。如果组织切得太小，可能需要解剖显微镜来确定哪一侧是表皮，哪一侧是真皮，同时剥落表皮。拉扯皮肤的另一侧会导致额外的组织创伤。
9. 将组织表皮面朝下放入步骤 1.6 中制备的第一个培养皿中，含有 10% 葡萄糖酸洗必泰，放置 10-20 秒，然后将组织表皮面向下转移到第二个培养皿中，含有 5x 青霉素/链霉素/两性霉素 （PSA） 和 HBSS，搅拌 10-20 秒。将组织表皮面向下转移到第三个培养皿中，再次含有 5x PSA 和 HBSS，再搅拌 10 秒。使用相同的溶液处理多个样品是可以接受的。
10. 将组织表皮面向下转移到步骤 1.7 中制备的 6 孔 Dispase 板中。
    注意：按照我们的惯例，我们建议表皮面朝下。其他协议建议真皮层下降⁸。所有 Dispase 的效果并不相同。事实证明，使用某些产品很难从老化的皮肤上剥离表皮，即使浓度高达制造商推荐水平的 4 倍。这导致了时间和样本的损失。公司使用 Dispase 的非标准化单位，因此很难确定品牌之间的浓度差异。由于这些挑战，强烈建议使用 材料表 中列出的 Dispase 品牌之一。
11. 标记含有分散酶和样品的 6 孔板，并转移至 4 °C。 将新生儿样品在 Dispase 中孵育 16-18 小时，将成人/老年样品孵育 24 小时。
    注意：有一种替代的 2 小时方案可用于样品，其中将样品置于 37 °C 的 Dispase 中 2 小时，然后剥去表皮。不幸的是，这并不总是有效，并且孵育后组织的完整性可能会受到影响，从而导致标本丢失。尽可能选择过夜孵育。

2. 角质形成细胞的分离

1. 在开始下一组步骤前20分钟，将0.05%胰蛋白酶-EDTA（或TrypLE）、胰蛋白酶中和溶液和角质形成细胞培养基置于37°C水浴中
2. 从4°C中取出6孔板，用70%乙醇喷洒，并将其放入准备好的生物安全柜中（参见步骤1.3）。
3. 将无菌齿形镊子和无齿镊子放入含有 20 mL 70% 乙醇的 50 mL 锥形管中。如果最初在通风橱外，请先用 70% 乙醇将镊子喷洒下来，然后再将其放入通风橱中。
4. 使用化学灭菌的镊子，抓住一块组织并将其放在无菌表面，表皮面朝上（使用培养皿或 6 孔板上半部分的内侧）。用非惯用手用齿形镊子握住组织的真皮部分，同时用无齿镊子牢牢抓住表皮，并将其从边缘拉到另一边。它应该作为一个整体顺利地脱落。
5. 将表皮放在 15 mL 锥形管的边缘内侧。每个 15 mL 锥形管的表皮最多应为两个包皮。
   1. 高效工作;如果组织变干，产量就会受到影响。如果分散酶没有适当地穿透组织，则可能难以剥离表皮。在这种情况下，从下面的真皮上拉/刮掉表皮。这也会导致产量低得多，因此不建议这样做。
6. 在 15 mL 锥形管中加入 4 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，然后关闭并倒置试管，确保所有表皮都悬浮在胰蛋白酶中，而不是卡在试管/盖子的侧面。置于 37 °C 水浴中 10 分钟。每 2 分钟手动搅拌一次细胞。
   注：胰蛋白酶消化超过 10 分钟可能会导致细胞产量降低。此外，如果担心细胞表面蛋白的完整性，请使用 TrypLE，因为它对其切割位点更具特异性，对细胞的损伤较小，并且与胰蛋白酶-EDTA⁹ 相比，已被证明不会显著降低表面抗原表达。此外，水浴是常见的污染源，因此请确保定期清洁。定期用含有 aquaguard-2 溶液的去离子水换水。
7. 将 50 mL 锥形管放入生物安全柜中。拧开盖子，将 100 μm 细胞过滤器放在锥形管的开口处。
8. 从水浴中取出装有消解样品的 15 mL 锥形管，彻底干燥，并喷洒 70% 酒精，然后将其放回生物安全柜中。将锥形管轻敲通风橱表面 3 次，然后倒置 6 次。重复敲击-倒置循环 3 次。
9. 将 6 mL 胰蛋白酶中和溶液加入锥形管中。通过细胞过滤器倒入步骤 2.7 中的 50 mL 锥形管中。
10. 用 5 mL 胰蛋白酶中和溶液 （TNS） 冲洗含有样品的 15 mL 锥形管。通过细胞过滤器倒入 50 mL 锥形管中。以 300 x g 离心 5 分钟。
11. 立即从离心机中取出并移液上清液，以防止细胞流失到培养基中。应该只剩下沉淀和少量液体。可能很难从较小的组织样本中看到沉淀。
    注：上清液中存在胰蛋白酶，因此最好在不丢失沉淀的情况下尽可能多地去除。
12. 将角质形成细胞沉淀重悬于 2 mL 角质形成细胞培养基中。
    注意：这里有两个注意事项。首先，使用哪种媒体。为此，建议使用不含胶原蛋白的无血清培养基。从历史上看，角质形成细胞培养的标准是 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） +10% 胎牛血清 （FBS） + 成纤维细胞饲养层上的 Ham F-12 （3t3-J2s）¹⁰。然而，随着无血清培养基的出现和胶原蛋白的出现，多种其他可能性仍然可行（见讨论）¹¹。第二个考虑因素是在培养基中使用抗生素是否适合活细胞成像应用。这将取决于成像持续时间和成像系统的经验。使用共享成像系统对菌落进行数周成像，尽管对培养物有潜在影响，但使用抗生素是首选方法（见讨论）。在重悬过程中使用青霉素、链霉素、两性霉素 B 和含庆大霉素的角质形成细胞培养基，然后在初始培养基更换后改用含青霉素/链霉素的培养基。这种方法有效地防止了长时间活细胞成像过程中的污染。
13. 计数细胞并接种板（有关选择接种密度的评论，请参阅讨论）。为确保接种均匀分布，在铺板前，将角质形成细胞重悬于待铺板培养基的总量中。倒置轻轻搅拌后，轻轻涡旋 1-2 秒，然后板。然后，在培养箱中以十字状模式（上-下、左-右）移动微孔板 3 次。
14. 24 小时后，将板放入活细胞成像系统的培养箱中。以 10 倍的速度进行活细胞成像，每 20 分钟拍摄一次图像。将样品置于 37 °C 和 5% CO₂ 中，放入连接到显微镜的培养箱中。

鉴于这种方法中可能纵的多个变量最终导致各种结果，我们在这里概述了常见的错误及其结果，并提供了示例结果及其背后的情况。

与任何细胞培养技术一样，可能存在污染（补充视频 1）。除了谨慎的无菌技术外，还应考虑在培养基中使用抗生素，尤其是在长时间培养的情况下。当培养的细胞在不使用抗生素的情况下被运送到另一个位...

在这里，我们详细介绍了一种用于活细胞成像的人角质形成细胞原代培养方法。该方法使用低密度铺板和长期培养来调整现有的细胞培养技术，以实现成功的活细胞成像研究。这种细胞类型解离的首选方法涉及两步酶消化，这已被证明会产生角质形成细胞，其中 3%-4% 能够成为集落形成单位¹⁴。成人和老年角质形成细胞 在体外 生长具有挑战性，因?...

作者没有什么可披露的。

特别感谢 T. Richard Parenteau（医学博士/博士）和 Alexandra Charruyer（药学博士/博士）教我如何培养角质形成细胞。感谢 Merisa Piper 医学博士为我们提供样品以分离角质形成细胞。最后，感谢医学博士 Michael Rosenblum 允许我们使用他的活细胞成像系统来完成实验。