透過処理マウス皮質ニューロンにおける核輸送アッセイ

私たちは、ニューロンの核細胞質輸送のハイコンテント自動解析のために、マウス初代皮質ニューロンの選択的原形質膜透過化の信頼性の高い方法を開発しました。

核細胞質輸送の混乱は、神経変性疾患の病因にますます関与しています。さらに、核膜の細孔複合体構造における細胞特異的な違いの認識が高まっており、ニューロンで使用するために核輸送方法を適応させる必要性が高まっています。原形質膜にジギトニンを選択的に穿孔する透過処理細胞アッセイは、不死化細胞株の受動的および能動的核輸送の研究に広く使用されていますが、ニューロン培養には適用されていません。私たちの最初の試みでは、低濃度のジギトニンにさえ曝露されたマウス初代皮質ニューロンの核膜完全性の急速な喪失を観察しました。私たちは、ニューロンの核膜が細胞質の支持の喪失に対して特異的に脆弱である可能性があるという仮説を立てました。核の安定性を改善するための複数のアプローチをテストした後、濃縮ウシ血清アルブミンクッションの存在下での低張溶解後、最適な核の完全性が観察されました。このアプローチで作製した神経核は、エネルギー依存的に組換え蛍光カーゴを確実に取り込むため、ハイコンテント顕微鏡による原子核インポートの解析と自動解析が容易になります。この方法は、一次ニューロンの受動的および能動的核輸送の研究に広く適用できると期待しています。

核と細胞質の間のタンパク質とRNAの調節された輸送である核細胞質輸送の混乱は、神経変性疾患の病因にますます関与しています(最近レビュー^{されました1})。C9orf72筋萎縮性側索硬化症(ALS)および前頭側頭型認知症(FTD)、アルツハイマー病、ハンチントン病の死後組織および動物モデルにおいて、核細胞質輸送装置の構造的および機能的破壊が報告されています2,3,4,5 .神経変性に対する核細胞質輸送障害のメカニズムと機能的影響、および治療的救済のアプローチは、現在進行中の研究分野です。

核孔は、~30個のヌクレオポリンタンパク質からなる大きな膜貫通型複合体で、核膜を横切る小分子の拡散を可能にしますが、中央チャネル⁶のフェニルアラニン-グリシン(FG)リッチヌクレオポリンの透過性障壁を介してカーゴ>40 kDの通過をますます制限します。核局在化シグナル(NLS)または核輸出シグナル(NES)配列を含む大型貨物は、核輸送受容体(インポーチンおよびエクスポーチン)を介して孔を横切る受容体媒介的な能動的輸送を受け、核膜を横切る小さなGTPアーゼランの急勾配を受ける(最近レビューされた⁷)。培養細胞内の核輸送ダイナミクスを解析するために、内因性カーゴの輸送や、輸送受容体の主要なサブクラスの基質として機能するタグ付きレポーターコンストラクトの輸送など、さまざまな方法が開発されてきました。このようなアプローチは、ニューロン^2,5,8に容易に適応されており、無傷の生細胞の文脈で核輸送摂動を読み取ることができます。しかし、生細胞アッセイでは、核輸送反応を直接操作したり、他の細胞プロセスから分離して核輸送反応を調べたりする能力は限られています。

透過処理された細胞アッセイでは、原形質膜が選択的に穿孔され、細胞質が放出され、核膜および核孔複合体は無傷のまま残され、受動的またはエネルギー依存的な双方向輸送を行うことができる^9,10。このような輸送反応は、全細胞溶解物、細胞質画分、または精製された組換え核輸送タンパク質およびそれらのカーゴを添加することにより、容易に再構成することができる。したがって、透過処理された細胞アッセイは、神経変性疾患の研究に関連する組換えまたは合成タンパク質およびRNAの送達を含む、幅広い生化学的または生物物理学的研究を可能にします。

核膜細孔複合体の構造と輸送ダイナミクスにおける細胞特異的な違いの報告^11,12を考慮して、透過処理された細胞アッセイを初代ニューロン培養での使用に適応させることを目指しました。不死化細胞株の核輸送の解析に広く使用されていますが、徹底的な文献検索にもかかわらず、核膜の完全性の保存を検証したニューロンの原形質膜透過化の発表された報告は見つかりませんでした。ほとんどのプロトコルは、原形質膜のユニークなコレステロール組成を標的とする界面活性剤であるジギトニンに依存して、核膜を無傷のままにして核膜を穿孔します¹³。マウス初代皮質ニューロンにジギトニンを使用した最初の試みでは、70 kDの蛍光デキストランが核内に拡散することで証明されたように、核膜の完全性が即座に失われました。私たちは、核膜の破裂が細胞質支持の喪失による機械的摂動によって引き起こされる可能性があると仮定し、分子クラウディング、細胞骨格安定化、細胞溶解の代替方法など、複数の最適化方法をテストしました。ここでは、濃縮ウシ血清アルブミン(BSA)クッションを使用してニューロン核を保護し、ニューロン核のインポートの下流分析を容易にするための迅速な低張性透過化の方法について詳しく説明します。私たちは最近、この方法を使用して、C9orf72-ALS/FTD¹⁴におけるジペプチドリピートタンパク質破壊のメカニズムを評価し、初代ニューロンにおける受動的および能動的核輸送の将来の研究に広く適用できると期待しています。

まず、プロトコールでは、初代ニューロン培養物の生成(ステップ1)と輸送アッセイ用の材料の調製(ステップ2)、続いて輸送アッセイ自体(ステップ3〜4)と画像の取得と分析(ステップ5)について説明します。ここに記載されているすべての方法は、ジョンズホプキンス大学の動物管理および使用委員会(ACUC)によって承認されています。

1. マウス初代皮質ニューロン培養

1. ストック溶液を準備します。
   1. 解剖バッファー:50 mLの10x HBSS、15 mLの1 Mグルコース(dH₂O中)、5 mLの1 M HEPES、5 mLの100 mMピルビン酸ナトリウム、および5 mLの100xペニシリン-ストレプトマイシンを組み合わせます。.dH₂O.滅菌フィルターで容量を500 mLにし、4°Cで保存します。
   2. パパイン:パパインを解剖バッファーで30 mg / mLに希釈します。.4°Cで保存してください。
   3. DNase:DNase Iを解剖バッファーで10 mg / mLに希釈します。分注して-20°Cで保存します。
   4. プレーティング培地:5%ウシ胎児血清(FBS)、2%B-27、1%グルタマックス、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを神経基礎培地に加えます。滅菌フィルターを敷き、4°Cで保存します。
   5. 給餌培地:2%B-27、1%グルタマックス、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを神経基礎培地に加えます。.4°Cで保存してください。
2. プレートをコーティングします。
   1. 光学ガラス底の96ウェルプレートをポリ-D-リジン(20 μg/mL)とラミニン(1:100)で滅菌dH₂Oでコーティングし、プレートをインキュベーターに一晩置きます。
   2. 解剖の日に、ウェルを滅菌dH₂Oで3回すすぎ、神経基底培地と交換します。インキュベーター内で少なくとも30分間平衡化します。
3. 皮質を解剖して消化します。
   注:培養汚染を防ぐために、オートクレーブ滅菌されたツールを使用してクリーンベンチで解剖を行います。
   1. E15-16 C57BL/6J 妊婦を子宮頸部脱臼により安楽死させます。腹部に70%エタノールをスプレーします。迅速に作業します。はさみと歯付き鉗子を使用して正中線腹部切開を行い、子宮を切除してから、羊水嚢から胚をペトリ皿に移します。ハサミで胚の首を切り、解剖緩衝液が入った10cmのシャーレに頭部を採取します。
   2. 解剖顕微鏡で、細い鉗子を使用して頭蓋骨を取り出し、髄膜を剥がします。解剖バッファーを含む新鮮な10cmシャーレに全脳を移します。半球を分離し、皮質下構造を取り除きます。
   3. 滅菌済みのカミソリの刃で皮質を切り刻み、5mLの解剖緩衝液が入った円錐形のチューブに移します。100 μL のパパイン(ストック 30 mg/mL、最終濃度 0.6 mg/mL)と 50 μL の DNase (ストック 10 mg/mL、最終濃度 0.1 mg/mL)を加えます。37°Cの水浴で10分間消化します。
      注:10分を超える消化は細胞の生存に有害です。
   4. 上清を取り除き、10mLのめっき培地で2回洗浄して消化を止めます。各洗浄の間にティッシュが重力によって落ち着くのを待ちます。
   5. 2 mLのプレーティング培地にP1000ピペットで、大きな組織片が消えるまで(約20回)穏やかに滴定します。さらに8 mLのめっき培地を加えて容量を約10 mLにし、細胞懸濁液を40 μmの細胞ストレーナーに通します。
4. ニューロンをプレート化して維持します。
   1. 200 x g で5分間遠心分離します。予熱しためっき培地に細胞を再懸濁します。細胞をカウントし、めっき培地で500,000細胞/mLに希釈します。静かに反転させて混合し、滅菌マルチチャンネルリザーバーに移します。
   2. ウェルから神経基礎培地を吸引し、すぐにマルチチャンネルピペットでウェルあたり100μLの細胞を添加します(50,000細胞/ウェル)。コーティングされたウェルを乾燥させないでください。
   3. 解剖の24時間後、培地の50%を給餌培地と交換します。50〜7日目まで隔日で50%の培地交換を続けて、 in vitro アッセイを実行します。

2. 核輸送アッセイ成分の調製

1. トランスポートバッファ(TRB、¹⁵から適応)
   1. 5x TRBを調製するには、100 mM HEPES、550 mM KOAc、10 mM Mg(OAc)₂、25 mM NaOAc、2.5 mM EGTA、および1.25 MスクロースをdH₂Oに溶解し、pHを7.3に調整し、バッファーを4°Cで保存します。
   2. 輸送実験の日には、1x TRB-BSAを準備します。5倍TRBをdH₂Oで希釈し、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル、2 mMのDTT、および50 mg/mLのBSAを加えます。
2. エネルギー回生ミックス(ERM、^9,16から適応)
   1. 20x ERMを調製するには、2 mM ATPリチウム塩、2 mM GTPリチウム塩、80 mMクレアチンリン酸、および400 U/mLクレアチンキナーゼを1x TRBに溶解します。
   2. シングルユースアリコートを-20°Cで凍結します。
3. 全細胞抽出物(WCE、輸送受容体およびRanサイクルタンパク質の供給源)の調製。
   注:実験の目的に応じて、細胞質または全細胞抽出物(WCE)を使用できます。ここでは、WCEの調製は、初期のニューロン輸送アッセイ¹⁰で使用されるものとして説明される。
   1. HEK293T細胞を15個の150 mm培養皿でコンフルエントまで増殖させます。トリプシン-EDTAで剥離し、10%ウシ胎児血清を含む培地に再懸濁してトリプシンを阻害し、細胞を200 x g で5分間ペレット化します。新たに添加したプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した氷冷した1x TRB10 mLに細胞を再懸濁します。
   2. ハンドヘルドプローブソニケーターを使用して、氷上で3 x 10パルスで超音波処理します。14,000 x g で4°Cで15分間遠心分離して清澄化します。
   3. タンパク質濃度を測定し(目標8-10 mg/mL)、-80°Cで保存する前に、液体窒素中のシングルユースアリコートを急速冷凍します。
4. 組換え原子力輸入貨物
   注:ステップ3〜5の輸送プロトコルは、任意の蛍光核輸送貨物に適合させて、関心のある能動的または受動的な核輸送経路を調査することができる。ここでは、プロトコルは、蛍光タンパク質CyPetおよびYPet^14,17に隣接するインポーチンα1のインポーチンβ結合ドメインからなるRango(Ran-regulated importin β of cargo)の発現および核内インポートについて説明しています。Rangoは、FRETだけでなく、核輸入アッセイにも使用できる汎用性の高いセンサーで、貨物の直接輸入として機能しますβ。
   1. 大腸菌BL21(DE3)細胞をRangoプラスミド(N末端6-Hisタグを含む)に熱ショックにより形質転換します。BL21(DE3)細胞の50μLアリコートを氷上で解凍します。100-200 ngプラスミドと組み合わせます。チューブを4〜5回軽くたたいて混合し、氷上で30分間インキュベートしてから、42°Cプレートに40秒間置きます。すぐに氷に戻し、さらに2〜5分間待ちます。
   2. 900 μLのSOC培地を室温で加え、37°Cのシェーカーで1時間インキュベートした後、予熱した寒天プレート(1.5%寒天培地、LB培地、100 μg/mL Ampicillin)に細胞を広げます。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。 プレートは4°Cで最大1週間保存するか、タンパク質生産にすぐに使用してください。
   3. タンパク質生産を開始するには、BL21(DE3)プレートからコロニー数を増やして(~3-10)50mLチューブに25mLのスターター培養物を3回接種します。シェーカーで37°Cで一晩インキュベートした後、OD_{600 nm} < 1.0の培養物を選択し、2.8 LのバッフルフリーのFernbachフラスコを使用してLB培地に1 Lの培養物を接種します。OD_{600 nm} = 0.1-0.3に達するまで37°Cで成長します。
      注:古いBL21(DE3)LB寒天プレートの使用または高密度のスターター培養物(OD_{600 nm} >1.0)を使用すると、タンパク質調製物の収量と純度が低下する可能性があります。
   4. 氷の上に置いて室温(22-25°C)まで冷まします。0.3 mM IPTG(最終濃度)でタンパク質発現を誘導し、シェーカー(80-120 rpm)で室温で12-14時間インキュベートします。
   5. 遠心分離(6,000 x g、15分、4°C)で細胞を回収し、PBS(pH 7.4)中の氷冷10 mMイミダゾール30 mLに再懸濁し、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルを補充します。氷冷したフランス圧力セルを2回ずつ溶解し、遠心分離(16,000 x g、40分、4°C)により溶解物を清澄化します。
   6. 大 腸菌 培養物1 Lあたり1 mLの樹脂を使用して、ライセートを高流動性ニッケルアフィニティーアガロース樹脂(30〜60分、4°C)とインキュベートします。レジンをクロマトグラフィーカラムに入れ、10〜20容量の氷冷10 mMイミダゾール/PBS(pH 7.4)で洗浄します。25 mMのイミダゾール/PBS増分(25-200 mM、pH 7.4)でRangoを溶出し、各ステップで5倍のベッド容量を使用します。
   7. SDS-PAGEを使用して、最も純度の高いバッチを選択してプールします。
   8. 10 mM HEPES、100 mM KCl、10 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、および50 mMスクロースをdH₂Oに溶解してXBバッファーを調製し、pHを7.7に調整します。
   9. XBバッファー中のタンパク質を透析し、分子量30 kDのカットオフ限外ろ過装置で遠心分離(7500 x g、4°C)して濃縮します。
   10. Bradford法または他の好ましい方法でタンパク質濃度を測定し、-80°Cで保存する前に、液体窒素中のシングルユースアリコートを急速冷凍します。

3. 最適な原形質膜透過化条件の決定

注:ニューロンの各バッチ間で変動するため、ニューロンの各バッチの透過化条件を最適化してください。これは、核輸送アッセイを実施する前の同じ日に行ってください。

1. プラスチック製の 96 ウェルステージングプレートで、Tris-HCl pH 7.5 (浸透圧膨潤を引き起こすため) を 3 つの BSA 濃度 (50 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL (分子クラウディング/機械的サポート用) のそれぞれで 0 μM、10 μM、20 μM、40 μM で段階希釈液を調製します。溶液を37°Cに予温します。
2. 予熱したPBSでニューロンを一度すすぎます。PBSを取り外し、トリス/BSAをステージングプレートから移します。インキュベーターに4分間戻ります。
3. インキュベーターから取り出し、培養プレートを氷の上に置きます。1x TRB-BSAで2 x 5分間すすぎます(ステップ2.1.2で調製)。
4. 最終すすぎ後、70 kDのTexas Red標識デキストラン(0.6 mg/mL)とHoechst(1:10,000)を1x TRB-BSAに添加します。プレートを室温で15分間ベンチに置き、光から保護します。
5. 共焦点顕微鏡で表象顕微鏡で観察し、原形質膜の透過率が最も高いバッファーとBSA濃度を特定しましたが、核膜は依然として70 kDのデキストランの侵入を制限しています(目標≥80%)。これらの条件は、後続の実験に使用します。

4. 核輸入アッセイ

1. 輸送反応の準備
   注:プレート内のすべての反応を同時に開始できるようにするには、ニューロンの透過化の前に、氷上のプラスチック製の96ウェルステージングプレートで反応ミックスを調製します。条件ごとに少なくとも 2 回のテクニカルレプリケートを実行します。各プレートにコントロールを含めます。
   1. 2.5 mg/mL の WCE、1x ERM、蛍光カーゴ(200 nM Rango)、および Hoechst 33342 (10 mg/mL、1:10,000) からなる塩基反応ミックスを 1x TRB-BSA に調製し、ウェルあたり 50 μL に十分です。オプション:輸送反応全体で核孔の完全性をモニタリングできるように、70 kDのテキサス赤色標識デキストランを含めます。ただし、核デキストランの排除を画像化するには共焦点顕微鏡が必要であることを念頭に置いてください。
      注:提供されるWCE濃度は、アッセイの最適化のための合理的な出発点です。WCEの各バッチの実証試験を実施して、目的の貨物の効率的な原子力輸入に必要な最適な濃度を決定します。WCEの異なるバッチで調製された反復データからのデータを組み合わせることは、インポート効率が異なる可能性があるため避けてください。
   2. (1)貨物のみ:Rango、ただしWCEまたはERMはなし、(2)阻害剤:蛍光貨物、ERM、WCE、および100μMインポータゾール(IPZ、インポーチンβ¹⁸の低分子阻害剤)を含むコントロールを準備します。代替阻害剤として、0.8 mg / mLの小麦胚芽凝集素(WGA)¹⁹を使用します。
      注:輸送を開始する前に、WCEを含むアッセイミックス中の阻害剤を少なくとも30分間平衡化します。最大限の阻害のためには、対応するウェルの浸透後のリンスステップにも阻害剤を含める必要があります。.
2. ニューロンを透過処理し、すすぎます
   1. ステップ3で特定した最適なバッチ特異的プロトコルに従ってニューロンを透過化します。
   2. 培養プレートをインキュベーターから取り出し、すぐに氷の上に置きます。1x TRB-BSAで2回、5分間すすぎます。指定ウェルのリンスにインヒビターを含めます。
3. トランスポート反応を実行します。
   1. 最終すすぎ後、1x TRB-BSAを取り出します。迅速に作業を進め、マルチチャンネルピペット(50 μL/ウェル)を使用して、プレミックス輸送反応を透過処理した細胞に移します。
   2. 直ちにプレートを室温のハイコンテント顕微鏡にロードしてタイムラプスイメージングを開始するか(ステップ4.4を参照)、プレートを光から保護されたベンチに置き、固定およびイメージングの前に所望の時間(例:30〜120分)反応を進行させます。
   3. 必要に応じて、4%パラホルムアルデヒド/PBSに15分間固定し、PBSで5分間2回すすぎ、後でイメージングするために50%グリセロール/PBSに移します。固定プレートを4°Cで光から保護します(最大1週間以上安定して)。
4. ライブイメージング
   注:この段階では、任意の画像取得および分析方法を適用してください。
   1. プレートをハイコンテント顕微鏡にロードします。実験サンプルを実行する前に、初期テストプレートを実行して、倍率、焦点、露光時間(HoechstおよびFITC)、間隔などのイメージングパラメータを最適化し、保存します。パラメータを保存して、後続の各プレートで再ロードします。
      注:定量分析では、蛍光輸入貨物(FITC)の露光時間を、定常状態または使用する最新の時点での飽和度より十分に低く設定してください。これをテストプレートを使用して確立し、実験条件全体で強度の変動を許容するために、半値飽和を目標とします。各フレームとタイムポイントのHoechst画像を収集して、その後の自動分析中に核を同定できるようにします。
   2. 必要に応じて、Hoechstをフォーカス波長として使用してフォーカスオフセットを調整し、イメージングプロトコルを実行します。5分ごとに30分間画像を収集します。必要に応じて、目的のインポート反応のイメージング速度と速度論に基づいて、間隔と反応時間を調整します。

5. 画像解析

1. 顕微鏡 の「レビュープレート」 ダイアログで、代表的なフレームからHoechst画像とFITC画像を開きます。 [Run Analysis ] タブで、[ Translocation-Enhanced ] モジュールを選択し、設定を構成します。コンパートメントイメージとして Hoechst、転座プローブイメージとして FITC を設定します。
2. コンパートメントの下で、おおよその核幅、ローカルバックグラウンドより上の強度、および最小/最大面積を調整します。ニューロンが集まる傾向があるため、 Auto Separate Touching Compartments をアクティブにします。結果を表示するには、[ テスト実行] を選択します。設定を調整して、ニューロン核の同定精度を最大化し、非ニューロン核または破片の誤った包含を制限します。
   注:グリア汚染が存在する場合、通常、核のサイズに基づいてこのステップで除外できます。最適なコンパートメント同定設定の決定は、精度と細胞数の間のトレードオフであり、アッセイ、細胞タイプ、および培養密度に応じて経験的に設定する必要があります。厳格なパラメーターは多数のセルを省略しますが、エラーは少なくなりますが、リベラルなパラメーターはより包括的ですが、より多くのエラーが含まれます。核サイズに影響を与える可能性のある異なる細胞集団(すなわち、疾患変異体)または治療法が含まれている場合は、実験内で複数のパラメータセットが必要なくならないように、すべての条件に対応するのに十分な広さのサイズ/強度パラメータを設定することをお勧めします。
3. 核エッジからのアーティファクトを回避するには、Hoechst染色によって定義されたコンパートメントエッジの内側と外側の数ピクセルの測定領域を定義します。倍率とビニングに応じて、内側の領域の距離を 2 〜 4 ピクセル、外側の領域の距離を 1 〜 2 ピクセルに設定します。外側の領域の幅 (1 から 2 ピクセル) を調整します。
4. 目的のバックグラウンド推定方法を選択します (既定値の [自動定数] をお勧めします)。 [データ ログの構成] で、平均内部強度、平均外部強度、内部/外部平均強度 (核と細胞質 (N/C) の比率) など、目的の出力パラメーターを選択します。解析パラメータを保存します。
   注:各実験内に内部のポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めることは、パラメータが関心のある生物学的イベントを検出するための感度を最大化することを確実にするために強く推奨されます。
5. [プレートユーティリティ]ダイアログを使用して、保存したパラメータを使用して目的のプレートで解析を実行し、測定値をエクスポートします。
6. 治療状態ごとにデータをレビューし、要約します。オプション:フィルターを適用して、プローブ強度= 0やN / C比の極値(つまり、<0.1および>100)などの非生理学的データを削除します。すべての条件と実験にフィルターを等しく適用します。
7. ベースライン蛍光の追加の補正として、ライセートとERが省略されたコントロールウェルにデータを正規化します。生物学的複製(すなわち、独立したニューロン培養調製物)間の比較を容易にするために、最終的な核インポートデータを時間0のパーセントとして表します。

原形質膜の選択的透過処理(図1A)は、プロトコールの最も重要なステップであり、核輸入の分析を進める前に検証する必要があります。各培養調製物によって異なるため、ステップ3で説明したように、初期滴定プレートを定期的に実行して、低張性Tris-HClバッファーとBSAクッションの最適なバッチ特異的濃度を特定します。透過率の低い細胞と?...

上記で詳述したプロトコルは、核インポート分析のために初代マウス皮質ニューロンの原形質膜を選択的に透過化するための信頼性と再現性のある方法を提供します。ここでは、β貨物(Rango)の直接輸入の原子力輸入分析の手法の応用を示していますが、これと同じアプローチを使用して、さまざまな蛍光貨物の受動的および能動的な輸入を分析することができます。...

著者は何も開示していません。

この作業はNINDS K08NS104273(To L.R.H.)の支援を受けました。