הזרקה תוך-מותנית של וקטורים של ריפוי גנטי למיקוד מערכת העצבים המרכזית בעכברים וחולדות

זריקה תוך-מותנית מייצגת דרך מתן רלוונטית לתרגום למתן טיפול גנטי למערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול סטנדרטי מקיף זה לזריקות תוך-מותניות בעכברים וחולדות בילודים, צעירים ובוגרים נועד להנחות חוקרים באימוץ טכניקה זו למחקרי ריפוי גנטי פרה-קליניים.

שיטה אחת להתמקד במערכת העצבים המרכזית לטיפול במחלות נוירולוגיות כוללת שימוש בנתיב המתן המותני. גישה זו עוקפת את מחסום הדם-מוח כדי לגשת ישירות לנוזל המוח והשדרה ולהעדיף לכוון לתאים בתוך מערכת העצבים המרכזית. מחקרים פרה-קליניים רבים שפורסמו המשתמשים במסלול ההזרקה התוך-מותני תרמו לפיתוח ניסויים קליניים בריפוי גנטי; עם זאת, הפרוטוקולים המתוארים משתנים ומפוזרים על פני משאבים מרובים. כאן, מוצגת קבוצה מקיפה של פרוטוקולים לזריקות תוך-מותניות בעכברים וחולדות בילודים, צעירים ובוגרים למחקרי ריפוי גנטי פרה-קליניים. עם הכשרה נכונה, ניתן לבצע טכניקת הזרקה זו במהירות ובאמינות. בנוסף לפירוט פרוטוקול ההזרקה בכל שלב התפתחותי, נדונים פרמטרים נלווים, כגון נפח ההזרקה, שיכולים להשפיע על תוצאות המחקר. כדי להדגים את היישום של זריקות תוך-מותניות להתמקדות במערכת העצבים המרכזית, הביטוי של סרוטיפ 9 של נגיף הקשור לאדנו במוח, בחוט השדרה וברקמות ההיקפיות מוצג לאחר הזרקה מוצלחת או לא מוצלחת.

אתגר בטיפול במחלות נוירולוגיות הדורשות אספקת מערכת העצבים המרכזית הגלובלית (CNS) אך מועמדות טובות לריפוי גנטי מיוחס במידה רבה למיקוד לא יעיל של מערכת העצבים המרכזית וסוגי תאים רלוונטיים¹. כמות משמעותית של מחקר נמשכת כדי לייעל את מיקוד התאים והרקמות הגלובליים של מערכת העצבים המרכזית על ידי רכבי אספקה הנדסיים ^1,2. עם זאת, עדיין ניתן להשיג העברת וקטור נרחבת למדי עם הטכנולוגיה הנוכחית של וקטור ריפוי גנטי, תוך שימוש בשילובים מסוימים של וקטורים ויראליים ודרכי מתן ^3,4. תקן הזהב הנוכחי להשגת אספקה נרחבת של מערכת העצבים המרכזית מטיפול חד פעמי הוא שימוש בסרוטיפ 9 של נגיף הקשור לאדנו-(AAV9) יחד עם הזרקה ישירה לנוזל המוח (CSF).

ישנם שלושה דרכי מתן אופייניות לזריקות CSF ישירות: תוך-תקל מותני (IT), תוך-מוחי (ICV) ותוך ציסטרנלי (ICM)⁵. כל אחד מדרכי המתן הללו מביא לדפוסי הפצה ביולוגיים שונים במערכת העצבים המרכזית וברקמות ההיקפיות, אך לכולם יש את היתרון של עקיפת מחסום הדם-מוח (BBB) כדי להגיע לתאים במערכת העצבים המרכזית התורמים לפתולוגיה של מחלות נוירולוגיות ופנוטיפים⁶. הזרקת ה-IT המותני היא הסטנדרט לשימוש במתן תרופות קליניות בבני אדם, שכן ההליך הקליני הוא שגרתי ופשוט, עם פחות פולשניות בהשוואה לזריקות ICV ו-ICM.

הזרקת ה-IT המותני היא טכניקה מבוססת המשמשת בקלות בתחומי ההרדמה ומשככי הכאבים, כאשר המאמר הראשון פורסם בשנת 1885⁷. הפרוטוקול הראשון להזרקות IT מותני בעכברים בוגרים פורסם בשנת 1980⁸, ומאז הוא אומץ ונבדק באופן נרחב⁹. התאמות או שיפורים קלים בפרוטוקולים אלה בוצעו 10,11,12, כולל טכניקה לשימור מוצר¹³. פרוטוקולים להזרקות IT מותני בחולדות בוגרות פורסמו גם הם לראשונה בשנת 1976, עם צנתור למתן כרוני¹⁴ והזרקה ישירה לטיפולים חד פעמיים¹⁵. לאחרונה, קבוצות פרסמו פרוטוקולים להזרקות IT מותני בעכברים וחולדות יילודים או צעירים^16,17.

אימוץ ותיקוף נרחב של טכניקה זו כדי לעקוף את תאי ה-BBB ותאי המטרה במערכת העצבים המרכזית הובילו למספר מחקרים פרה-קליניים וקליניים מוצלחים לטיפול במחלות נוירולוגיות. נתוני יעילות ובטיחות חיוביים בעכברים, חולדות ופרימטים לא אנושיים המודלים מחלות נוירולוגיות עוררו התרגשות ועניין סביב פוטנציאל התועלת הקלינית למחלות אלה 18,19,20,21,22,23. קומץ מהמחקרים הללו נמצאים כעת בניסויים קליניים (לדוגמה, מזהי clinicaltrials.gov NCT02362438, NCT04737460, NCT03381729 ו-NCT05518188)^3,6. במאמר זה מתואר פרוטוקול פשוט להזרקות IT מותני בעכברים וחולדות בגילאים שונים, מבלי להסיר CSF, שניתן לאמץ לפרויקטים של ריפוי גנטי תרגומי. פרוטוקול זה דומה לפרוטוקולים שכבר זמינים ומאומצים באופן נרחב; עם זאת, יש ערך בציטוט הפרוטוקולים הרלוונטיים הללו במקום אחד לגישה ועיון נוחים, יחד עם הוויזואליה הנלווית לווידאו. פרוטוקול זה מסביר את ההזרקה לעכברים וחולדות יילודים ביום שלאחר הלידה (P) 0-1 ולעכברים וחולדות צעירים P21, עם תוצאות מייצגות מהזרקת IT מותני מוצלחת ולא מוצלחת ב-P1 בעכברים. בדיון נדונים טעויות נפוצות ופרטים ספציפיים הדורשים תשומת לב קפדנית בעת ביצוע הליך זה, כמו גם המלצות כיצד לתרגל זריקות אלו לפני תחילת מחקר פרה-קליני.

הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן. עכברים זכרים ונקבות מסוג C57BL6/J, בגילאי P1-P28, שימשו לפרוטוקולים הכוללים עכברים. חולדות זכר ונקבה מסוג Sprague-Dawley, בגילאי P1-P56, שימשו לפרוטוקולים הכוללים חולדות. מלבד ניתוח ההישרדות המתואר בסעיף 3, כל שאר ההליכים נחשבים כגורמים לאי נוחות רגעית בלבד ואינם דורשים שימוש בחומרי הרדמה או משככי כאבים. אנשים צריכים לעקוב אחר חיות מעבדה ליותר מאי נוחות רגעית ולבקש הדרכה מה-IACUC והצוות הווטרינרי שלהם לגבי הצורך בחומרי הרדמה ומשככי כאבים. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים מסופקים בטבלת החומרים.

1. הזרקת IT מותני של עכברים >P21

1. הכנה
   1. הכינו את תמיסות ההזרקה, כולל וקטור הטיפול הגנטי בריכוז/ים הרצויים ותמיסת בקרה (בדרך כלל מאגר הפורמולציה המשמש לייצור וקטור). תמיסות ההזרקה צריכות להיות סטריליות ולהישאר סטריליות לאורך כל ההליך.
      הערה: יש לשמור את כל התמיסות על קרח למשך ההליך.
   2. אסוף וחטא את כל החומרים, כולל מזרק ומחט, פיפטה ותמיסת הזרקה. פעל לפי הנחיות מוסדיות לגבי שימוש בארונות בטיחות ביולוגית וחשיפה להזרקה. הנהלים המתוארים כאן נערכו בארון בטיחות ביולוגית מסוג 2.
   3. בעזרת פיפטה מיקרוליטר מודדים את הנפח הרצוי של תמיסת ההזרקה ומעבירים אותו לסרט פרפין סטרילי. נפח הזרקה של 5 מיקרוליטר נמצא בשימוש נפוץ ומתייחס אליו כנפח היעד לעכברים בוגרים >P21 (טבלה 1).
      הערה: ניתן להגביר את עוצמת הקול במידת הצורך; עם זאת, יש לעקוב מקרוב אחר בעלי חיים לאיתור תגובות שליליות לכמויות הזרקה גדולות יותר. עיין בסעיף הדיון לפרטים על נפח ההזרקה ותגובות שליליות. ניתן גם להעביר את התמיסה ישירות מקצה הפיפטה למזרק, או להשתמש במזרקי מיקרוליטר אטומים לגז כדי למדוד ישירות את נפח תמיסת ההזרקה.
   4. משוך את התמיסה למזרק מיקרוליטר עם מחט 30 גרם 0.5 אינץ', היזהר לא למשוך בועות אוויר.
      הערה: מד המחט ואורכו יכולים להשפיע על חדירת העור. כאשר בוחנים את גודל המזרק לשימוש, נפח ההזרקה לא צריך להיות פחות מ-10% מקיבולת המזרק. עבור נפחים גדולים מ-50% מקיבולת המזרק, ודא שניתן ללחוץ על הבוכנה בקלות עם האצבע המורה. אם לא ניתן ללחוץ על הבוכנה בקלות, השתמש במזרק בעל קיבולת גדולה יותר.
2. ריסון
   1. בעזרת היד הדומיננטית, החזיקו את העכבר המודע (הלא מורדם) בזנב על מגבת נייר. מגבת הנייר תעזור לרסן, להרגיע ולמנוע מהעכבר לנשוך. העכבר צריך להיות במצב נוטה ניטרלי כשההיבט הצדדי של הגוף פונה אליך.
      הערה: אין צורך לאמן או להרגיל עכברים לריסון זה לפני ההליך. עכברים עשויים להיאבק בגלל איפוק אך לא צריכים לעורר תגובת כאב ספציפית. אם נצפות יותר מתגובות כאב רגעיות, ייתכן שיהיה צורך במתן משככי כאבים; פנה להדרכה וטרינרית.
   2. ביד הלא דומיננטית, קפלו חלק ממגבת הנייר על הראש ופלג הגוף העליון של העכבר ותפסו בחוזקה את חגורת האגן בין האגודל הלא דומיננטי לאצבע המורה. ודא שכף היד מכוסה, מונחת סביב ראש העכבר. פסגת הכסל של העכבר צריכה להיות מוחשית וממוקמת במרכז הפלנקס הדיסטלי של כל אצבע (איור 1A,B).
      הערה: ריסון מהיד או ממגבת נייר לא אמור לפגוע בנשימה.
   3. סובב בעדינות את בסיס הזנב כדי להבטיח יישור נכון של עמוד השדרה. אגן העכבר צריך להיות מרובע, כך שתהליכי החוליות של עמוד השדרה המותני יהיו בניצב למשטח העבודה.
   4. ספוג את אזור המותני הגבי של העכבר עם כרית הכנה של 70% אלכוהול.
   5. חלק את השיער ~2-6 מ"מ גולגולת לפסגת הכסל כדי לעזור לדמיין את מיקום ההזרקה.
   6. הרגישו את החלל הבין חולייתי L4-L5 או L5-L6, ~ 2-6 מ"מ גולגולת לפסגת הכסל.
      הערה: המרחק המדויק משתנה בהתאם לגודל וגיל העכבר.
3. זריקה
   1. בעזרת היד הדומיננטית, החזק את מרכז מזרק המיקרוליטר ומקם אותו בניצב לעמוד השדרה של העכבר בחלל הבין חולייתי L4-L5 או L5-L6. ודא שניתן ללחוץ על הבוכנה של המזרק עם האצבע המורה ללא תנועה מוגזמת של היד. כששיפוע המחט פונה לראש העכבר, יש לנקב את העור מעל החלל הבין חולייתי.
   2. כאשר שולי העצם סביב החלל הבין חולייתי מורגשים בקצה המחט, הפחיתו את זווית המזרק ל-30-45 מעלות (איור 1A).
   3. המחט צריכה להחליק לחלל הבין חולייתי ולגרום להחלקת זנב פתאומית, ויש להדק אותה בחוזקה בין החוליות.
   4. הקפד לא לעקור את המזרק, לחץ על הבוכנה בהתמדה כדי לספק את התמיסה תוך 10 שניות.
   5. החזק את המזרק במקומו למשך 15-30 שניות לאחר לחיצה מלאה על הבוכנה כדי לאפשר פיזור של התמיסה ולמנוע זרימה חוזרת.
   6. משוך בצורה חלקה ואיטית את המזרק מהעכבר באותה זווית כניסה של 30-45 מעלות. כאשר המחט נמשכת, סובב את המזרק כדי למנוע זרימה חוזרת.
      הערה: היזהר לא לקדם את המחט בעת סיבוב המזרק, מכיוון שהדבר עלול לגרום לנזק פיזי לחוט השדרה.
   7. שחרר את העכבר מהריסון והחזיר אותו לכלוב הביתי.
   8. עקוב אחר העכבר לאחר ההזרקה לאיתור אמבולציה חריגה, ליקוי מוטורי, הפרעות נשימה וקואורדינציה. ראה את הדיון לפרטים נוספים לגבי תגובות שליליות.
   9. נקה ציוד בהתאם להמלצות היצרן. עבור זריקות מרובות, מומלץ להשתמש במזרקים שונים עבור כל וקטור טיפול גנטי ותמיסת בקרה.
      הערה: ניתן לנקות, לעקר ולעשות שימוש חוזר במחטים נשלפות מספר פעמים; עם זאת, אין להשתמש במחטים עמומות מכיוון שהן עלולות לפגוע בבעל החיים ולהגביר את הסבירות להחמצת זריקות. מחט עמומה לא תנקב את העור בקלות ויש להשליך אותה כראוי. אם המזרקים מוגבלים, מומלץ להשלים את כל הזריקות לרכב לפני שממשיכים לווקטור הטיפול הגנטי ולהזריק את המינון הנמוך ביותר של טיפול גנטי לפני מתן מינונים גבוהים יותר.
   10. עקוב אחר הנחיות מוסדיות לעיקור ציוד בין בעלי חיים.

איור 1: סכמטי של מיקום האצבע והמזרק עבור הזרקה תוך-תקלית מותנית בעכברים וחולדות. (A) מבט רוחבי של עכבר >P21 המראה את מיקום המחט ומעבר זווית המזרק במהלך הזרקת IT מותני. האליפסה האדומה המקווקו מציינת את מיקום האצבע מעל פסגת הכסל של העכבר. תצוגה מוגדלת של עמוד השדרה מציגה את החלל התוך-תאי (כחול) עם מיקום מחט משוער (חץ ירוק) ואת חוט השדרה (ורוד). מבט גבי של (B) עכבר >P21, (C) עכבר D) חולדה >P21, עם נקודות ייחוס למיקום מחט (עיגול ירוק), חגורת אגן (אליפסה צהובה מקווקו) ומיקום אצבעות (אליפסה אדומה מקווקו). אתר החתך והמחזירים מתוארים גם ב-(D). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הזרקת IT מותני של עכברים וחולדות

למרות שגורמים רבים יכולים להשפיע על התמרת וקטור ריפוי גנטי, צביעה היסטולוגית של רקמות נותרה השיטה המדויקת ביותר לקביעת ההצלחה של זריקות תוך-מותניות (IT). פיזור רחב ואחיד של וקטור הריפוי הגנטי בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) לאחר ההזרקה מעיד על הליך מוצלח. איור 2C מייצג הזרקה מוצלחת של טיפול גנטי משלים עצמי בתיווך AAV9 המניע ביטוי טרנסגנים חלש בכל מקום תחת מקדם JeT במינון של 1.3 ×^{10 11} vg לעכבר בעכברים יילודים (P1), 4 חודשים לאחר ההזרקה. ניתוח RNAscope, באמצעות בדיקה המכוונת לטרנסגן המועבר על ידי הטיפול הגנטי, חושף פיזור רחב בחוט השדרה המותני, חוט השדרה הצווארי והמוח. חלק מהכבד והלב כלול כדי להדגיש שאפילו עם הזרקה ישירה של נוזל המוח השדרתי (CSF), וקטור הריפוי הגנטי עדיין יכול להיות מופץ לרקמות היקפיות.

איור 2: קטעי רקמה מוכתמים של 5 מיקרון של מערכת העצבים המרכזית של העכבר ורקמה היקפית 4 חודשים לאחר ההזרקה ב-P1. צביעה אדומה מצביעה על ביטוי טרנסגנים באמצעות RNAscope, וצביעה כחולה של גרעינים נעשית באמצעות המטוקסילין. (A) הזרקה עם מאגר ניסוח בקרה. (B) הזרקה תוך-פרנכימלית לא מוצלחת עם וקטור AAV9 (scAAV9_JeT-h DDX3Xopt-SpA). (C) הזרקת IT מותנית מוצלחת עם וקטור AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). וקטור הריפוי הגנטי המשמש ב-(B) ו-(C) ניתן במינון רלוונטי לתרגום של 1.3E11 vg/עכבר. סרגל קנה מידה: פאנל עליון (5 מ"מ); לוח תחתון (1 מ"מ). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ביטוי מרוכז בחוט השדרה המותני בשילוב עם חוסר ביטוי במוח, כפי שמוצג באיור 2B, עשוי להצביע על הזרקה תוך-פרנכימלית של חוט השדרה ויש להתייחס אליו כזריקה כושלת. זה קורה כאשר המחט מוחדרת רחוק מדי לתוך עמוד השדרה, מעבר לחלל התוך-תקלי ולתוך חוט השדרה. בנוסף, ביטוי נמוך מאוד או ללא ביטוי בחוט השדרה ובמוח (לא מוצג) צריך להיחשב גם כזריקה כושלת מחוץ למטרה, בהנחה שנעשה שימוש בווקטור ומינון כאשר צפויה התפלגות רחבה של מערכת העצבים המרכזית. זה יכול להיות בגלל אי החדרת המחט מספיק רחוק או מהיותה לרוחב לקו האמצע.

דפוסי הביטוי שנצפו מהזרקות מוצלחות יכולים להיות שונים בשל שמונת הגורמים הבאים כדוגמאות: (1) גיל בעת ההזרקה, (2) חסינות קיימת, (3) קצב עירוי, (4) וקטור טיפול גנטי, (5) מינון של טיפול גנטי, (6) חלבונים על פני התא, (7) טרופיזם, ו-(8) אם רלוונטי, בחירת מקדם מתאימה להנעת ביטוי טרנסגנים⁶. בעוד שדפוסי הביטוי יכולים להיות שונים, התפוצה הרחבה, האחידה והנרחבת תהיה אוניברסלית כל עוד המינון גבוה מספיק עם וקטור יעיל, כגון AAV9.

המגבלות העיקריות של שימוש בניתוח היסטולוגי כדי לאשר את הצלחת הזרקת ה-IT המותני הן זמני ההמתנה הארוכים - המתנה לסוף המחקר, לאחר ביצוע נתיחות ואיסוף רקמות - ומשאבים נרחבים הדרושים לעיבוד רקמה מכל העכברים במחקר ריפוי גנטי גדול. למרבה הצער, הניסיון שלנו מלמד שאינדיקטורים מיידיים וישירים לזריקה חיובית או שלילית יכולים להיות לא אמינים; עם זאת, רפלקס תנועת הזנב כאשר המחט נכנסת לחלל התוך-תקלי הוא אינדיקטור טוב למיקום מוצלח בזמן אמת וככל הנראה מעיד על הזרקה מוצלחת. אל תבלבלו עווית כאשר המחט חודרת את העור בעכבר/חולדה לא מורדמת עם תגובת תנועת זנב למחט הנכנסת לחלל התוך-תקלי. דווח כי השימוש בתרופות פרמקולוגיות כגון NMDA, חומר P ולידוקאין, בין אם באימונים או בשילוב עם תמיסת ההזרקה הניסיונית, מספק אינדיקציה מיידית יותר להצלחת ההזרקה ^9,11,24. אם בוחנים חומרים אלה, חשוב להעריך את תאימותם לווקטור הטיפול הגנטי.

הזרקת ה-IT המותני היא הליך מהיר וזעיר פולשני המעביר באופן אמין וקטור טיפול גנטי לתוך ה-CSF לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית ^5,6. ההליך רלוונטי מבחינה תרגמית, והפרוטוקול המתואר כאן מפרט כיצד לבצע דרך מתן זו בעכברים וחולדות בכל הגילאים, מיילודים ועד בוגרים. חשוב להגדיר פרוטוקול זה עבור עכברים וחולדות בכל הגילאים, יחד עם מתן סרטונים תומכים, כדי לסייע לחוקרים באימוץ שיטה זו למתן ריפוי גנטי. הניסיון של המעבדה שלנו הוא שניתן ליישם פרוטוקול זה באופן עקבי על משתמשים מרובים ומחקרים לאורך זמן 18,25,26,27,28,29,30.

ישנם הבדלים חשובים בעת ביצוע הזרקת IT מותני בעכברים/חולדות צעירים יותר בהשוואה לעכברים/חולדות מבוגרים יותר, בעיקר הזווית שבה המחט מוחדרת לעמוד השדרה והנפח המומלץ המוזרק. נפחי הזרקת ה-IT המותניים המדווחים משתנים במידה ניכרת בין מחקרים ובין מינים³¹. התחשבות בנפח ההזרקה חשובה כדי למנוע עליות ארוכות טווח בלחץ התוך גולגולתי (ICP), שעלולות לפגוע בזרימת CSF ודם מוחי, לגרום לאי נוחות ולהוביל לסיבוכים נוירולוגיים כרוניים, כולל הידרוצפלוס, איסכמיה, פגיעה תאית ומוות^32,33. ICP נקבע על ידי נפח ה-CSF, הדם המוחי ורקמת ה-CNS, שלא ניתן לתאם ישירות למשקל הגוף. בתפקוד תקין, ה-ICP מווסת אוטומטית על ידי גורמים רבים, כולל נפח CSF, נפח דם מוחי, נשימה, תנוחת גוף, קצב ייצור CSF וקצב ניקוז CSF לדם ^33,34. לכן יש לקבוע את נפחי הזרקת ה-IT על סמך מאפייני CSF (טבלה 1) במקום משקל גוף 25,27,28,30. נפחים מומלצים להזרקה בכל גיל בכל מין מצוינים בהדגשה.

טבלה 1: סיכום נפחי הזרקת IT מותני לעכברים וחולדות בגילאים שונים. ערכים מודגשים מומלצים ונמסרו בבטחה. הנפחים המרביים האפשריים לא הוערכו רשמית. מידע נוסף על פרמטרים ידועים של CSF - נפח כולל, קצב ייצור, תחלופה ולחץ תוך גולגולתי - בעכברים וחולדות כלול לעיון.

קיים חוסר ידע ברחבי התחום לגבי הסף העליון לנפחי הזרקת IT בולוס חד פעמיים. בבני אדם בוגרים, חולדות ועכברים שבהם נפח CSF ידוע, נראה כי עלייה של 30% בנפח ה-CSF הכולל אינה גורמת לפציעה כרונית או למחלות 31,33,35,36. היעדר נפחי CSF ידועים בעכברים צעירים או יילודים הופך אקסטרפולציה דומה לבלתי אפשרית. קבוצות מסוימות מתחילות להסתכל על נפח וייצור CSF בבעלי חיים צעירים^{יותר 37}. עד שיוכחו חקירות נוספות בתחומים אלה, נפח ההזרקה ימשיך להיות כפוף לערכים המדווחים על ידי החוקרים.

עכברים וחולדות, במיוחד כאשר הם מטופלים בגילאים צעירים יותר או עם נפחי הזרקה גבוהים, עלולים לעורר כיפוף שרירים, הארכת גפיים, נשימה מהירה או שיתוק זמני בגפיים האחוריות שאמור להיפתר מעצמו תוך מספר דקות. במקרים קיצוניים, עלייה חריפה ב-ICP עלולה לגרום להפרעות לב וכלי דם ונשימה, שעלולות להיות קטלניות^32,33. אם חריגות כלשהן לאחר ההליך נמשכות לאחר 24 שעות, יש להוציא את העכברים/חולדות מהמחקר ולהמית אותם בהמתת חסד אנושית. שיתוק מתמשך בגפיים האחוריות יכול להתרחש אם המחט מוחדרת רחוק מדי, ומשפיעה על חוט השדרה. זה יכול לנבוע מטעות נפוצה בעת ביצוע הזרקת IT מותני: תנועת המזרק לאחר החלקת הזנב תוך כדי לחיצה על הבוכנה. יש להימנע מתנועת מזרק ומחט. אם לא ניתן להשיג את המיקום הנכון עם הפנצ'ר הראשוני, ניתן לבצע ניסיון שני באותו מיקום. אם גם הניסיון השני לא מצליח, נסה לשנות את מיקום המחט כדי למקד לחלל הבין חולייתי הבא. שימו לב שמספר דקירות מחט עלול להוביל לדליפה של הזרקה מוצלחת לאחר מכן.

להיות מיומן בהזרקת IT מותני יכול לקחת זמן. כדי לתרגל את ההזרקות כהליך טרמינלי, עקוב אחר הפרוטוקול לעיל באמצעות תמיסת צבע מאושרת, כגון כחול אוונס או צבע ירוק מקורמיק מסונן 0.2 מיקרון (איור 3) או עם התרופות המטופלות בסעיף התוצאות המייצגות. מומלץ להשתמש בצבע כדי לפתור בעיות ולשלוט בהזרקה מכיוון שקל לדעת אם ההזרקה הייתה הצלחה או כישלון תוך דקה אחת. תרגול עם צבע הוא להליכים שאינם הישרדות בלבד, מכיוון שבעלי חיים יכולים לפתח תגובה לצבע כאשר הם ניתנים ישירות למערכת העצבים המרכזית. תגובה זו יכולה להתרחש תוך דקה מהזרקה מוצלחת ומאופיינת בתנועות גירוד והתפתלות מהירות. יש להמית את בעלי החיים מיד לאחר שנצפתה תגובה זו כדי למזער את אי הנוחות. לאחר הזרקת צבע מוצלחת, הצבע יישאר ממוקם בעמוד השדרה (ללא צבע ברקמה ההיקפית הסמוכה), ויעבור במעלה עמוד השדרה אל המוח הקטן, המוח הקטן ונורות הריח. ב-P1, העור שקוף מספיק כך שניתן לראות את הצבע נע במורד עמוד השדרה בזנב. אם הצבע לא מגיע למוח תוך מספר דקות, ההזרקה נכשלת.

איור 3: צבע ירוק מקורמיק במוח לאחר תרגול מוצלח של הזרקות IT מותני. כל המוחות הם מעכברי P21 שהוזרקו להם צבע של 5 מיקרוליטר ומוצגים במבט הגחוני. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

למידע נוסף על פרמטרים רלוונטיים הקשורים לתכנון ניסויים פרה-קליניים, כמו טיטר ומינונים ויראליים, ראה סקירות שפורסמו בעבר ^3,6,31.

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

ברצוננו להודות למתקן הליבה הווקטורי הנגיפי של UT Southwestern AAV על ייצור וקטור AAV9 ול-Yuhui Hu, מדען מחקר במעבדה האפורה, על עיבוד וצביעה של הרקמה המוצגת באיור 2.