Injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos

Uma injeção intratecal lombar representa uma via de administração translacionalmente relevante para administrar terapia gênica ao sistema nervoso central. Este protocolo padronizado abrangente para injeções intratecais lombares em camundongos e ratos neonatais, juvenis e adultos visa orientar os pesquisadores na adoção dessa técnica para estudos pré-clínicos de terapia gênica.

Um método para atingir o sistema nervoso central para o tratamento de doenças neurológicas envolve a utilização da via de administração intratecal lombar. Essa abordagem contorna a barreira hematoencefálica para acessar diretamente o líquido cefalorraquidiano e, preferencialmente, atingir as células do sistema nervoso central. Vários estudos pré-clínicos publicados empregando a via de injeção intratecal lombar contribuíram para o desenvolvimento de ensaios clínicos de terapia genética; no entanto, os protocolos descritos são variáveis e dispersos em vários recursos. Aqui, é apresentado um conjunto abrangente de protocolos para injeções intratecais lombares em camundongos e ratos neonatais, juvenis e adultos para estudos de terapia gênica pré-clínica. Com treinamento adequado, essa técnica de injeção pode ser realizada de forma rápida e confiável. Além de detalhar o protocolo de injeção em cada estágio de desenvolvimento, são discutidos parâmetros associados, como volume de injeção, que podem influenciar os resultados do estudo. Para demonstrar a aplicação de injeções intratecais lombares para atingir o sistema nervoso central, a expressão do sorotipo 9 do vírus adeno-associado no cérebro, medula espinhal e tecidos periféricos é apresentada após uma injeção bem-sucedida ou malsucedida.

Um desafio no tratamento de doenças neurológicas que requerem entrega global do sistema nervoso central (SNC), mas são boas candidatas à terapia gênica, tem sido amplamente atribuído ao direcionamento ineficiente do SNC e dos tipos de células relevantes¹. Uma quantidade substancial de pesquisas está em andamento para otimizar o direcionamento global de células e tecidos do SNC por meio de veículos de entrega de engenharia ^1,2. No entanto, a entrega de vetores razoavelmente difundida ainda pode ser alcançada com a atual tecnologia de vetores de terapia genética, usando certas combinações de vetores virais e vias de administração ^3,4. O padrão-ouro atual para obter a entrega generalizada do SNC a partir de um tratamento único é usar o sorotipo 9 do vírus adeno-associado (AAV9) juntamente com uma injeção direta no líquido cefalorraquidiano (LCR).

Existem três vias típicas de administração para injeções diretas de LCR: intratecal lombar (IT), intracerebroventricular (ICV) e intracisternal (ICM)⁵. Cada uma dessas vias de administração resulta em diferentes padrões de biodistribuição no SNC e nos tecidos periféricos, mas todas têm o benefício de contornar a barreira hematoencefálica (BHE) para alcançar as células do SNC que contribuem para a patologia e fenótipos de doenças neurológicas⁶. A injeção lombar de IT é o padrão para o uso clínico de drug delivery em humanos, pois o procedimento clínico é rotineiro e direto, com menos invasividade em comparação com as injeções de ICV e ICM.

A injeção lombar de IT é uma técnica estabelecida e prontamente utilizada nas áreas anestésica e analgésica, com o primeiro trabalho publicado em 1885⁷. O primeiro protocolo para injeções lombares de IT em camundongos adultos foi publicado em 1980⁸ e, desde então, tem sido amplamente adotado e revisado⁹. Pequenos ajustes ou melhorias nesses protocolos foram feitos 10,11,12, incluindo uma técnica de conservação do produto ¹³. Protocolos para injeções lombares de IT em ratos adultos também foram publicados pela primeira vez em 1976, com cateterismo para administração crônica¹⁴ e injeção direta para tratamentos únicos¹⁵. Mais recentemente, grupos publicaram protocolos para injeções lombares de TI em camundongos e ratos neonatais ou juvenis^16,17.

A ampla adoção e validação dessa técnica para contornar a BHE e as células-alvo no SNC levaram a vários estudos pré-clínicos e clínicos de terapia genética bem-sucedidos para o tratamento de doenças neurológicas. Dados positivos de eficácia e segurança em camundongos, ratos e primatas não humanos que modelam doenças neurológicas despertaram entusiasmo e interesse em torno do potencial de benefício clínico para essas doenças 18,19,20,21,22,23. Alguns desses estudos estão agora em ensaios clínicos (por exemplo, identificadores clinicaltrials.gov NCT02362438, NCT04737460, NCT03381729 e NCT05518188)^3,6. Neste artigo, é descrito um protocolo simples para injeções lombares de TI em camundongos e ratos de diferentes idades, sem remover o LCR, que pode ser adotado para projetos de terapia gênica translacional. Este protocolo é semelhante aos protocolos já disponíveis que são amplamente adotados; no entanto, há valor em citar esses protocolos relevantes em um só lugar para facilitar o acesso e a referência, juntamente com os recursos visuais de vídeo que os acompanham. Este protocolo explica a injeção para camundongos e ratos neonatais no dia pós-natal (P) 0-1 e camundongos e ratos juvenis P21, com resultados representativos de uma injeção lombar de TI bem-sucedida e malsucedida em P1 em camundongos. Na discussão, são abordados erros comuns e detalhes específicos que requerem atenção cuidadosa durante a realização deste procedimento, bem como recomendações sobre como praticar essas injeções antes de iniciar um estudo pré-clínico.

Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas. Camundongos machos e fêmeas C57BL6/J do tipo selvagem, com idade P1-P28, foram usados para protocolos envolvendo camundongos. Ratos selvagens da raça Sprague-Dawley, machos e fêmeas, com idade P1-P56, foram utilizados para protocolos envolvendo ratos. Além da cirurgia de sobrevivência descrita na seção 3, todos os outros procedimentos são considerados como causadores apenas de desconforto momentâneo e não requerem o uso de anestésicos ou analgésicos. Os indivíduos devem monitorar os animais de laboratório quanto a mais do que desconforto momentâneo e buscar orientação de sua equipe IACUC e veterinária sobre a necessidade de anestésicos e analgésicos. Detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Injeção lombar de TI de camundongos >P21

1. Preparação
   1. Preparar as soluções injetáveis, incluindo o vector de terapia génica na(s) concentração(ões) desejada(s) e uma solução de controlo (normalmente o tampão de formulação utilizado na produção do vector). As soluções injetáveis devem ser estéreis e permanecer estéreis durante todo o procedimento.
      NOTA: Todas as soluções devem ser mantidas em gelo durante o procedimento.
   2. Reúna e higienize todos os materiais, incluindo seringa e agulha, pipeta e solução injetável. Siga as diretrizes institucionais quanto ao uso de cabines de biossegurança e exposição a injetantes. Os procedimentos aqui descritos foram realizados em uma cabine de biossegurança classe 2.
   3. Usando uma pipeta de microlitro, meça o volume desejado de solução de injeção e transfira-o para um filme de parafina estéril. Um volume de injeção de 5 μL é comumente usado e é tratado como o volume alvo para camundongos adultos >P21 (Tabela 1).
      NOTA: O volume pode ser aumentado se necessário; no entanto, os animais devem ser monitorizados de perto quanto a reações adversas a volumes de injeção maiores. Consulte a seção Discussão para obter detalhes sobre o volume de injeção e reações adversas. A solução também pode ser transferida diretamente da ponta da pipeta para uma seringa, ou seringas calibradas de microlitros à prova de gás podem ser usadas para medir diretamente o volume da solução de injeção.
   4. Aspire a solução para uma seringa de microlitros com uma agulha de 30 G 0,5", com cuidado para não formar bolhas de ar.
      NOTA: O calibre e o comprimento da agulha podem afetar a penetração na pele. Ao considerar o tamanho da seringa a ser usada, o volume de injeção não deve ser inferior a 10% da capacidade da seringa. Para volumes superiores a 50% da capacidade da seringa, certifique-se de que o êmbolo possa ser facilmente pressionado com o dedo indicador. Se o êmbolo não puder ser pressionado facilmente, use uma seringa de maior capacidade.
2. Restrição
   1. Usando a mão dominante, segure o rato consciente (não anestesiado) pela cauda em uma toalha de papel. A toalha de papel ajudará a conter, acalmar e evitar que o rato morda. O mouse deve estar na posição neutra de bruços com o aspecto lateral do corpo voltado para você.
      NOTA: Não é necessário treinar ou habituar camundongos a esta contenção antes do procedimento. Os camundongos podem ter dificuldades devido à contenção, mas não devem provocar uma resposta específica à dor. Se forem observadas respostas mais do que momentâneas à dor, pode ser necessária a administração de analgésicos; procure orientação veterinária.
   2. Com a mão não dominante, dobre uma parte da toalha de papel sobre a cabeça e a parte superior do corpo do mouse e segure firmemente a cintura pélvica entre o polegar não dominante e o dedo indicador. Certifique-se de que a palma da mão esteja em forma de concha, apoiada ao redor da cabeça do mouse. A crista ilíaca do camundongo deve ser palpável e posicionada no centro da falange distal de cada dedo (Figura 1A, B).
      NOTA: A contenção da mão ou da toalha de papel não deve prejudicar a respiração.
   3. Gire suavemente a base da cauda para garantir o alinhamento adequado da coluna. A pelve do camundongo deve ser quadrada, de modo que os processos vertebrais da coluna lombar sejam perpendiculares à superfície de trabalho.
   4. Limpe a região lombar dorsal do camundongo com uma almofada de preparação com álcool a 70%.
   5. Separe o cabelo ~ 2-6 mm cranial à crista ilíaca para ajudar a visualizar o local da injeção.
   6. Sinta o espaço intervertebral L4-L5 ou L5-L6, ~ 2-6 mm cranial à crista ilíaca.
      NOTA: A distância exata é variável dependendo do tamanho e da idade do mouse.
3. Injecção
   1. Usando a mão dominante, segure o centro da seringa de microlitro e posicione-a perpendicularmente à coluna vertebral do camundongo no espaço intervertebral L4-L5 ou L5-L6. Certifique-se de que o êmbolo da seringa pode ser pressionado com o dedo indicador sem movimento excessivo da mão. Com o chanfro da agulha voltado para a cabeça do camundongo, perfure a pele sobre o espaço intervertebral.
   2. Quando as bordas do osso ao redor do espaço intervertebral forem sentidas na ponta da agulha, reduza o ângulo da seringa para 30-45 graus (Figura 1A).
   3. A agulha deve deslizar para o espaço intervertebral, causando um movimento repentino da cauda, e deve ser firmemente presa entre as vértebras.
   4. Tomando cuidado para não deslocar a seringa, pressione o êmbolo firmemente para fornecer a solução em 10 s.
   5. Segure a seringa no lugar por 15-30 s depois de pressionar totalmente o êmbolo para permitir a dissipação da solução e evitar o refluxo.
   6. Retire suave e lentamente a seringa do mouse no mesmo ângulo de entrada de 30 a 45 graus. À medida que a agulha é retirada, gire a seringa para evitar o refluxo.
      NOTA: Tenha cuidado para não avançar a agulha ao girar a seringa, pois isso pode causar danos físicos à medula espinhal.
   7. Solte o mouse da restrição e devolva-o à gaiola inicial.
   8. Monitore o mouse após a injeção quanto a deambulação anormal, comprometimento motor, anormalidades respiratórias e coordenação. Consulte a Discussão para obter detalhes adicionais sobre reações adversas.
   9. Limpe o equipamento seguindo as recomendações do fabricante. Para injeções múltiplas, são recomendadas seringas diferentes para cada vetor de terapia gênica e solução de controle.
      NOTA: As agulhas removíveis podem ser limpas, esterilizadas e reutilizadas várias vezes; no entanto, agulhas cegas não devem ser usadas, pois podem prejudicar o animal e aumentar a probabilidade de injeções perdidas. Uma agulha cega não perfura a pele facilmente e deve ser descartada adequadamente. Se as seringas forem limitadas, é aconselhável completar todas as injeções de veículo antes de prosseguir para o vetor de terapia gênica e injetar a dose mais baixa de terapia gênica antes de administrar doses mais altas.
   10. Siga as diretrizes institucionais para esterilização de equipamentos entre animais.

Figura 1: Esquema da colocação do dedo e da seringa para injeção intratecal lombar em camundongos e ratos. (A) Vista lateral de um camundongo >P21 mostrando a colocação da agulha e a transição do ângulo da seringa durante uma injeção lombar de IT. O oval vermelho tracejado indica o posicionamento do dedo sobre a crista ilíaca do camundongo. Uma visão ampliada da coluna vertebral mostra o espaço intratecal (azul) com posicionamento aproximado da agulha (seta verde) e a medula espinhal (rosa). Vista dorsal de (B) um camundongo >P21, (C) um camundongo D) um rato >P21, com pontos de referência para colocação de agulha (círculo verde), cintura pélvica (oval amarelo tracejado) e colocação de dedos (oval vermelho tracejado). O local da incisão e os afastadores também estão representados em (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Injeção lombar de TI de camundongos e ratos

Embora muitos fatores possam influenciar a transdução do vetor da terapia gênica, a coloração histológica do tecido continua sendo o método mais preciso para determinar o sucesso das injeções intratecais lombares (IT). A distribuição ampla e uniforme do vetor de terapia gênica no sistema nervoso central (SNC) após a injeção é indicativa de um procedimento bem-sucedido. A Figura 2C representa uma injeção bem-sucedida de uma terapia gênica auto-complementar mediada por AAV9 conduzindo a expressão fraca de transgene onipresente sob o promotor JeT em uma dose de 1,3 × 10¹¹ vg / camundongo em camundongos neonatais (P1), 4 meses após a injeção. A análise de RNAscope, usando uma sonda direcionada ao transgene fornecido pela terapia gênica, revela ampla distribuição na medula espinhal lombar, medula espinhal cervical e cérebro. Uma seção do fígado e do coração é incluída para destacar que, mesmo com a injeção direta de líquido cefalorraquidiano (LCR), o vetor de terapia gênica ainda pode ser distribuído para os tecidos periféricos.

Figura 2: Seções de tecido coradas de 5 mícrons do SNC de camundongo e tecido periférico 4 meses após a injeção em P1. A coloração vermelha indica a expressão do transgene via RNAscópio, e a contracoloração azul dos núcleos é feita via hematoxilina. (A) Injeção com um tampão de formulação de controle. (B) Injeção intraparenquimatosa malsucedida com um vetor AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). (C) Injeção de TI lombar bem-sucedida com um vetor AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). O vetor de terapia gênica usado em (B) e (C) foi administrado em uma dose translacionalmente relevante de 1,3E11 vg / camundongo. Barra de escala: painel superior (5 mm); painel inferior (1 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A expressão concentrada na medula espinhal lombar emparelhada com a falta de expressão no cérebro, conforme mostrado na Figura 2B, pode indicar uma injeção intraparenquimatosa da medula espinhal e deve ser considerada uma injeção malsucedida. Isso acontece quando a agulha é inserida muito longe na coluna vertebral, além do espaço intratecal e na medula espinhal. Além disso, a expressão muito baixa ou nenhuma expressão na medula espinhal e no cérebro (não mostrada) também deve ser considerada uma injeção fora do alvo com falha, supondo que um vetor e uma dose estejam sendo usados onde se espera uma ampla distribuição do SNC. Isso pode ser devido a não inserir a agulha longe o suficiente ou por ser lateral à linha média.

Os padrões de expressão observados em injeções bem-sucedidas podem diferir devido aos oito fatores a seguir, como exemplos: (1) idade na injeção, (2) imunidade pré-existente, (3) taxa de infusão, (4) vetor de terapia gênica, (5) dose de terapia gênica, (6) proteínas de superfície celular, (7) tropismo e (8) se aplicável, uma escolha de promotor apropriada para impulsionar a expressão do transgene⁶. Embora os padrões de expressão possam diferir, a distribuição ampla, uniforme e generalizada será universal, desde que a dose seja suficientemente alta com um vetor eficaz, como o AAV9.

As principais limitações do uso da análise histológica para confirmar o sucesso da injeção lombar de IT são os extensos tempos de espera - esperando até o final de um estudo, após a realização de necropsias e coleta de tecido - e extensos recursos necessários para processar tecido de todos os camundongos em um grande estudo de terapia genética. Infelizmente, nossa experiência tem sido que indicadores imediatos e diretos de uma injeção positiva ou negativa podem não ser confiáveis; no entanto, o reflexo de movimento da cauda quando a agulha entra no espaço intratecal é um bom indicador de posicionamento bem-sucedido em tempo real e provavelmente indica uma injeção bem-sucedida. Não confunda uma contração quando a agulha perfura a pele em um camundongo/rato não anestesiado com uma resposta de movimento da cauda à agulha que entra no espaço intratecal. O uso de agentes farmacológicos como NMDA, substância P e lidocaína, seja em treinamento ou misturado com a solução experimental de injeção, tem sido relatado como uma indicação mais imediata do sucesso da injeção ^9,11,24. Se considerar esses agentes, é importante avaliar sua compatibilidade com o vetor da terapia gênica.

A injeção lombar de IT é um procedimento rápido e minimamente invasivo que fornece de forma confiável um vetor de terapia gênica no LCR para o tratamento de doenças do SNC ^5,6. O procedimento é translacionalmente relevante, e o protocolo descrito aqui detalha como realizar essa via de administração em camundongos e ratos em todas as idades, de neonatos a adultos. É importante definir este protocolo para camundongos e ratos de todas as idades, juntamente com o fornecimento de vídeos de apoio, para ajudar os investigadores na adoção deste método para administração de terapia gênica. A experiência do nosso laboratório é que este protocolo pode ser implementado de forma consistente em vários usuários e estudos ao longo do tempo 18,25,26,27,28,29,30.

Existem diferenças importantes ao realizar a injeção lombar de IT em camundongos/ratos mais jovens em comparação com camundongos/ratos mais velhos, principalmente o ângulo em que a agulha é inserida na coluna e o volume recomendado que é injetado. Os volumes de injeção lombar de IT relatados variam consideravelmente entre os estudos e entre as espécies³¹. A consideração do volume de injeção é importante para evitar elevações duradouras da pressão intracraniana (PIC), que podem comprometer o fluxo liquórico e o sangue cerebral, causar desconforto e levar a complicações neurológicas crônicas, incluindo hidrocefalia, isquemia, lesão celular e morte ^32,33. A PIC é determinada pelo volume do LCR, do sangue cerebral e do tecido do SNC, que não podem ser diretamente correlacionados com o peso corporal. Em funcionamento normal, a PIC é autorregulada por muitos fatores, incluindo volume de LCR, volume de sangue cerebral, respiração, posição corporal, taxa de produção de LCR e taxa de drenagem de LCR para o sangue^33,34. Os volumes de injeção de IT devem, portanto, ser determinados com base nas propriedades do LCR (Tabela 1) em vez do peso corporal 25,27,28,30. Os volumes recomendados para injetar em cada idade em cada espécie são indicados em negrito.

Tabela 1: Resumo dos volumes de injeção lombar de IT para camundongos e ratos em diferentes idades. Valores em negrito são recomendados e foram entregues com segurança. Os volumes máximos possíveis não foram formalmente avaliados. Informações adicionais sobre os parâmetros conhecidos do LCR - volume total, taxa de produção, renovação e pressão intracraniana - em camundongos e ratos estão incluídas para referência.

Há uma falta de conhecimento em todo o campo sobre o limite superior para volumes de injeção única de TI em bolus. Em humanos adultos, ratos e camundongos onde o volume do LCR é conhecido, um aumento de 30% no volume total do LCR não parece causar lesões crônicas ou doenças 31,33,35,36. A falta de volumes conhecidos de LCR em camundongos juvenis ou neonatais torna impossível uma extrapolação semelhante. Alguns grupos estão começando a olhar para o volume e a produção de LCR em animais mais jovens³⁷. Até que investigações adicionais nessas áreas sejam comprovadas, o volume de injeção continuará sujeito aos valores relatados pelo investigador.

Camundongos e ratos, especialmente quando tratados em idades mais jovens ou com altos volumes de injeção, podem provocar flexão dos músculos, extensão dos membros, respiração rápida ou paralisia temporária dos membros posteriores que devem se resolver em poucos minutos. Em casos extremos, as elevações agudas da PIC podem causar anormalidades cardiovasculares e respiratórias, que podem ser mortais^32,33. Se alguma anormalidade pós-procedimento persistir após 24 horas, os camundongos/ratos devem ser removidos do estudo e sacrificados humanamente. A paralisia persistente dos membros posteriores pode ocorrer se a agulha for inserida muito longe, impactando a medula espinhal. Isso pode ser devido a um erro comum ao realizar a injeção lombar de IT: movimento da seringa após o movimento da cauda enquanto pressiona o êmbolo. O movimento da seringa e da agulha deve ser evitado. Se a posição correta não puder ser adquirida com a punção inicial, uma segunda tentativa no mesmo local pode ser feita. Se a segunda tentativa também não for bem-sucedida, tente alterar a posição da agulha para atingir o próximo espaço intervertebral. Observe que várias picadas de agulha podem levar ao vazamento de uma injeção subsequentemente bem-sucedida.

Tornar-se proficiente na injeção lombar de TI pode levar tempo. Para praticar as injeções como um procedimento terminal, siga o protocolo acima usando uma solução de corante aprovada, como azul de Evans ou corante verde McCormick filtrado a 0,2 mícrons (Figura 3) ou com os agentes farmacológicos abordados na seção Resultados Representativos. O uso de corante é recomendado para solucionar problemas e dominar a injeção, pois é fácil saber se uma injeção foi bem-sucedida ou fracassada em 1 minuto. A prática com corante é apenas para procedimentos de não sobrevivência, pois os animais podem desenvolver uma reação ao corante quando administrado diretamente ao SNC. Essa reação pode ocorrer dentro de um minuto após uma injeção bem-sucedida e é caracterizada por coceira rápida e movimentos de contorção. Os animais devem ser imediatamente sacrificados assim que essa reação for observada para minimizar o desconforto. Após uma injeção de corante de prática bem-sucedida, o corante permanecerá localizado na coluna vertebral (sem corante no tecido periférico próximo) e subirá pela coluna vertebral até o cerebelo, cérebro e bulbos olfatórios. Em P1, a pele é transparente o suficiente para que o corante possa ser visto descendo pela coluna vertebral na cauda. Se o corante não atingir o cérebro em alguns minutos, a injeção falha.

Figura 3: Corante verde McCormick no cérebro após injeções lombares de TI bem-sucedidas. Todos os cérebros são de camundongos P21 injetados com corante de 5 μL e são mostrados na visão ventral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para obter informações adicionais sobre parâmetros associados relevantes para o desenho de ensaios pré-clínicos, como título e doses virais, consulte as revisões publicadas anteriormente ^3,6,31.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Gostaríamos de agradecer ao UT Southwestern AAV Viral Vector Core Facility pela fabricação do vetor AAV9 e a Yuhui Hu, Cientista Pesquisador do Laboratório Gray, pelo processamento e coloração do tecido apresentado na Figura 2.