Farelerde ve Sıçanlarda Merkezi Sinir Sistemi Hedeflemesi için Gen Tedavisi Vektörlerinin Lomber İntratekal Enjeksiyonu

Lomber intratekal enjeksiyon, gen terapisini merkezi sinir sistemine iletmek için translasyonel olarak ilgili bir uygulama yolunu temsil eder. Yenidoğan, juvenil ve yetişkin farelerde ve sıçanlarda lomber intratekal enjeksiyonlar için bu kapsamlı standartlaştırılmış protokol, araştırmacılara klinik öncesi gen tedavisi çalışmaları için bu tekniği benimsemede rehberlik etmeyi amaçlamaktadır.

Nörolojik hastalıkları tedavi etmek için merkezi sinir sistemini hedeflemenin bir yöntemi, lomber intratekal uygulama yolunun kullanılmasını içerir. Bu yaklaşım, beyin omurilik sıvısına doğrudan erişmek ve tercihen merkezi sinir sistemi içindeki hücreleri hedeflemek için kan-beyin bariyerini atlar. Lomber intratekal enjeksiyon yolunu kullanan çok sayıda yayınlanmış klinik öncesi çalışma, gen tedavisi klinik çalışmalarının geliştirilmesine katkıda bulunmuştur; Bununla birlikte, açıklanan protokoller değişkendir ve birden çok kaynağa dağılmıştır. Burada, preklinik gen tedavisi çalışmaları için yenidoğan, juvenil ve yetişkin farelerde ve sıçanlarda lomber intratekal enjeksiyonlar için kapsamlı bir protokol seti sunulmaktadır. Uygun eğitim ile bu enjeksiyon tekniği hızlı ve güvenilir bir şekilde gerçekleştirilebilir. Her gelişim aşamasında enjeksiyon protokolünün detaylandırılmasına ek olarak, çalışma sonuçlarını etkileyebilecek enjeksiyon hacmi gibi ilişkili parametreler tartışılmaktadır. Merkezi sinir sistemini hedeflemek için lomber intratekal enjeksiyonların uygulanmasını göstermek için, başarılı veya başarısız bir enjeksiyonun ardından beyin, omurilik ve periferik dokularda adeno ilişkili virüs serotip 9'un ekspresyonu sunulur.

Küresel merkezi sinir sistemi (CNS) iletimi gerektiren, ancak aksi takdirde gen terapisi için iyi adaylar olan nörolojik hastalıkların tedavisinde bir zorluk, büyük ölçüde CNS'nin ve ilgili hücre tiplerinin verimsiz hedeflenmesine bağlanmıştır¹. Mühendislik dağıtım araçları ile küresel CNS hücre ve doku hedeflemesini optimize etmek için önemli miktarda araştırma devam etmektedir ^1,2. Bununla birlikte, viral vektörlerin belirli kombinasyonları ve uygulama yolları kullanılarak mevcut gen terapisi vektör teknolojisi ile makul ölçüde yaygın vektör iletimi hala elde edilebilir ^3,4. Tek seferlik bir tedaviden yaygın CNS iletimi elde etmek için mevcut altın standart, beyin omurilik sıvısına (BOS) doğrudan enjeksiyon ile birlikte adeno ilişkili virüs serotip 9'u (AAV9) kullanmaktır.

Doğrudan BOS enjeksiyonları için üç tipik uygulama yolu vardır: lomber intratekal (IT), intraserebroventriküler (ICV) ve intrasisternal (ICM)⁵. Bu uygulama yollarının her biri, CNS ve periferik dokularda farklı biyodağılım modellerine neden olur, ancak hepsi, nörolojik hastalık patolojisine ve fenotiplerine katkıda bulunan CNS'deki hücrelere ulaşmak için kan-beyin bariyerini (BBB) atlama avantajına sahiptir⁶. Lomber IT enjeksiyonu, klinik prosedür rutin ve basit olduğundan, ICV ve ICM enjeksiyonlarına kıyasla daha az invazivlik ile insanlarda klinik ilaç iletimi kullanımı için standarttır.

Lomber IT enjeksiyonu, anestezik ve analjezik alanlarda kolayca kullanılan ve ilk makalesi 1885'te yayınlanan yerleşik bir tekniktir⁷. Yetişkin farelerde lomber IT enjeksiyonları için ilk protokol 1980'de yayınlandı⁸ ve o zamandan beri yaygın olarak benimsenmiş ve gözden geçirilmiştir⁹. Bu protokollerde küçük ayarlamalar veya iyileştirmeler yapılmıştır 10,11,12, ürün koruma tekniği de dahil olmak üzere ¹³. Yetişkin sıçanlarda lomber IT enjeksiyonları için protokoller de ilk olarak 1976'da, kronik uygulama için kateterizasyon¹⁴ ve tek seferlik tedaviler için doğrudan enjeksiyon¹⁵ ile yayınlandı. Daha yakın zamanlarda, gruplar yenidoğan veya juvenil farelerde ve sıçanlarda lomber IT enjeksiyonları için protokoller yayınlamıştır^16,17.

CNS'deki BBB ve hedef hücreleri atlamak için bu tekniğin geniş çapta benimsenmesi ve doğrulanması, nörolojik hastalıkların tedavisi için çok sayıda başarılı gen terapisi, klinik öncesi ve klinik çalışmalara yol açmıştır. Nörolojik hastalıkları modelleyen farelerde, sıçanlarda ve insan olmayan primatlarda pozitif etkinlik ve güvenlik verileri, bu hastalıklar için klinik fayda potansiyeli konusunda heyecan ve ilgi uyandırmıştır 18,19,20,21,22,23. Bu çalışmaların bir kısmı şu anda klinik çalışmalardadır (örneğin, clinicaltrials.gov tanımlayıcılar NCT02362438, NCT04737460, NCT03381729 ve NCT05518188)^3,6. Bu makalede, farklı yaşlardaki farelerde ve sıçanlarda lomber IT enjeksiyonları için, BOS'u çıkarmadan, translasyonel gen terapisi projeleri için benimsenebilecek basit bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yaygın olarak benimsenen halihazırda mevcut protokollere benzer; Bununla birlikte, beraberindeki video görselleriyle birlikte kolay erişim ve referans için bu ilgili protokollere tek bir yerde atıfta bulunmanın değeri vardır. Bu protokol, doğum sonrası gün (P) 0-1'de yenidoğan fareleri ve sıçanları ve genç fareler ve sıçanlar P21) için enjeksiyonu açıklar ve farelerde P1'de başarılı ve başarısız bir lomber IT enjeksiyonundan temsili sonuçlar elde edilir. Tartışmada, bu prosedürü gerçekleştirirken dikkatli olunması gereken yaygın yanlış adımlar ve belirli ayrıntıların yanı sıra klinik öncesi bir çalışmaya başlamadan önce bu enjeksiyonların nasıl uygulanacağına dair öneriler ele alınmaktadır.

Burada açıklanan prosedürler, Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Fareleri içeren protokoller için P1-P28 yaşlarındaki vahşi tip C57BL6 / J erkek ve dişi fareler kullanıldı. Sıçanları içeren protokoller için P1-P56 yaşlarındaki vahşi tip Sprague-Dawley erkek ve dişi sıçanlar kullanıldı. Bölüm 3'te açıklanan sağkalım cerrahisinin yanı sıra, diğer tüm prosedürlerin sadece anlık rahatsızlığa neden olduğu kabul edilir ve anestezik veya analjezik kullanımını gerektirmez. Bireyler, laboratuvar hayvanlarını anlık rahatsızlıktan daha fazlası için izlemeli ve anestezik ve analjeziklerin gerekliliği konusunda IACUC ve veterinerlik personelinden rehberlik almalıdır. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Farelerin lomber IT enjeksiyonu >P21

1. Hazırlık
   1. İstenen konsantrasyon(lar)da gen terapisi vektörü ve bir kontrol çözeltisi (genellikle vektör üretiminde kullanılan formülasyon tamponu) dahil olmak üzere enjeksiyon çözeltilerini hazırlayın. Enjeksiyon solüsyonları steril olmalı ve işlem boyunca steril kalmalıdır.
      NOT: Tüm solüsyonlar prosedür süresince buz üzerinde tutulmalıdır.
   2. Şırınga ve iğne, pipet ve enjeksiyon solüsyonu dahil tüm malzemeleri toplayın ve sterilize edin. Biyogüvenlik kabinlerinin kullanımı ve enjekte edici madde maruziyeti ile ilgili kurumsal yönergeleri izleyin. Burada açıklanan prosedürler 2. sınıf bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmiştir.
   3. Mikrolitrelik bir pipet kullanarak, istenen enjeksiyon çözeltisi hacmini ölçün ve steril parafin filme aktarın. 5 μL'lik bir enjeksiyon hacmi yaygın olarak kullanılır ve yetişkin fareler için hedef hacim olarak kabul edilir >P21 (Tablo 1).
      NOT: Gerekirse ses seviyesi artırılabilir; Bununla birlikte, hayvanlar daha büyük enjeksiyon hacimlerine karşı advers reaksiyonlar açısından yakından izlenmelidir. Enjeksiyon hacmi ve advers reaksiyonlar hakkında ayrıntılar için Tartışma bölümüne bakın. Çözelti ayrıca doğrudan pipet ucundan bir şırıngaya aktarılabilir veya enjeksiyon çözeltisi hacmini doğrudan ölçmek için kalibre edilmiş gaz geçirmez mikrolitre şırıngalar kullanılabilir.
   4. Solüsyonu 30 G 0,5 inçlik bir iğne ile mikrolitrelik bir şırıngaya çekin, herhangi bir hava kabarcığı çizmemeye dikkat edin.
      NOT: İğne ölçüsü ve uzunluğu cilt penetrasyonunu etkileyebilir. Kullanılacak şırınganın boyutu göz önüne alındığında, enjeksiyon hacmi şırınga kapasitesinin %10'undan az olmamalıdır. Şırınga kapasitesinin %50'sinden daha büyük hacimler için, pistona işaret parmağınızla kolayca bastırılabildiğinden emin olun. Pistona kolayca bastırılamıyorsa, daha büyük kapasiteli bir şırınga kullanın.
2. Frenleyici
   1. Baskın eli kullanarak, bilinçli (uyuşturulmamış) fareyi kuyruğundan bir kağıt havlu üzerinde tutun. Kağıt havlu, fareyi dizginlemeye, sakinleştirmeye ve ısırmasını önlemeye yardımcı olacaktır. Fare, vücudun yan yüzü size bakacak şekilde nötr yüzüstü pozisyonda olmalıdır.
      NOT: İşlemden önce fareleri bu kısıtlamaya alıştırmak veya alıştırmak gerekli değildir. Fareler kısıtlama nedeniyle mücadele edebilir, ancak belirli bir ağrı tepkisi ortaya çıkarmamalıdır. Anlık ağrı yanıtlarından daha fazlası gözlenirse, analjezik uygulaması gerekli olabilir; Veteriner rehberliği isteyin.
   2. Baskın olmayan eliyle, kağıt havlunun bir kısmını farenin başının ve üst gövdesinin üzerine katlayın ve baskın olmayan başparmak ile işaret parmağı arasındaki pelvik kuşağı sıkıca kavrayın. Avucun, farenin başının etrafında durarak tutulduğundan emin olun. Farenin iliak tepesi aşikar olmalı ve her parmağın distal falanksının merkezine yerleştirilmelidir (Şekil 1A,B).
      NOT: El veya kağıt havludan alınan kısıtlama solunumu bozmamalıdır.
   3. Omurganın düzgün hizalanmasını sağlamak için kuyruğun tabanını yavaşça döndürün. Farenin pelvisi, lomber omurganın vertebral süreçleri çalışma yüzeyine dik olacak şekilde kare olmalıdır.
   4. Farenin sırt bel bölgesini %70 alkol hazırlama pedi ile temizleyin.
   5. Enjeksiyon yerini görselleştirmeye yardımcı olmak için saçı ~ 2-6 mm kraniyal iliak kreste ayırın.
   6. L4-L5 veya L5-L6 intervertebral boşluğu, iliak krestin ~ 2-6 mm kraniyalini hissedin.
      NOT: Tam mesafe, farenin boyutuna ve yaşına bağlı olarak değişir.
3. Enjeksiyon
   1. Baskın elinizi kullanarak, mikrolitre şırınganın merkezini tutun ve L4-L5 veya L5-L6 intervertebral boşlukta fare omurgasına dik olarak konumlandırın. Şırınganın pistonuna, elinizi aşırı hareket ettirmeden işaret parmağınızla bastırılabildiğinden emin olun. İğnenin eğimi farenin kafasına bakacak şekilde, cildi intervertebral boşluk üzerinde delin.
   2. İğnenin ucunda intervertebral boşluğun etrafındaki kemiğin kenarları hissedildiğinde, şırınganın açısını 30-45 dereceye düşürün (Şekil 1A).
   3. İğne, ani bir kuyruk hareketine neden olacak şekilde omurlar arası boşluğa kaymalı ve omurlar arasına sıkıca kenetlenmelidir.
   4. Şırınganın yerinden çıkmamasına dikkat ederek, çözeltiyi 10 saniye içinde vermek için pistona sabit bir şekilde bastırın.
   5. Çözeltinin dağılmasını sağlamak ve geri akışı önlemek için pistona tamamen bastırdıktan sonra şırıngayı 15-30 saniye yerinde tutun.
   6. Şırıngayı fareden aynı 30-45 derecelik giriş açısında yumuşak ve yavaş bir şekilde çekin. İğne geri çekilirken, geri akışı önlemek için şırıngayı döndürün.
      NOT: Şırıngayı döndürürken iğneyi ilerletmemeye dikkat edin, çünkü bu omurilikte fiziksel hasara neden olabilir.
   7. Fareyi kısıtlamadan serbest bırakın ve ev kafesine geri koyun.
   8. Enjeksiyondan sonra fareyi anormal ambulasyon, motor bozukluğu, solunum anormallikleri ve koordinasyon açısından izleyin. Advers reaksiyonlarla ilgili ek ayrıntılar için Tartışmaya bakın.
   9. Üreticinin tavsiyelerine uyarak ekipmanı temizleyin. Çoklu enjeksiyonlar için, her gen terapisi vektörü ve kontrol çözeltisi için farklı şırıngalar önerilir.
      NOT: Çıkarılabilir iğneler birden çok kez temizlenebilir, sterilize edilebilir ve yeniden kullanılabilir; Bununla birlikte, hayvana zarar verebilecekleri ve kaçırılan enjeksiyon olasılığını artırabilecekleri için kör iğneler kullanılmamalıdır. Kör bir iğne cildi kolayca delmez ve uygun şekilde atılmalıdır. Şırıngalar sınırlıysa, gen terapisi vektörüne geçmeden önce tüm araç enjeksiyonlarının tamamlanması ve daha yüksek dozlar uygulanmadan önce en düşük gen terapisi dozunun enjekte edilmesi tavsiye edilir.
   10. Hayvanlar arasında ekipmanın sterilizasyonu için kurumsal yönergeleri izleyin.

Şekil 1: Farelerde ve sıçanlarda lomber intratekal enjeksiyon için parmak ve şırınga yerleştirme şeması. (A) Lomber IT enjeksiyonu sırasında iğne yerleşimini ve şırınga açısı geçişini gösteren bir farenin >P21 yanal görünümü. Kesikli kırmızı oval, farenin iliak tepesi üzerinde parmağın konumunu gösterir. Omurganın büyütülmüş bir görünümü, yaklaşık iğne yerleşimi (yeşil ok) ve omurilik (pembe) ile intratekal boşluğu (mavi) gösterir. (B) bir farenin >P21, (C) bir farenin D) bir sıçanın >P21), iğne yerleştirme (yeşil daire), pelvik kuşak (kesikli sarı oval) ve parmak yerleştirme (kesikli kırmızı oval) için referans noktaları olan sırt görünümü. Kesi yeri ve ekartörler de (D)'de gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Farelerin ve sıçanların lomber IT enjeksiyonu

Gen terapisi vektör iletimini birçok faktör etkileyebilse de, dokunun histolojik boyanması lomber intratekal (IT) enjeksiyonların başarısını belirlemek için en doğru yöntem olmaya devam etmektedir. Enjeksiyonu takiben gen terapisi vektörünün merkezi sinir sistemi (CNS) içindeki geniş ve eşit dağılımı, başarılı bir prosedürün göstergesidir. Şekil 2C , enjeksiyondan 4 ay sonra, yenidoğan (P1) farelerde 1.3 × 10¹¹ vg / fare dozunda JeT promotörü altında zayıf her yerde bulunan transgen ekspresyonunu yönlendiren kendi kendini tamamlayan bir AAV9 aracılı gen terapisinin başarılı bir enjeksiyonunu temsil eder. Gen terapisi tarafından sağlanan transgeni hedef alan bir prob kullanan RNAscope analizi, lomber omurilik, servikal omurilik ve beyindeki geniş dağılımı ortaya çıkarır. Karaciğer ve kalbin bir bölümü, doğrudan beyin omurilik sıvısı (BOS) enjeksiyonu ile bile, gen terapisi vektörünün periferik dokulara hala dağıtılabileceğini vurgulamak için dahil edilmiştir.

Şekil 2: P1'de enjeksiyondan 4 ay sonra fare CNS ve periferik dokunun lekeli 5 mikronluk doku bölümleri. Kırmızı boyama, RNAscope yoluyla transgen ekspresyonunu gösterir ve çekirdeklerin mavi karşı boyanması hematoksilen yoluyla yapılır. (A) Bir kontrol formülasyon tamponu ile enjeksiyon. (B) Bir AAV9 vektörü (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA) ile başarısız intraparankimal enjeksiyon. (C) AAV9 vektörü (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA) ile başarılı lomber IT enjeksiyonu. (B) ve (C)'de kullanılan gen terapisi vektörü, translasyonel olarak anlamlı bir 1.3E11 vg / fare dozunda verildi. Ölçek çubuğu: üst panel (5 mm); alt panel (1 mm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2B'de gösterildiği gibi, beyindeki ekspresyon eksikliği ile eşleştirilmiş lomber omurilikteki konsantre ekspresyon, omuriliğin intraparankimal enjeksiyonunu gösterebilir ve başarısız bir enjeksiyon olarak kabul edilmelidir. Bu, iğne omurgaya çok fazla sokulduğunda, intratekal boşluğu geçtiğinde ve omuriliğe girdiğinde olur. Ek olarak, omurilik ve beyinde çok düşük veya hiç ekspresyon olmaması (gösterilmemiştir), geniş CNS dağılımının beklendiği durumlarda bir vektör ve dozun kullanıldığı varsayılarak, başarısız bir hedef dışı enjeksiyon olarak kabul edilmelidir. Bunun nedeni iğnenin yeterince uzağa sokulmamasından veya orta hatta yanal olmasından kaynaklanabilir.

Başarılı enjeksiyonlardan gözlemlenen ekspresyon paternleri, örnek olarak aşağıdaki sekiz faktöre bağlı olarak farklılık gösterebilir: (1) enjeksiyon yaşı, (2) önceden var olan bağışıklık, (3) infüzyon hızı, (4) gen terapisi vektörü, (5) gen terapisi dozu, (6) hücre yüzey proteinleri, (7) tropizm ve (8) varsa, transgen ekspresyonunu yönlendirmek için uygun bir promotör seçimi⁶. Ekspresyon paternleri farklılık gösterebilse de, doz AAV9 gibi etkili bir vektörle yeterince yüksek olduğu sürece geniş, eşit, yaygın dağılım evrensel olacaktır.

Lomber IT enjeksiyon başarısını doğrulamak için histolojik analiz kullanmanın başlıca sınırlamaları, uzun bekleme süreleri - nekropsiler yapıldıktan ve doku toplandıktan sonra bir çalışmanın sonuna kadar beklemek - ve büyük bir gen terapisi çalışmasında tüm farelerden alınan dokuyu işlemek için gereken kapsamlı kaynaklardır. Ne yazık ki, deneyimlerimiz, pozitif veya negatif bir enjeksiyonun anlık ve doğrudan göstergelerinin güvenilmez olabileceği yönündedir; Bununla birlikte, iğne intratekal boşluğa girerken kuyruk hareketi refleksi, gerçek zamanlı olarak başarılı konumlandırmanın iyi bir göstergesidir ve muhtemelen başarılı bir enjeksiyonu gösterir. İğne, anestezi uygulanmamış bir fare/sıçanda cildi delerken, intratekal boşluğa giren iğneye kuyruk hareketi tepkisi ile bir seğirmeyi karıştırmayın. NMDA, P maddesi ve lidokain gibi farmakolojik ajanların eğitimde veya deneysel enjeksiyon çözeltisi ile karıştırılarak kullanılmasının, enjeksiyon başarısının daha acil bir göstergesini sağladığı bildirilmiştir ^9,11,24. Bu ajanlar göz önüne alındığında, gen terapisi vektörü ile uyumluluklarını değerlendirmek önemlidir.

Lomber IT enjeksiyonu, CNS hastalıklarının^tedavisi için BOS'a güvenilir bir şekilde bir gen terapisi vektörü ileten hızlı ve minimal invaziv bir prosedürdür ^5,6. Prosedür translasyonel olarak ilgilidir ve burada açıklanan protokol, yenidoğanlardan yetişkinlere kadar her yaştaki farelerde ve sıçanlarda bu uygulama yolunun nasıl gerçekleştirileceğini detaylandırır. Bu protokolü, her yaştan fareler ve sıçanlar için tanımlamak, destekleyici videolar sağlamanın yanı sıra, araştırmacılara gen terapisi uygulaması için bu yöntemin benimsenmesinde yardımcı olmak önemlidir. Laboratuvarımızın deneyimi, bu protokolün zaman içinde birden fazla kullanıcı ve çalışmada tutarlı bir şekilde uygulanabileceği yönündedir 18,25,26,27,28,29,30.

Genç farelerde/sıçanlarda lomber IT enjeksiyonu yapılırken yaşlı farelere/sıçanlara kıyasla önemli farklılıklar vardır, en önemlisi iğnenin omurgaya sokulduğu açı ve enjekte edilen önerilen hacim. Bildirilen lomber IT enjeksiyon hacimleri, çalışmalar arasında ve türler arasında önemli ölçüde farklılık göstermektedir³¹. BOS ve serebral kan akışını tehlikeye atabilecek, rahatsızlığa neden olabilecek ve hidrosefali, iskemi, hücresel hasar ve ölüm dahil olmak üzere kronik nörolojik komplikasyonlara yol açabilecek intrakraniyal basınçta (ICP) uzun süreli yükselmeleri önlemek için enjeksiyon hacminin dikkate alınması önemlidir^32,33. ICP, vücut ağırlığı ile doğrudan ilişkilendirilemeyen BOS, serebral kan ve CNS dokusunun hacmi ile belirlenir. Normal işleyişte, ICP, BOS hacmi, serebral kan hacmi, solunum, vücut pozisyonu, BOS üretim hızı ve BOS kana BOS drenaj hızı dahil olmak üzere birçok faktör tarafından otoregüle edilir^33,34. Bu nedenle, IT enjeksiyon hacimleri vücut ağırlığı ^25,27,28,30 yerine BOS özelliklerine (Tablo 1) göre belirlenmelidir. Her türde her yaşta enjekte edilmesi önerilen hacimler kalın harflerle belirtilmiştir.

Tablo 1: Farklı yaşlardaki fareler ve sıçanlar için lomber IT enjeksiyon hacimlerinin özeti. Kalın değerler önerilir ve güvenli bir şekilde teslim edilmiştir. Mümkün olan maksimum hacimler resmi olarak değerlendirilmemiştir. Farelerde ve sıçanlarda bilinen BOS parametreleri (toplam hacim, üretim hızı, ciro ve intrakraniyal basınç) hakkında ek bilgiler referans olarak dahil edilmiştir.

Tek seferlik bolus IT enjeksiyon hacimleri için üst eşik ile ilgili olarak alan genelinde bilgi eksikliği vardır. BOS hacminin bilindiği yetişkin insanlarda, sıçanlarda ve farelerde, toplam BOS hacminde% 30'luk bir artışın kronik yaralanma veya hastalıklara neden olduğu görülmemektedir 31,33,35,36. Juvenil veya neonatal farelerde bilinen BOS hacimlerinin olmaması, benzer bir ekstrapolasyonu imkansız hale getirir. Bazı gruplar genç hayvanlarda BOS hacmine ve üretimine bakmaya başlıyor³⁷. Bu alanlardaki ek araştırmalar doğrulanana kadar, enjeksiyon hacmi araştırmacı tarafından bildirilen değerlere tabi olmaya devam edecektir.

Fareler ve sıçanlar, özellikle daha genç yaşlarda veya yüksek enjeksiyon hacimleriyle tedavi edildiklerinde, kasların esnemesine, uzuvların uzamasına, hızlı nefes almaya veya birkaç dakika içinde kendi kendine çözülmesi gereken geçici arka ayak felcine neden olabilir. Aşırı durumlarda, akut ICP yükselmeleri ölümcül olabilen kardiyovasküler ve solunum anormalliklerine neden olabilir^32,33. 24 saat sonra herhangi bir işlem sonrası anormallik devam ederse, fareler / sıçanlar çalışmadan çıkarılmalı ve insancıl bir şekilde ötenazi yapılmalıdır. İğne çok uzağa sokulursa ve omuriliği etkilerse kalıcı arka bacak felci meydana gelebilir. Bu, lomber IT enjeksiyonu yapılırken yapılan yaygın bir hatadan kaynaklanabilir: pistona basarken kuyruk hareketinden sonra şırınganın hareketi. Şırınga ve iğne hareketinden kaçınılmalıdır. İlk delinme ile doğru pozisyon elde edilemezse, aynı yerde ikinci bir deneme yapılabilir. İkinci deneme de başarısız olursa, bir sonraki intervertebral boşluğu hedeflemek için iğne pozisyonunu değiştirmeyi deneyin. Birden fazla iğne çubuğunun daha sonra başarılı bir enjeksiyonun sızmasına neden olabileceğini unutmayın.

Lomber IT enjeksiyonunda uzmanlaşmak zaman alabilir. Enjeksiyonları bir terminal prosedürü olarak uygulamak için, Evans mavisi veya 0.2 mikron filtrelenmiş McCormick yeşil boyası (Şekil 3) gibi onaylanmış bir boya çözeltisi kullanarak veya Temsili Sonuçlar bölümünde ele alınan farmakolojik ajanlarla yukarıdaki protokolü izleyin. Enjeksiyonda sorun gidermek ve ustalaşmak için boya kullanılması önerilir, çünkü bir enjeksiyonun başarılı mı yoksa başarısız mı olduğunu 1 dakika içinde söylemek kolaydır. Boya ile uygulama sadece hayatta kalmayan prosedürler içindir, çünkü hayvanlar doğrudan CNS'ye uygulandığında boyaya karşı bir reaksiyon geliştirebilir. Bu reaksiyon, başarılı bir enjeksiyondan sonraki bir dakika içinde ortaya çıkabilir ve hızlı kaşıntı ve kıvranma hareketleri ile karakterizedir. Rahatsızlığı en aza indirmek için bu reaksiyon gözlendiğinde hayvanlara hemen ötenazi yapılmalıdır. Başarılı bir uygulama boya enjeksiyonundan sonra, boya omurgada lokalize kalacaktır (yakındaki periferik dokuda boya yoktur) ve omurgayı beyincik, beyin ve koku alma ampullerine doğru hareket ettirecektir. P1'de cilt, boyanın kuyruktaki omurgadan aşağı doğru hareket ettiği görülebilecek kadar şeffaftır. Boya birkaç dakika içinde beyne ulaşmazsa, enjeksiyon başarısız olur.

Şekil 3: Başarılı lomber IT enjeksiyonları sonrası beyindeki McCormick yeşil boyası. Tüm beyinler, 5 μL boya enjekte edilen P21 farelerinden alınır ve ventral görünümde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Viral titre ve dozlar gibi klinik öncesi araştırma tasarımı için ilgili ilişkili parametreler hakkında ek bilgi için, daha önce yayınlanmış incelemelere^{bakın 3,6,31}.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

AAV9 vektörünü ürettiği için UT Güneybatı AAV Viral Vektör Çekirdek Tesisine ve Şekil 2'de sunulan dokuyu işlediği ve boyadığı için Gray Lab'da Araştırma Bilimcisi Yuhui Hu'ya teşekkür ederiz.