Kerntransport-Assays in permeabilisierten kortikalen Neuronen der Maus

Wir haben eine zuverlässige Methode zur selektiven Plasmamembranpermeabilisierung von primären kortikalen Mausneuronen für die automatisierte High-Content-Analyse des neuronalen nukleozytoplasmatischen Transports entwickelt.

Die Störung des nukleozytoplasmatischen Transports wird zunehmend mit der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Darüber hinaus gibt es eine zunehmende Anerkennung zellspezifischer Unterschiede in der Struktur des Kernporenkomplexes, was die Notwendigkeit erforderlich macht, die Kerntransportmethoden für den Einsatz in Neuronen anzupassen. Permeabilisierte Zellassays, bei denen die Plasmamembran selektiv durch Digitonin perforiert wird, werden häufig zur Untersuchung des passiven und aktiven Kerntransports in immortalisierten Zelllinien verwendet, wurden jedoch nicht auf neuronale Kulturen angewendet. In unseren ersten Versuchen beobachteten wir den raschen Verlust der Integrität der Kernmembran in primären kortikalen Neuronen der Maus, die selbst geringen Konzentrationen von Digitonin ausgesetzt waren. Wir stellten die Hypothese auf, dass neuronale Kernmembranen besonders anfällig für den Verlust der zytoplasmatischen Unterstützung sein könnten. Nach dem Testen mehrerer Ansätze zur Verbesserung der Kernstabilität beobachteten wir eine optimale nukleare Integrität nach hypotoner Lyse in Gegenwart eines konzentrierten Rinderserumalbuminkissens. Neuronale Kerne, die mit diesem Ansatz präpariert werden, importieren zuverlässig und energieabhängig rekombinante fluoreszierende Fracht, was die Analyse des Kernimports durch High-Content-Mikroskopie mit automatisierter Analyse erleichtert. Wir gehen davon aus, dass diese Methode für Untersuchungen des passiven und aktiven Kerntransports in primären Neuronen breit anwendbar sein wird.

Die Störung des nukleozytoplasmatischen Transports, d. h. des regulierten Transports von Proteinen und RNA zwischen Zellkern und Zytoplasma, wird zunehmend mit der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht (kürzlich überarbeitet¹). Wir und andere haben über strukturelle und funktionelle Störungen des nukleozytoplasmatischen Transportapparats in postmortalen Gewebe- und Tiermodellen von C9orf72 bei amyotropher Lateralsklerose (ALS) und frontotemporaler Demenz (FTD), Alzheimer und Huntington-Krankheit^berichtet 2,3,4,5 . Die Mechanismen und funktionellen Konsequenzen der nukleozytoplasmatischen Transportstörung für die Neurodegeneration sowie Ansätze zur therapeutischen Rettung sind derzeit erforschte Bereiche.

Kernporen sind große Transmembrankomplexe aus ~30 Nukleoporinproteinen, die die Diffusion kleiner Moleküle durch die Kernmembran ermöglichen, aber zunehmend den Durchgang von Frachten >40 kD über eine Permeabilitätsbarriere aus Phenylalanin-Glycin (FG)-reichen Nukleoporinen im zentralen Kanal^{einschränken 6}. Größere Ladungen, die Sequenzen des nuklearen Lokalisierungssignals (NLS) oder des nuklearen Exportsignals (NES) enthalten, durchlaufen einen aktiven, rezeptorvermittelten Transport durch die Pore über nukleäre Transportrezeptoren (Importine und Exportine) und einen steilen Gradienten des kleinen GTPase Ran durch die Kernmembran (kürzlich^{überprüfte 7}). Es wurde eine breite Palette von Methoden entwickelt, um die nukleäre Transportdynamik in kultivierten Zellen zu analysieren, einschließlich des Transports endogener Frachten und markierter Reporterkonstrukte, die als Substrate für die wichtigsten Unterklassen von Transportrezeptoren dienen. Solche Ansätze wurden leicht an^{Neuronen angepasst 2,5,8} und ermöglichen eine Auslesung von Störungen des Kerntransports im Kontext einer intakten, lebenden Zelle. In Lebendzell-Assays ist die Möglichkeit, Kerntransportreaktionen direkt zu manipulieren oder sie isoliert von anderen zellulären Prozessen zu untersuchen, jedoch begrenzt.

In permeabilisierten Zellassays wird die Plasmamembran selektiv perforiert und das Zytoplasma freigesetzt, wobei die Kernhülle und die Kernporenkomplexe intakt bleiben und in der Lage sind, entweder einen passiven oder einen energieabhängigen bidirektionalen Transport durchzuführen ^9,10. Solche Transportreaktionen können leicht durch Zugabe von Ganzzelllysaten, zytoplasmatischen Fraktionen oder gereinigten rekombinanten Kerntransportproteinen und deren Frachten rekonstituiert werden. Somit ermöglichen permeabilisierte Zellassays ein breites Spektrum an biochemischen oder biophysikalischen Untersuchungen, einschließlich der Verabreichung von rekombinanten oder synthetischen Proteinen und RNAs, die für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen relevant sind.

Angesichts von Berichten über zellspezifische Unterschiede in der Struktur des Kernporenkomplexes und der Transportdynamik^11,12 wollten wir den permeabilisierten Zellassay für den Einsatz in primären neuronalen Kulturen anpassen. Obwohl sie häufig zur Analyse des Kerntransports in immortalisierten Zelllinien verwendet wird, fanden wir trotz umfassender Literaturrecherche keine veröffentlichten Berichte über die Permeabilisierung der neuronalen Plasmamembran, die die Erhaltung der Integrität der Kernmembran bestätigten. Die meisten Protokolle beruhen auf Digitonin, einem Detergens, das auf die einzigartige Cholesterinzusammensetzung der Plasmamembran abzielt, um die Kernmembran zu perforieren, während die Kernmembran intakt bleibt¹³. Unsere ersten Versuche mit Digitonin in primären kortikalen Neuronen der Maus zeigten einen sofortigen Verlust der Integrität der Kernmembran, was durch die Diffusion eines 70 kD fluoreszierenden Dextrans in den Zellkern belegt wurde. Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Bruch der Kernhülle durch mechanische Störung durch den Verlust der zytoplasmatischen Unterstützung verursacht werden könnte, und testeten mehrere Optimierungsmethoden, einschließlich molekularem Crowding, Zytoskelett-Stabilisierung und alternativen Methoden der Zelllyse. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur schnellen hypotonen Permeabilisierung unter Verwendung eines konzentrierten Rinderserumalbumin-Kissens (BSA), um die neuronalen Kerne zu schützen und die nachgelagerte Analyse des neuronalen Kernimports zu erleichtern. Wir haben diese Methode kürzlich verwendet, um den Mechanismus der Dipeptid-Repeat-Protein-Disruption in C9orf72-ALS/FTD¹⁴ zu untersuchen und gehen davon aus, dass sie für zukünftige Studien zum passiven und aktiven Kerntransport in primären Neuronen breit anwendbar sein wird.

Zunächst beschreibt das Protokoll die Erzeugung primärer neuronaler Kulturen (Schritt 1) und die Vorbereitung der Materialien für den Transportassay (Schritt 2), gefolgt vom Transportassay selbst (Schritte 3-4) und der Bildaufnahme und -analyse (Schritt 5). Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Animal Care and Use Committee (ACUC) der Johns Hopkins University genehmigt.

1. Primäre kortikale Neuronenkulturen der Maus

1. Bereiten Sie die Stammlösungen vor.
   1. Dissektionspuffer: Kombinieren Sie 50 ml 10x HBSS, 15 ml 1 M Glukose (in dH₂O), 5 ml 1 M HEPES, 5 ml 100 mM Natriumpyruvat und 5 ml 100x Penicillin-Streptomycin. Das Volumen mit dH₂O auf 500 mL bringen. Sterilfilter steril filtern und bei 4 °C lagern.
   2. Papain: Papain auf 30 mg/ml mit Dissektionspuffer verdünnen. Bei 4 °C lagern.
   3. DNase: Verdünnen Sie DNase I auf 10 mg/ml mit Dissektionspuffer. Aliquotieren und bei -20 °C lagern.
   4. Beschichtungsmedium: Geben Sie 5 % fötales Rinderserum (FBS), 2 % B-27, 1 % Glutamax und 1 % Penicillin-Streptomycin in das neurobasale Medium. Steril filtrieren und bei 4 °C lagern.
   5. Fütterungsmedium: Geben Sie 2 % B-27, 1 % Glutamax und 1 % Penicillin-Streptomycin in das Neurobasalmedium. Bei 4 °C lagern.
2. Die Platten bestreichen.
   1. Beschichten Sie die optischen 96-Well-Platten mit Glasboden mit Poly-D-Lysin (20 μg/ml) und Laminin (1:100) in sterilem dH₂O. Legen Sie die Platte über Nacht in einen Inkubator.
   2. Spülen Sie die Vertiefungen am Tag der Dissektion dreimal mit sterilem dH₂O und ersetzen Sie sie durch neurobasales Medium. Äquilibrieren Sie mindestens 30 Minuten in einem Inkubator.
3. Präparieren und verdauen Sie die Kortexe.
   HINWEIS: Führen Sie die Sektion auf einer sauberen Bank mit autoklavierten Werkzeugen durch, um eine Kontamination der Kultur zu vermeiden.
   1. Euthanasieren Sie die schwangere Frau E15-16 C57BL/6J durch Zervixluxation. Besprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Arbeiten Sie schnell. Verwenden Sie eine Schere und eine Zahnzange, um einen Bauchschnitt in der Mittellinie zu machen, die Gebärmutter herauszuschneiden und dann die Embryonen aus der Fruchtblase in eine Petrischale zu übertragen. Enthaupten Sie die Embryonen mit einer Schere und sammeln Sie die Köpfe in einer 10 cm großen Petrischale, die Dissektionspuffer enthält.
   2. Unter einem Präpariermikroskop entfernst du mit einer feinen Pinzette den Schädel und schälst die Hirnhäute ab. Übertragen Sie das ganze Gehirn in eine frische 10 cm Petrischale, die Dissektionspuffer enthält. Trennen Sie die Hemisphären und entfernen Sie die subkortikalen Strukturen.
   3. Zerkleinern Sie die Kortikale mit einer sterilen Rasierklinge und geben Sie sie in ein konisches Röhrchen mit 5 ml Dissektionspuffer. Fügen Sie 100 μl Papain (Stamm 30 mg/ml, Endkonzentration 0,6 mg/ml) und 50 μl DNase (Stamm 10 mg/ml, Endkonzentration 0,1 mg/ml) hinzu. Im 37 °C warmen Wasserbad 10 Min. verdauen.
      HINWEIS: Eine Verdauung über 10 Minuten hinaus ist schädlich für das Überleben der Zelle.
   4. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn zweimal mit 10 ml Beschichtungsmedium, um die Verdauung zu stoppen. Lassen Sie das Gewebe zwischen den einzelnen Wäschen durch die Schwerkraft absetzen.
   5. In 2-ml-Plattierungsmedien mit der P1000-Pipette vorsichtig zerreiben, bis große Gewebestücke verschwunden sind (ca. 20 Mal). Fügen Sie weitere 8 mL Beschichtungsmedium hinzu, um das Volumen auf ca. 10 mL zu bringen, und leiten Sie die Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb.
4. Neuronen plattieren und pflegen.
   1. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren. Die Zellen in vorgewärmtem Beschichtungsmedium resuspendieren. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie sie im Beschichtungsmedium auf 500.000 Zellen/ml. Zum Mischen vorsichtig umdrehen und in ein steriles Mehrkanal-Reservoir überführen.
   2. Aspirieren Sie das neurobasale Medium aus den Vertiefungen und fügen Sie sofort 100 μl Zellen pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette (50.000 Zellen/Vertiefung) hinzu. Lassen Sie die beschichteten Vertiefungen nicht trocknen.
   3. Nach 24 Stunden Dissektion 50 % des Mediums mit dem Zuführmedium wechseln. Fahren Sie mit 50 % des Mediumwechsels jeden zweiten Tag bis zum 5. bis 7. Tag fort, um die In-vitro-Assays durchzuführen.

2. Vorbereitung der Komponenten des Kerntransportassays

1. Transportpuffer (TRB, angepasst ab¹⁵)
   1. Zur Herstellung von 5x TRB lösen Sie 100 mM HEPES, 550 mM KOAc, 10 mM Mg(OAc)₂, 25 mM NaOAc, 2,5 mM EGTA und 1,25 M Saccharose in dH₂O. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein und lagern Sie den Puffer bei 4 °C.
   2. Am Tag des Transportversuchs 1x TRB-BSA vorbereiten. Verdünnen Sie 5x TRB in dH₂O, fügen Sie EDTA-freien Proteaseinhibitor-Cocktail, 2 mM DTT und 50 mg/ml BSA hinzu.
2. Energieregenerationsmix (ERM, angepasst von ^9,16)
   1. Um 20x ERM herzustellen, lösen Sie 2 mM ATP-Lithiumsalz, 2 mM GTP-Lithiumsalz, 80 mM Kreatinphosphat und 400 U/mL Kreatinkinase in 1x TRB.
   2. Einmal-Aliquots bei -20 °C einfrieren.
3. Herstellung von Ganzzellextrakt (WCE, Quelle von Transportrezeptoren und Proteinen des Ran-Zyklus).
   HINWEIS: Zytoplasmatischer oder Ganzzellextrakt (WCE) kann verwendet werden, abhängig von den experimentellen Zielen. Hier wird die Herstellung von WCE beschrieben, wie sie in den initialen Neuronentransport-Assays¹⁰ verwendet wird.
   1. Züchten Sie HEK293T Zellen in fünfzehn 150-mm-Kulturschalen bis zum Zusammenfluss. Mit Trypsin-EDTA ablösen, in Medien mit 10 % fötalem Rinderserum resuspendieren, um Trypsin zu hemmen, und Zellen 5 min lang bei 200 x g pelletieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL eiskaltem 1x TRB mit frisch zugesetztem Proteasehemmer-Cocktail.
   2. Beschallung auf Eis, 3 x 10 Impulse, mit einem tragbaren Sonden-Ultraschallgerät. Durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 15 min bei 4 °C klären.
   3. Messen Sie die Proteinkonzentration (Ziel 8-10 mg/ml) und frieren Sie die Einweg-Aliquote in flüssigem Stickstoff vor der Lagerung bei -80 °C ein.
4. Rekombinante nukleare Importfracht
   ANMERKUNG: Das Transportprotokoll in den Schritten 3 bis 5 kann für jede fluoreszierende nukleare Transportladung angepasst werden, um den aktiven oder passiven nuklearen Transportweg von Interesse abzufragen. Hier beschreibt das Protokoll die Expression und den nuklearen Import von Rango (Ran-reguliertes Importin β Cargo), das aus der Importin-β-Bindungsdomäne von Importin α1 besteht, flankiert von den fluoreszierenden Proteinen CyPet und YPet^14,17. Rango ist ein vielseitiger Sensor, der sowohl für FRET- als auch für Nuklearimport-Assays verwendet werden kann, wo er als direkter Import β Fracht fungiert.
   1. E. coli BL21(DE3)-Zellen werden mit dem Rango-Plasmid (das ein N-terminales 6-His-Tag enthält) durch Hitzeschock wie folgt transformiert. Tauen Sie ein 50 μl Aliquot von BL21(DE3)-Zellen auf Eis auf. Mit 100-200 ng Plasmid kombinieren. Mixen, indem man 4-5 Mal auf das Röhrchen klopft und dann 30 Minuten auf Eis inkubiert, bevor es für 40 s auf eine 42 °C Platte gelegt wird. Sofort für weitere 2-5 Minuten wieder auf Eis legen.
   2. 900 μl SOC-Medium bei Raumtemperatur zugeben und auf einem Schüttler bei 37 °C 1 h inkubieren, bevor die Zellen auf einer vorgewärmten Agarplatte (1,5 % Agar, LB-Medien, 100 μg/ml Ampicillin) verteilt werden. Die Platte über Nacht bei 37 °C inkubieren. Lagern Sie die Platte bis zu 1 Woche bei 4 °C oder verwenden Sie sie sofort für die Proteinproduktion.
   3. Starten Sie die Proteinproduktion, indem Sie drei 25 mL Starterkulturen in 50 mL Röhrchen mit zunehmender Anzahl von Kolonien (~3-10) von der BL21(DE3) Platte inokulieren. Nach der Inkubation über Nacht bei 37 °C auf einem Schüttler werden die Kulturen mit OD_{600 nm} < 1,0 ausgewählt, um eine 1-Liter-Kultur in LB-Medien mit einem 2,8-Liter-Fernbach-Kolben ohne Leitblech zu inokulieren. Wachsen Sie bei 37 °C bis zu einem Außendurchmesser_{von 600 nm} = 0,1-0,3.
      HINWEIS: Die Verwendung älterer BL21(DE3) LB-Agarplatten oder eine hohe Dichte von Starterkulturen (OD_{600 nm} >1,0) können die Ausbeute und Reinheit der Proteinzubereitung verringern.
   4. Auf Raumtemperatur (22-25 °C) abkühlen lassen, indem sie auf Eis gelegt werden. Induzieren Sie die Proteinexpression mit 0,3 mM IPTG (Endkonzentration) und inkubieren Sie auf einem Shaker (80-120 U/min) bei Raumtemperatur für 12-14 h.
   5. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation (6.000 x g, 15 min, 4 °C) und resuspendieren Sie sie in 30 mL eiskaltem 10 mM Imidazol in PBS (pH 7,4), ergänzt mit einem EDTA-freien Proteasehemmer-Cocktail. In zwei Durchgängen durch eine eiskalte französische Druckzelle lysieren und das Lysat durch Zentrifugation klären (16.000 x g, 40 min, 4 °C).
   6. Inkubieren Sie das Lysat mit hochfließendem Agaroseharz mit Nickelaffinität (30-60 min, 4 °C) unter Verwendung von 1 ml Harz pro 1 l E. coli-Kultur . Das Harz in die Chromatographiesäulen geben, mit 10-20 Volumen eiskaltem 10 mM Imidazol/PBS (pH 7,4) waschen. Eluieren Sie Rango mit 25 mM Imidazol/PBS-Schritten (25-200 mM, pH 7,4) unter Verwendung eines 5-fachen Bettvolumens in jedem Schritt.
   7. Verwenden Sie SDS-PAGE, um die Chargen mit der höchsten Reinheit auszuwählen und zu poolen.
   8. Bereiten Sie den XB-Puffer vor, indem Sie 10 mM HEPES, 100 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ und 50 mM Saccharose in dH₂O auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,7 ein.
   9. Dialysieren Sie das Protein in XB-Puffer und konzentrieren Sie es durch Zentrifugation (7500 x g, 4 °C) auf einem Ultrafiltrationsgerät mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 30 kD.
   10. Die Proteinkonzentration wird mit der Bradford-Methode oder einer anderen bevorzugten Methode gemessen und die Einmalaliquote in flüssigem Stickstoff vor der Lagerung bei -80 °C eingefroren.

3. Bestimmung der optimalen Permeabilisierungsbedingungen der Plasmamembran

HINWEIS: Optimieren Sie aufgrund von Variationen zwischen den einzelnen Neuronenchargen die Permeabilisierungsbedingungen für jede Neuronencharge. Führen Sie diese am selben Tag vor der Durchführung von Kerntransport-Assays durch.

1. Bereiten Sie in einer 96-Well-Staging-Kunststoffplatte eine serielle Verdünnung von Tris-HCl pH 7,5 (um eine osmotische Quellung zu verursachen) bei 0 μM, 10 μM, 20 μM und 40 μM in jeder der drei BSA-Konzentrationen vor: 50 mg/ml, 100 mg/ml und 150 mg/ml (für molekulares Crowding/mechanische Unterstützung). Die Lösungen auf 37 °C vorwärmen.
2. Spülen Sie die Neuronen einmal in vorgewärmtem PBS. Entfernen Sie das PBS und übertragen Sie Tris/BSA von der Staging-Platte. Kehren Sie für 4 Minuten in den Inkubator zurück.
3. Aus dem Inkubator nehmen und die Kulturplatte auf Eis stellen. 2 x 5 min in 1x TRB-BSA spülen (wie in Schritt 2.1.2 vorbereitet).
4. Nach der letzten Spülung 70 kD Texas Red-labeled Dextran (0,6 mg/ml) und Hoechst (1:10.000) in 1x TRB-BSA zugeben. Lassen Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt auf der Bank stehen.
5. Aufnahme mit einem konfokalen Mikroskop zur Identifizierung des Puffers und der BSA-Konzentration, bei denen der Prozentsatz der Plasmamembranpermeabilisierung am höchsten ist, die Kernmembran jedoch immer noch den Eintritt des 70 kD-Dextrans einschränkt (Ziel ≥ 80%). Verwenden Sie diese Bedingungen für nachfolgende Experimente.

4. Nuklearimport-Assay

1. Vorbereiten der Transportreaktionen
   HINWEIS: Damit alle Reaktionen in der Platte gleichzeitig gestartet werden können, bereiten Sie die Reaktionsmischung in einer 96-Well-Staging-Kunststoffplatte auf Eis vor, bevor Sie die Neuronenpermeabilisierung durchführen. Führen Sie mindestens zwei technische Replikate pro Bedingung durch. Fügen Sie Steuerelemente auf jeder Platte ein.
   1. Bereiten Sie das Base-Reaktionsgemisch bestehend aus 2,5 mg/mL WCE, 1x ERM, Fluoreszenzfracht (200 nM Rango) und Hoechst 33342 (10 mg/mL, 1:10.000) in 1x TRB-BSA vor, ausreichend für 50 μL pro Well. OPTION: Fügen Sie 70 kD Texas Red Labeled Dextran hinzu, um die Überwachung der Integrität der Kernporen während der gesamten Transportreaktion zu ermöglichen, wobei zu beachten ist, dass eine konfokale Mikroskopie erforderlich ist, um den Ausschluss von Kerndextran abzubilden.
      HINWEIS: Die angegebene WCE-Konzentration ist ein vernünftiger Ausgangspunkt für die Assay-Optimierung. Führen Sie empirische Tests jeder WCE-Charge durch, um die optimale Konzentration zu bestimmen, die für einen effizienten nuklearen Import der gewünschten Ladung erforderlich ist. Vermeiden Sie die Kombination von Daten aus Replikaten, die mit verschiedenen WCE-Chargen erstellt wurden, da die Importeffizienz variieren kann.
   2. Bereiten Sie die Kontrollen vor, einschließlich (1) Fracht allein: Rango, aber kein WCE oder ERM und (2) Inhibitor: fluoreszierende Fracht, ERM, WCE und 100 μM Importazol (IPZ, ein niedermolekularer Inhibitor von Importin β¹⁸). Als alternativer Inhibitor verwenden Sie 0,8 mg/ml Weizenkeim-Agglutinin (WGA)¹⁹.
      HINWEIS: Die Inhibitoren in der Assay-Mischung, die WCE enthält, sind mindestens 30 Minuten vor Beginn des Transports zu äquilibrieren. Für eine maximale Hemmung sollten Spülschritte nach der Permeabilisierung in entsprechenden Vertiefungen auch den Inhibitor enthalten.
2. Permeabilisieren und spülen Sie die Neuronen
   1. Permeabilisieren Sie die Neuronen gemäß dem optimalen, chargenspezifischen Protokoll, das in Schritt 3 identifiziert wurde.
   2. Nehmen Sie die Kulturplatte aus dem Inkubator und legen Sie sie sofort auf Eis. 2x 5 min in 1x TRB-BSA spülen. Nehmen Sie einen Inhibitor in die Spülungen für die dafür vorgesehenen Vertiefungen auf.
3. Führen Sie die Transportreaktion aus.
   1. Nach der letzten Spülung 1x TRB-BSA entfernen. Verwenden Sie schnell eine Mehrkanalpipette (50 μl/Well), um die vorgemischten Transportreaktionen auf die permeabilisierten Zellen zu übertragen.
   2. Legen Sie die Platte sofort bei Raumtemperatur in ein Mikroskop mit hohem Inhalt, um die Zeitrafferbildgebung zu starten (siehe Schritt 4.4) oder legen Sie die Platte lichtgeschützt auf den Tisch und lassen Sie die Reaktion für den gewünschten Zeitraum (z. B. 30-120 min) vor der Fixierung und Bildgebung ablaufen.
   3. Falls gewünscht, 15 min lang 4 % Paraformaldehyd/PBS fixieren, 2x 5 min lang in PBS spülen und für die spätere Bildgebung auf 50 % Glycerin/PBS übertragen. Bewahren Sie die festen Platten lichtgeschützt bei 4 °C auf (stabil bis zu 1 Woche oder länger).
4. Live-Bildgebung
   HINWEIS: Wenden Sie in dieser Phase eine beliebige Bildaufnahme- und Analysemethode an.
   1. Laden Sie die Platte in ein Mikroskop mit hohem Inhalt. Führen Sie eine erste Testplatte durch, um Bildgebungsparameter wie Vergrößerung, Fokus, Belichtungszeiten (Hoechst und FITC) und Intervalle vor der Durchführung von experimentellen Proben zu optimieren und zu speichern. Speichern Sie die Parameter, um sie mit jeder nachfolgenden Platte neu zu laden.
      HINWEIS: Für die quantitative Analyse ist die Belichtungszeit für die fluoreszierende Importfracht (FITC) deutlich unter die Sättigung im stationären Zustand oder den spätesten zu verwendenden Zeitpunkt einzustellen. Stellen Sie dies mit der Testplatte her, wobei die halbmaximale Sättigung angestrebt wird, um Schwankungen der Intensität unter den Versuchsbedingungen zu ermöglichen. Sammeln Sie die Hoechst-Bilder für jedes Bild und jeden Zeitpunkt, um die nukleare Identifizierung bei der anschließenden automatisierten Analyse zu ermöglichen.
   2. Passen Sie bei Bedarf den Fokusversatz mit Hoechst als Fokuswellenlänge an und führen Sie das Bildgebungsprotokoll aus. Sammeln Sie die Bilder alle 5 Minuten für 30 Minuten. Passen Sie das Intervall und die Reaktionszeit nach Bedarf an, basierend auf der Bildgebungsgeschwindigkeit und der Kinetik der interessierenden Importreaktion.

5. Bildanalyse

1. Öffnen Sie im Dialogfeld "Prüfplatte des Mikroskops" Hoechst- und FITC-Bilder aus einem repräsentativen Rahmen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Analyse ausführen " die Option " Translocation-Enhanced-Modul " aus, und konfigurieren Sie die Einstellungen. Legen Sie Hoechst als Kompartimentbild und FITC als Translokationssondenbild fest.
2. Passen Sie unter Kompartimente die ungefähre Kernbreite, die Intensität über dem lokalen Hintergrund und die minimale/maximale Fläche an. Aktivieren Sie die Option "Automatisch getrennte Berührungskompartimente ", da die Neuronen dazu neigen, sich zu gruppieren. Zeigen Sie die Ergebnisse an, indem Sie Testlauf auswählen. Passen Sie die Einstellungen an, um die Genauigkeit der Identifizierung neuronaler Kerne zu maximieren und gleichzeitig die fehlerhafte Einbeziehung von nicht-neuronalen Kernen oder Trümmern zu begrenzen.
   HINWEIS: Eine gliale Kontamination, falls vorhanden, kann in diesem Schritt in der Regel auf der Grundlage der Kerngröße ausgeschlossen werden. Die Bestimmung der optimalen Einstellungen für die Kompartimentidentifikation ist ein Kompromiss zwischen Genauigkeit und Zellzahl und muss je nach Assay, Zelltyp und Kulturdichte empirisch festgelegt werden. Stringente Parameter lassen zahlreiche Zellen aus, enthalten aber weniger Fehler, während liberale Parameter umfassender sind, aber mehr Fehler enthalten. Wenn verschiedene Zellpopulationen (d. h. Krankheitsmutanten) oder Behandlungen einbezogen werden, die die Kerngröße beeinflussen können, empfehlen wir, Größen-/Intensitätsparameter festzulegen, die breit genug sind, um alle Bedingungen zu berücksichtigen, um zu vermeiden, dass mehrere Parametersätze innerhalb eines Experiments erforderlich sind.
3. Um Artefakte von der Kernkante zu vermeiden, definieren Sie Messbereiche von mehreren Pixeln innerhalb und außerhalb der Kompartimentkante, die durch die Hoechst-Färbung definiert wird. Legen Sie je nach Vergrößerung und Binning 2-4 Pixel für den Abstand des inneren Bereichs und 1-2 Pixel für den Abstand des äußeren Bereichs fest. Passen Sie die Breite des äußeren Bereichs an (1-2 Pixel).
4. Wählen Sie die gewünschte Hintergrundschätzungsmethode aus (die Standardeinstellung " Automatische Konstante " wird empfohlen). Wählen Sie unter Datenprotokoll konfigurieren die gewünschten Ausgabeparameter aus, einschließlich der mittleren inneren Intensität, der mittleren äußeren Intensität und der inneren/äußeren mittleren Intensität (das Verhältnis von Kern zu Zytoplasma (N/C)). Speichern Sie die Analyseparameter.
   HINWEIS: Die Einbeziehung interner Positiv- und Negativkontrollen in jedes Experiment wird dringend empfohlen, um sicherzustellen, dass die Parameter die Sensitivität maximieren, um das biologische Ereignis von Interesse zu erkennen.
5. Verwenden Sie das Dialogfeld Platten-Dienstprogramme , um die Analyse auf den gewünschten Platten mit den gespeicherten Parametern durchzuführen und die Messungen zu exportieren.
6. Überprüfen und fassen Sie die Daten nach Behandlungsbedingung zusammen. OPTION: Wenden Sie Filter an, um nicht-physiologische Daten zu entfernen, z. B. Sondenintensität = 0 und Extreme des N/C-Verhältnisses (z. B. <0,1 und >100). Wenden Sie alle Filter gleichermaßen auf alle Bedingungen und Experimente an.
7. Als zusätzliche Korrektur für die Baseline-Fluoreszenz normalisieren Sie die Daten auf die Kontrollwells, in denen Lysat und ER weggelassen wurden. Um Vergleiche zwischen biologischen Replikaten (d. h. unabhängigen neuronalen Kulturpräparaten) zu erleichtern, drücken Sie die endgültigen Kernimportdaten als Prozentsatz der Zeit 0 aus.

Die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran (Abbildung 1A) ist der kritischste Schritt im Protokoll und muss überprüft werden, bevor mit der Analyse des Kernimports fortgefahren wird. Aufgrund der Unterschiede zwischen den einzelnen Kulturvorbereitungen wird routinemäßig eine erste Titrationsplatte durchgeführt, um die optimalen, chargenspezifischen Konzentrationen von hypotonem Tris-HCl-Puffer und BSA-Kissen zu identifizieren, wie in Schritt 3 be...

Das oben beschriebene Protokoll bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran primärer kortikaler Mausneuronen für die Kernimportanalyse. Hier wird eine Anwendung der Methode zur nuklearen Importanalyse einer direkten Importin- β Ladung (Rango) gezeigt, aber der gleiche Ansatz kann auch zur Analyse des passiven und aktiven Imports einer Vielzahl von fluoreszierenden Ladungen verwendet werden. Die Permeabilisierung ermöglicht ...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit wurde unterstützt von NINDS K08NS104273 (an L.R.H.).