Geçirgenleşmiş Fare Kortikal Nöronlarında Nükleer Taşınım Deneyleri

Nöronal nükleositoplazmik taşınmanın yüksek içerikli otomatik analizi için birincil fare kortikal nöronlarının seçici plazma zarı geçirgenliği için güvenilir bir yöntem geliştirdik.

Nükleositoplazmik taşınımın bozulması, nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde giderek daha fazla rol oynamaktadır. Ayrıca, nükleer gözenek kompleksi yapısında hücreye özgü farklılıkların giderek daha fazla tanınması söz konusudur ve bu da nöronlarda kullanım için nükleer taşıma yöntemlerinin uyarlanmasına ihtiyaç duyulmasına neden olmaktadır. Plazma zarının digitonin tarafından seçici olarak delindiği geçirgenleştirilmiş hücre deneyleri, ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarında pasif ve aktif nükleer taşınmayı incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak nöronal kültürlere uygulanmamıştır. İlk denemelerimizde, düşük konsantrasyonlarda bile digitonine maruz kalan birincil fare kortikal nöronlarında nükleer membran bütünlüğünün hızlı bir şekilde kaybolduğunu gözlemledik. Nöronal nükleer zarların sitoplazmik destek kaybına karşı benzersiz bir şekilde savunmasız olabileceğini varsaydık. Nükleer stabiliteyi iyileştirmek için birden fazla yaklaşımı test ettikten sonra, konsantre bir sığır serum albümin yastığı varlığında hipotonik lizizi takiben optimal nükleer bütünlüğü gözlemledik. Bu yaklaşımla hazırlanan nöronal çekirdekler, rekombinant floresan kargoyu enerjiye bağımlı bir şekilde güvenilir bir şekilde içe aktararak, otomatik analiz ile yüksek içerikli mikroskopi ile nükleer ithalatın analizini kolaylaştırır. Bu yöntemin, birincil nöronlarda pasif ve aktif nükleer taşıma çalışmalarına geniş çapta uygulanabilir olacağını tahmin ediyoruz.

Nükleositoplazmik taşınmanın bozulması, çekirdek ve sitoplazma arasındaki proteinlerin ve RNA'nın düzenlenmiş ticareti, nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde giderek daha fazla rol oynamaktadır (yakın zamanda gözden geçirilmiştir¹). Biz ve diğerleri, C9orf72 amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve frontotemporal demans (FTD), Alzheimer hastalığı ve Huntington hastalığının postmortem doku ve hayvan modellerinde nükleositoplazmik taşıma aparatının yapısal ve fonksiyonel bozulmasını bildirdik ^2,3,4,5. Nörodejenerasyon için nükleositoplazmik transport bozulmasının mekanizmaları ve fonksiyonel sonuçları ve terapötik kurtarma yaklaşımları devam eden araştırma alanlarıdır.

Nükleer gözenekler, küçük moleküllerin nükleer zar boyunca difüzyonuna izin veren, ancak merkezi kanal^6'daki fenilalanin-glisin (FG) açısından zengin nükleoporinlerin geçirgenlik bariyeri yoluyla yüklerin >40 kD geçişini giderek daha fazla kısıtlayan ~30 nükleoporin proteinlerinin büyük transmembran kompleksleridir. Nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) veya nükleer ihracat sinyali (NES) dizileri içeren daha büyük kargolar, nükleer taşıma reseptörleri (ithalatlar ve ihracatlar) ve nükleer zar boyunca koşan küçük GTPaz'ın dik bir eğimi aracılığıyla gözenek boyunca aktif, reseptör aracılı taşımaya tabi tutulur (yakın zamanda gözden geçirilmiştir⁷). Kültürlenmiş hücrelerde nükleer taşıma dinamiklerini analiz etmek için, endojen yüklerin kaçakçılığı ve taşıma reseptörlerinin ana alt sınıfları için substrat görevi gören etiketli raportör yapıları da dahil olmak üzere çok çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu tür yaklaşımlar,^{nöronlara 2,5,8} kolayca uyarlanmıştır ve sağlam, canlı bir hücre bağlamında nükleer taşıma bozulmalarının bir okumasını sağlar. Bununla birlikte, canlı hücre tahlillerinde, nükleer taşıma reaksiyonlarını doğrudan manipüle etme veya bunları diğer hücresel süreçlerden ayrı olarak araştırma yeteneği sınırlıdır.

Geçirgen hücre tahlillerinde, plazma zarı seçici olarak delinir ve sitoplazma serbest bırakılır, bu da nükleer zarfı ve nükleer gözenek komplekslerini sağlam bırakır ve pasif veya enerjiye bağlı çift yönlü taşıma gerçekleştirebilir ^9,10. Bu tür taşıma reaksiyonları, tam hücre lizatları, sitoplazmik fraksiyonlar veya saflaştırılmış rekombinant nükleer taşıma proteinleri ve bunların kargoları eklenerek kolayca yeniden oluşturulabilir. Bu nedenle, geçirgen hücre tahlilleri, nörodejeneratif hastalıkların incelenmesiyle ilgili rekombinant veya sentetik proteinlerin ve RNA'ların verilmesi de dahil olmak üzere çok çeşitli biyokimyasal veya biyofiziksel araştırmalara izin verir.

Nükleer gözenek kompleksi yapısı ve taşıma dinamikleri ^11,12'deki hücreye özgü farklılıkların raporları göz önüne alındığında, geçirgenleştirilmiş hücre testini birincil nöronal kültürlerde kullanım için uyarlamayı amaçladık. Ölümsüzleştirilmiş hücre dizilerinde nükleer taşınmayı analiz etmek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kapsamlı literatür araştırmasına rağmen, nükleer zar bütünlüğünün korunmasını doğrulayan nöronal plazma zarı geçirgenliğine dair yayınlanmış bir rapor bulamadık. Çoğu protokol, nükleer zarı sağlam bırakırken nükleer zarı delmek için plazma zarının benzersiz kolesterol bileşimini hedefleyen bir deterjan olan digitonine dayanır¹³. Birincil fare kortikal nöronlarında digitonin kullanan ilk girişimlerimiz, 70 kD floresan dekstranın çekirdeğe difüzyonu ile kanıtlanan nükleer membran bütünlüğünün ani kaybını gösterdi. Nükleer zarf yırtılmasının sitoplazmik destek kaybından kaynaklanan mekanik bozulmadan kaynaklanabileceğini varsaydık ve moleküler kalabalıklaşma, hücre iskeleti stabilizasyonu ve alternatif hücre lizizi yöntemleri dahil olmak üzere birçok optimizasyon yöntemini test ettik. Burada, nöronal çekirdekleri korumak ve nöronal nükleer ithalatın aşağı akış analizini kolaylaştırmak için konsantre bir sığır serum albümini (BSA) yastığı kullanarak hızlı hipotonik geçirgenleştirme yöntemini detaylandırıyoruz. Yakın zamanda bu yöntemi, C9orf72-ALS / FTD^14'teki dipeptit tekrar protein bozulması mekanizmasını değerlendirmek için kullandık ve birincil nöronlarda pasif ve aktif nükleer taşıma ile ilgili gelecekteki çalışmalara geniş ölçüde uygulanabilir olacağını tahmin ettik.

İlk olarak, protokol, birincil nöronal kültürlerin oluşturulmasını (adım 1) ve taşıma testi için materyallerin hazırlanmasını (adım 2), ardından taşıma testinin kendisini (adım 3-4) ve görüntü elde etme ve analizini (adım 5) tanımlar. Burada açıklanan tüm yöntemler Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Birincil fare kortikal nöron kültürleri

1. Stok çözeltilerini hazırlayın.
   1. Diseksiyon tamponu: 50 mL 10x HBSS, 15 mL 1 M glukoz (dH₂O'da), 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodyum piruvat ve 5 mL 100x penisilin-streptomisin birleştirin. dH₂O Steril filtre ile hacmi 500 mL'ye getirin ve 4 ° C'de saklayın.
   2. Papain: Papain'i diseksiyon tamponu ile 30 mg / mL'ye seyreltin. 4 °C'de saklayın.
   3. DNaz: DNaz I'i diseksiyon tamponu ile 10 mg / mL'ye seyreltin. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
   4. Kaplama ortamı: Nörobazal ortama %5 fetal sığır serumu (FBS), %2 B-27, %1 Glutamax ve %1 penisilin-streptomisin ekleyin. Steril filtre ve 4 °C'de saklayın.
   5. Besleme ortamı: Nörobazal ortama %2 B-27, %1 Glutamax ve %1 penisilin-streptomisin ekleyin. 4 °C'de saklayın.
2. Plakaları kaplayın.
   1. Optik cam tabanlı 96 oyuklu plakaları poli-D-lizin (20 μg/mL) ve laminin (1:100) ile steril dH₂O içinde kaplayın.
   2. Diseksiyon gününde, kuyucukları steril dH₂O ile üç kez durulayın ve Neurobazal ortam ile değiştirin. Bir inkübatörde en az 30 dakika dengeleyin.
3. Korteksleri inceleyin ve sindirin.
   NOT: Kültür kontaminasyonunu önlemek için otoklavlı aletler kullanarak temiz bir tezgah üzerinde diseksiyon yapın.
   1. E15-16 C57BL / 6J hamile kadını servikal çıkık ile ötenazi yapın. Karnına% 70 etanol püskürtün. Hızlı çalışın. Orta hatta abdominal bir kesi yapmak için makas ve dişli forseps kullanın, uterusu eksize edin ve ardından embriyoları amniyotik keseden bir Petri kabına aktarın. Embriyoları makasla dekapite edin ve kafaları diseksiyon tamponu içeren 10 cm'lik bir Petri kabında toplayın.
   2. Diseksiyon mikroskobu altında, kafatasını çıkarmak ve meninksleri soymak için ince forseps kullanın. Tüm beyinleri diseksiyon tamponu içeren 10 cm'lik taze bir Petri kabına aktarın. Yarım küreleri ayırın ve subkortikal yapıları çıkarın.
   3. Korteksleri steril bir tıraş bıçağıyla kesin ve 5 mL diseksiyon tamponu içeren konik bir tüpe aktarın. 100 μL papain (stok 30 mg / mL, son konsantrasyon 0.6 mg / mL) ve 50 μL DNaz (stok 10 mg / mL, son konsantrasyon 0.1 mg / mL) ekleyin. 37 °C'lik bir su banyosunda 10 dakika boyunca sindirin.
      NOT: 10 dakikadan fazla sindirim, hücrenin hayatta kalması için zararlıdır.
   4. Süpernatanı çıkarın ve sindirimi durdurmak için 10 mL kaplama ortamı ile iki kez yıkayın. Her yıkama arasında dokunun yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
   5. Büyük doku parçaları kaybolana kadar (yaklaşık 20 kez) P1000 pipet ile 2 mL kaplama ortamında hafifçe öğütün. Hacmi yaklaşık 10 mL'ye getirmek için 8 mL daha kaplama ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
4. Nöronları plakalayın ve koruyun.
   1. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri önceden ısıtılmış kaplama ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve kaplama ortamında 500.000 hücre / mL'ye seyreltin. Karıştırmak ve steril çok kanallı bir rezervuara aktarmak için yavaşça ters çevirin.
   2. Nörobazal ortamı kuyucuklardan aspire edin ve çok kanallı bir pipetle (50.000 hücre / oyuk) hemen oyuk başına 100 μL hücre ekleyin. Kaplanmış kuyuların kurumasına izin vermeyin.
   3. 24 saatlik diseksiyondan sonra, ortamın %50'sini besleme ortamı ile değiştirin. İn vitro tahlilleri gerçekleştirmek için 5-7. güne kadar her gün% 50 orta değişime devam edin.

2. Nükleer taşınım tahlil bileşenlerinin hazırlanması

1. Taşıma tamponu (TRB,^15'ten uyarlanmıştır)
   1. 5x TRB hazırlamak için 100 mM HEPES, 550 mM KOAc, 10 mM Mg(OAc)₂, 25 mM NaOAc, 2.5 mM EGTA ve 1.25 M sükrozu dH₂O içinde çözün. PH'ı 7.3'e ayarlayın ve tamponu 4 °C'de saklayın.
   2. Taşıma deneyinin yapıldığı gün 1 adet TRB-BSA hazırlayın. 5x TRB'yi dH₂O içinde seyreltin, EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli, 2 mM DTT ve 50 mg / mL BSA ekleyin.
2. Enerji geri kazanım karışımı (ERM, ^9,16'dan uyarlanmıştır)
   1. 20x ERM hazırlamak için 2mM ATP lityum tuzu, 2 mM GTP lityum tuzu, 80 mM Kreatin fosfat ve 400 U/mL Kreatin kinazı 1x TRB'de çözün.
   2. Tek kullanımlık alikotları -20 °C'de dondurun.
3. Tüm hücre ekstraktının hazırlanması (WCE, taşıma reseptörlerinin kaynağı ve Ran döngüsü proteinleri).
   NOT: Deneysel hedeflere bağlı olarak sitoplazmik veya tam hücre özütü (WCE) kullanılabilir. Burada, WCE'nin hazırlanması, ilk nöron taşıma testlerinde kullanıldığı gibi tanımlanmıştır¹⁰.
   1. On beş adet 150 mm'lik kültür kabında birleşene kadar HEK293T hücreleri büyütün. Tripsin-EDTA ile ayırın, tripsini inhibe etmek için% 10 fetal sığır serumu içeren ortamda ve 5 dakika boyunca 200 x g'da pelet hücrelerini yeniden süspanse edin. Hücreleri, taze eklenmiş proteaz inhibitör kokteyli ile 10 mL buz gibi soğuk 1x TRB'de yeniden süspanse edin.
   2. Elde tutulan bir prob sonikatörü kullanarak buz üzerinde sonikat, 3 x 10 darbe. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleme ile netleştirin.
   3. Protein konsantrasyonunu ölçün (hedef 8-10 mg / mL) ve -80 ° C'de depolamadan önce sıvı nitrojen içinde tek kullanımlık alikotları dondurun.
4. Rekombinant nükleer ithalat kargosu
   NOT: Adım 3-5'teki taşıma protokolü, ilgilenilen aktif veya pasif nükleer taşıma yolunu sorgulamak için herhangi bir floresan nükleer taşıma kargosu için uyarlanabilir. Burada protokol, floresan proteinleri CyPet ve YPet 14,17 ile çevrili importin α1'in importin β-bağlama alanından oluşan Rango'nun (Ran tarafından düzenlenen import β in^14,17 kargo) ifadesini ve nükleer ithalatını açıklamaktadır. Rango, FRET ve nükleer ithalat tahlilleri için kullanılabilen çok yönlü bir sensördür ve burada doğrudan ithalat β kargo olarak işlev görür.
   1. E. coli BL21 (DE3) hücrelerini Rango plazmidi (bir N-terminal 6-His etiketi içeren) ile aşağıdaki gibi ısı şoku ile dönüştürün. Buz üzerinde 50 μL'lik bir BL21 (DE3) hücresi alikotunu çözün. 100-200 ng plazmit ile birleştirin. Tüpe 4-5 kez vurarak karıştırın ve ardından 42 ° C'lik bir plakaya 40 saniye boyunca yerleştirmeden önce 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Hemen 2-5 dakika daha buza geri aktarın.
   2. Oda sıcaklığında 900 μL SOC ortamı ekleyin ve hücreleri önceden ısıtılmış bir agar plakasına (%1,5 agar, LB ortamı, 100 μg/mL Ampisilin) yaymadan önce 37 °C'de 1 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Plakayı gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Plakayı 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın veya protein üretimi için hemen kullanın.
   3. BL21 (DE3) plakasından artan sayıda koloni (~ 3-10) ile 50 mL'lik tüplere üç adet 25 mL başlangıç kültürü aşılayarak protein üretimine başlayın. Bir çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edildikten sonra, 2,8 L bölmesiz bir Fernbach şişesi kullanarak LB ortamında 1 L'lik bir kültürü aşılamak için OD_{600 nm} < 1.0 içeren kültürleri seçin. OD_{600 nm} = 0.1-0.3'e ulaşana kadar 37 ° C'de büyüyün.
      NOT: Daha eski BL21 (DE3) LB agar plakalarının veya yüksek yoğunluklu starter kültürlerin (OD_{600 nm} >1.0) kullanılması, protein preparatının verimini ve saflığını azaltabilir.
   4. Buz üzerine koyarak oda sıcaklığına (22-25 °C) soğutun. 0.3 mM IPTG (nihai konsantrasyon) ile protein ekspresyonunu indükleyin ve oda sıcaklığında 12-14 saat boyunca bir çalkalayıcı (80-120 rpm) üzerinde inkübe edin.
   5. Hücreleri santrifüjleme (6.000 x g, 15 dakika, 4 °C) ile toplayın ve EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş PBS'de (pH 7.4) 30 mL buz gibi 10 mM imidazol içinde yeniden süspanse edin. İki adet Lyse, buz gibi soğuk bir Fransız basınç hücresinden geçer ve lizatı santrifüjleme (16.000 x g, 40 dk, 4 °C) ile berraklaştırır.
   6. Lizatı, 1 L E. coli kültürü başına 1 mL reçine kullanarak yüksek akışlı Nikel afiniteli agaroz reçinesi (30-60 dakika, 4 ° C) ile inkübe edin. Reçineyi kromatografi kolonlarına yerleştirin, 10-20 hacim buz gibi soğuk 10 mM imidazol/PBS (pH 7.4) ile yıkayın. 25 mM imidazol/PBS'lik artışlarla (25-200 mM, pH 7.4) Elute Rango, her adımda 5 kat yatak hacmi kullanır.
   7. En yüksek saflıkta partileri seçmek ve bir araya getirmek için SDS-PAGE'i kullanın.
   8. 10 mM HEPES, 100 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ ve 50 mM sükrozu dH₂O'da çözerek XB tamponunu hazırlayın. PH'ı 7.7'ye ayarlayın.
   9. Proteini XB tamponunda diyalize edin ve 30 kD moleküler ağırlık kesme özelliğine sahip bir ultrafiltrasyon cihazında santrifüjleme (7500 x g, 4 °C) ile konsantre edin.
   10. Protein konsantrasyonunu Bradford veya tercih edilen başka bir yöntemle ölçün ve -80 ° C'de depolamadan önce tek kullanımlık alikotları sıvı nitrojen içinde dondurun.

3. Optimal plazma membran geçirgenlik koşullarının belirlenmesi

NOT: Her bir nöron grubu arasındaki farklılıklar nedeniyle, her bir nöron grubu için geçirgenlik koşullarını optimize edin. Bunu, nükleer taşıma tahlillerini gerçekleştirmeden önce aynı gün gerçekleştirin.

1. Plastik 96 oyuklu bir evreleme plakasında, üç BSA konsantrasyonunun her birinde 0 μM, 10 μM, 20 μM ve 40 μM'de Tris-HCl pH 7.5'in (ozmotik şişmeye neden olmak için) seri bir seyreltmesini hazırlayın: 50 mg / mL, 100 mg / mL ve 150 mg / mL (moleküler kalabalık / mekanik destek için). Çözeltileri önceden 37 °C'ye ısıtın.
2. Nöronları önceden ısıtılmış PBS'de bir kez durulayın. PBS'yi çıkarın ve Tris/BSA'yı hazırlama plakasından aktarın. 4 dakika boyunca inkübatöre geri dönün.
3. İnkübatörden çıkarın ve kültür plakasını buzun üzerine yerleştirin. 1x TRB-BSA'da 2 x 5 dakika durulayın (adım 2.1.2'de hazırlandığı gibi).
4. Son durulamadan sonra, 1x TRB-BSA'ya 70 kD Texas Red etiketli dekstran (0.6 mg / mL) ve Hoechst (1: 10.000) ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ışıktan koruyarak tezgahın üzerinde bırakın.
5. Plazma zarı geçirgenlik yüzdesinin en yüksek olduğu, ancak nükleer zarın hala 70 kD dekstranın girişini kısıtladığı tamponu ve BSA konsantrasyonunu tanımlamak için konfokal mikroskop kullanan görüntü (hedef %80≥). Sonraki deneyler için bu koşulları kullanın.

4. Nükleer ithalat tahlili

1. Taşıma reaksiyonlarını hazırlayın
   NOT: Plakadaki tüm reaksiyonların aynı anda başlatılmasını sağlamak için, nöron geçirgenliğinden önce buz üzerinde plastik 96 oyuklu bir hazırlama plakasında reaksiyon karışımı hazırlayın. Koşul başına en az iki teknik çoğaltma gerçekleştirin. Her plakaya kontroller ekleyin.
   1. Kuyucuk başına 50 μL için yeterli olan 1x TRB-BSA'da 2.5 mg / mL WCE, 1x ERM, floresan kargo (200 nM Rango) ve Hoechst 33342 (10 mg / mL, 1: 10.000) içeren baz reaksiyon karışımını hazırlayın. OPSİYON: Nükleer dekstran dışlamasını görüntülemek için konfokal mikroskobun gerekli olduğunu akılda tutarak, taşıma reaksiyonu boyunca nükleer gözenek bütünlüğünün izlenmesine izin vermek için 70 kD Texas kırmızı etiketli dekstran ekleyin.
      NOT: Sağlanan WCE konsantrasyonu, tahlil optimizasyonu için makul bir başlangıç noktasıdır. İstenen yükün verimli nükleer ithalatı için gereken optimal konsantrasyonu belirlemek için her bir WCE partisinin ampirik testini yapın. İçe aktarma verimliliği değişebileceğinden, farklı WCE gruplarıyla hazırlanan replikalardaki verileri birleştirmekten kaçının.
   2. (1) Tek başına kargo: Rango, ancak WCE veya ERM yok ve (2) İnhibitör: floresan kargo, ERM, WCE ve 100 μM importazol (IPZ, küçük moleküllü bir importin inhibitörü β¹⁸) dahil olmak üzere kontrolleri hazırlayın. Alternatif bir inhibitör olarak, 0.8 mg / mL buğday tohumu aglütinini (WGA) ¹⁹ kullanın.
      NOT: Taşımaya başlamadan önce WCE içeren test karışımındaki inhibitörleri en az 30 dakika boyunca dengeleyin. Maksimum inhibisyon için, ilgili kuyucuklardaki geçirgenlik sonrası durulama adımları da inhibitörü içermelidir.
2. Nöronları geçirgen hale getirin ve durulayın
   1. Nöronları, adım 3'te tanımlanan optimal, partiye özgü protokole göre geçirgen hale getirin.
   2. Kültür plakasını inkübatörden çıkarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. 1x TRB-BSA'da 2 kez 5 dakika durulayın. Belirlenen kuyucuklar için durulamalara bir inhibitör ekleyin.
3. Taşıma reaksiyonunu çalıştırın.
   1. Son durulamayı takiben 1x TRB-BSA'yı çıkarın. Hızlı çalışarak, önceden karıştırılmış taşıma reaksiyonlarını geçirgen hücrelere aktarmak için çok kanallı bir pipet (50 μL/oyuk) kullanın.
   2. Hızlandırılmış görüntülemeyi başlatmak için plakayı hemen oda sıcaklığında yüksek içerikli bir mikroskoba yükleyin (bkz. adım 4.4) veya plakayı ışıktan korunarak tezgahın üzerine yerleştirin ve reaksiyonun istenen süre boyunca ilerlemesine izin verin (örn., 30-120 dakika) fiksasyon ve görüntülemeden önce.
   3. İstenirse, 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit / PBS'de sabitleyin, PBS'de 5 dakika boyunca 2x durulayın ve daha sonraki görüntüleme için% 50 gliserol / PBS'ye aktarın. Sabit plakaları 4 °C'de ışıktan koruyun (1 hafta veya daha uzun süre stabil).
4. Canlı görüntüleme
   NOT: Bu aşamada tercih edilen herhangi bir görüntü elde etme ve analiz yöntemini uygulayın.
   1. Plakayı yüksek içerikli bir mikroskoba yükleyin. Deneysel numuneleri çalıştırmadan önce büyütme, odak, maruz kalma süreleri (Hoechst ve FITC) ve aralıklar dahil olmak üzere görüntüleme parametrelerini optimize etmek ve kaydetmek için bir ilk test plakası çalıştırın. Sonraki her plaka ile yeniden yüklemek için parametreleri kaydedin.
      NOT: Kantitatif analiz için, floresan ithalat kargosunun (FITC) maruz kalma süresini, kararlı durumda veya kullanılacak en son zaman noktasında doygunluğun çok altına ayarlayın. Bunu, deneysel koşullar boyunca yoğunluk değişikliklerine izin vermek için yarı maksimum doygunluğu hedefleyen test plakasını kullanarak oluşturun. Sonraki otomatik analiz sırasında nükleer tanımlamaya izin vermek için her kare ve zaman noktası için Hoechst görüntülerini toplayın.
   2. Gerekirse, odak dalga boyu olarak Hoechst'i kullanarak odak ofsetini ayarlayın ve görüntüleme protokolünü çalıştırın. Görüntüleri 30 dakika boyunca her 5 dakikada bir toplayın. İlgilenilen içe aktarma reaksiyonunun görüntüleme hızına ve kinetiğine bağlı olarak aralığı ve reaksiyon süresini gerektiği gibi ayarlayın.

5. Görüntü analizi

1. Mikroskop İnceleme Plakası iletişim kutusunda, Hoechst ve FITC görüntülerini temsili bir çerçeveden açın. Analizi Çalıştır sekmesi altında, Translokasyon Geliştirilmiş modülü'nü seçin ve ayarları yapılandırın. Hoechst'i bölme görüntüsü olarak ve FITC'yi translokasyon probu görüntüsü olarak ayarlayın.
2. Bölmeler altında, yaklaşık nükleer genişliği, yerel arka plan üzerindeki yoğunluğu ve minimum/maksimum alanı ayarlayın. Nöronlar kümelenme eğiliminde olduğu için Otomatik Ayrı Dokunma Bölmelerini etkinleştirin. Test Çalıştırması'nı seçerek sonuçları görüntüleyin. Nöronal olmayan çekirdeklerin veya döküntülerin hatalı şekilde dahil edilmesini sınırlarken nöronal çekirdek tanımlamasının doğruluğunu en üst düzeye çıkarmak için ayarları yapın.
   NOT: Glial kontaminasyon, varsa, nükleer boyuta bağlı olarak bu adımda tipik olarak hariç tutulabilir. Optimal bölme tanımlama ayarlarının belirlenmesi, doğruluk ve hücre sayısı arasında bir değiş tokuştur ve tahliye, hücre tipine ve kültür yoğunluğuna bağlı olarak ampirik olarak ayarlanmalıdır. Sıkı parametreler çok sayıda hücreyi atlayacak ancak daha az hata içerecek, liberal parametreler ise daha kapsayıcı olacak ancak daha fazla hata içerecektir. Nükleer boyutu etkileyebilecek farklı hücre popülasyonları (yani hastalık mutantları) veya tedaviler dahil edilirse, bir deneyde birden fazla parametre setine ihtiyaç duymamak için tüm koşulları barındıracak kadar geniş boyut/yoğunluk parametrelerinin ayarlanmasını öneririz.
3. Nükleer kenardan kaynaklanan artefaktları önlemek için, Hoechst boyama ile tanımlanan bölme kenarının içinde ve dışında birkaç piksel ölçüm bölgeleri tanımlayın. Büyütme ve gruplamaya bağlı olarak, iç bölge mesafesi için 2-4 piksel ve dış bölge mesafesi için 1-2 piksel ayarlayın. Dış bölge genişliğini (1-2 piksel) ayarlayın.
4. İstenen arka plan tahmin yöntemini seçin (varsayılan olarak Otomatik Sabit önerilir). Veri günlüğünü yapılandır bölümünde, ortalama iç yoğunluk, ortalama dış yoğunluk ve iç/dış ortalama yoğunluk (nükleer-sitoplazmik (N/C) oranı) dahil olmak üzere istenen çıkış parametrelerini seçin. Analiz parametrelerini kaydedin.
   NOT: Parametrelerin ilgilenilen biyolojik olayı tespit etmek için hassasiyeti en üst düzeye çıkarmasını sağlamak için her deneye dahili pozitif ve negatif kontrollerin dahil edilmesi şiddetle tavsiye edilir.
5. Kaydedilen parametreleri kullanarak istenen plaka(lar) üzerinde analiz yapmak ve ölçümleri dışa aktarmak için Plaka Yardımcı Programları iletişim kutusunu kullanın.
6. Verileri tedavi durumuna göre gözden geçirin ve özetleyin. OPSİYON: Prob yoğunluğu = 0 ve N/C oranının uç noktaları (yani, <0.1 ve >100) gibi fizyolojik olmayan verileri kaldırmak için filtreler uygulayın. Tüm filtrelere tüm koşullara ve deneylere eşit şekilde uygulayın.
7. Temel floresan için ek bir düzeltme olarak, verileri lizat ve ER'nin atlandığı kontrol kuyularına normalleştirin. Biyolojik replikasyonlar (yani, bağımsız nöronal kültür preparatları) arasında karşılaştırmaları kolaylaştırmak için, nihai nükleer ithalat verilerini 0 zamanının yüzdesi olarak ifade edin.

Plazma zarının seçici geçirgenliği (Şekil 1A) protokoldeki en kritik adımdır ve nükleer ithalat analizine devam etmeden önce doğrulanmalıdır. Her bir kültür preparatı arasındaki farklılıklar nedeniyle, adım 3'te açıklandığı gibi hipotonik Tris-HCl tamponu ve BSA yastığının optimal, partiye özgü konsantrasyonlarını belirlemek için rutin olarak bir ilk titrasyon plakası çalıştırılır. Az ve aşırı geçirgenleşmiş hü...

Yukarıda ayrıntıları verilen protokol, nükleer ithalat analizi için birincil fare kortikal nöronlarının plazma zarına seçici olarak nüfuz etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Burada, doğrudan ithal edilen bir β kargonun (Rango) nükleer ithalat analizi için yöntemin bir uygulaması gösterilmektedir, ancak aynı yaklaşım, çok çeşitli floresan kargoların pasif ve aktif ithalatını analiz etmek için kullanılabilir. Permeabilizasyon, ALS ve...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma NINDS K08NS104273 (L.R.H.'ye) tarafından desteklendi.