מבחני הובלה גרעינית בנוירונים בקליפת המוח של עכברים חדירים

פיתחנו שיטה אמינה של חדירות סלקטיבית של קרום הפלזמה של נוירונים ראשוניים בקליפת המוח של העכבר לניתוח אוטומטי של תוכן גבוה של הובלה נוקלאוציטופלזמית עצבית.

שיבוש בהובלה נוקלאוציטופלזמית מעורב יותר ויותר בפתוגנזה של מחלות נוירודגנרטיביות. יתר על כן, ישנה הכרה הולכת וגוברת בהבדלים ספציפיים לתאים במבנה קומפלקס הנקבוביות הגרעיניות, מה שמעורר את הצורך להתאים שיטות הובלה גרעיניות לשימוש בנוירונים. מבחני תאים חדירים, שבהם קרום הפלזמה מחורר באופן סלקטיבי על ידי דיגיטונין, נמצאים בשימוש נרחב לחקר הובלה גרעינית פסיבית ואקטיבית בקווי תאים אימורטליים, אך לא יושמו על תרביות עצביות. בניסיונות הראשוניים שלנו, ראינו את האובדן המהיר של שלמות הממברנה הגרעינית בתאי עצב ראשוניים בקליפת המוח של עכברים שנחשפו אפילו לריכוזים נמוכים של דיגיטונין. שיערנו כי ממברנות גרעיניות עצביות עשויות להיות פגיעות באופן ייחודי לאובדן תמיכה ציטופלזמית. לאחר בדיקת גישות מרובות לשיפור היציבות הגרעינית, ראינו שלמות גרעינית אופטימלית לאחר ליזה היפוטונית בנוכחות כרית אלבומין מרוכזת בסרום בקר. גרעינים עצביים שהוכנו בגישה זו מייבאים באופן אמין מטען פלואורסצנטי רקומביננטי באופן תלוי אנרגיה, מה שמקל על ניתוח יבוא גרעיני על ידי מיקרוסקופיה בעלת תכולה גבוהה עם ניתוח אוטומטי. אנו צופים ששיטה זו תהיה ישימה באופן נרחב למחקרים של הובלה גרעינית פסיבית ואקטיבית בתאי עצב ראשוניים.

שיבוש בהובלה נוקלאוציטופלזמית, סחר מוסדר של חלבונים ו-RNA בין הגרעין לציטופלזמה, מעורב יותר ויותר בפתוגנזה של מחלות נוירודגנרטיביות (נסקר לאחרונה¹). אנו ואחרים דיווחנו על שיבוש מבני ותפקודי של מנגנון ההובלה הנוקליאוציטופלזמי ברקמות שלאחר המוות ובמודלים של בעלי חיים של C9orf72 טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) ודמנציה פרונטו-טמפורלית (FTD), מחלת אלצהיימר ומחלת הנטינגטון 2,3,4,5 . המנגנונים וההשלכות התפקודיות של הפרעה בהובלה נוקלאוציטופלזמית לניוון עצבי, וגישות להצלה טיפולית, הם תחומי מחקר מתמשכים.

נקבוביות גרעיניות הן קומפלקסים טרנסממברניים גדולים של ~30 חלבוני נוקלאופורין המאפשרים דיפוזיה של מולקולות קטנות על פני הממברנה הגרעינית אך מגבילים יותר ויותר את מעבר המטענים >40 קילו-קילוואט באמצעות מחסום חדירות של נוקלאופורינים עשירים בפנילאלנין-גליצין (FG) בתעלה המרכזית⁶. מטענים גדולים יותר המכילים רצפי אות לוקליזציה גרעינית (NLS) או אותות יצוא גרעיני (NES) עוברים הובלה פעילה בתיווך קולטן על פני הנקבובית באמצעות קולטני הובלה גרעיניים (יבוא ויצוא) ושיפוע תלול של GTPase הקטן שרץ על פני הממברנה הגרעינית (נבדק לאחרונה⁷). פותח מגוון רחב של שיטות לניתוח דינמיקת הובלה גרעינית בתאים מתורבתים, כולל סחר במטענים אנדוגניים ומבני מדווח מתויגים המשמשים כמצעים לתת-הקבוצות העיקריות של קולטני הובלה. גישות כאלה הותאמו בקלות לתאי עצב ^2,5,8 ומספקות קריאה של הפרעות הובלה גרעיניות בהקשר של תא חי שלם. עם זאת, במבחני תאים חיים, היכולת לתמרן ישירות תגובות הובלה גרעינית או לחקור אותן בבידוד מתהליכים תאיים אחרים מוגבלת.

במבחני תאים חדירים, קרום הפלזמה מחורר באופן סלקטיבי, והציטופלזמה משתחררת, ומשאירה את המעטפת הגרעינית ומתחמי הנקבוביות הגרעיניות שלמים ומסוגלים לבצע הובלה דו-כיוונית פסיבית או תלויה באנרגיה ^9,10. ניתן לשחזר תגובות הובלה כאלה בקלות על ידי הוספת ליזטים של תאים שלמים, שברים ציטופלזמיים או חלבוני הובלה גרעיניים רקומביננטיים מטוהרים ומטענם. לפיכך, בדיקות תאים חדירים מאפשרות מגוון רחב של חקירות ביוכימיות או ביופיזיקליות, כולל אספקת חלבונים רקומביננטיים או סינתטיים ו-RNA הרלוונטיים לחקר מחלות ניווניות.

בהתחשב בדיווחים על הבדלים ספציפיים לתאים במבנה מורכב הנקבוביות הגרעיניות ובדינמיקת ההובלה^11,12, שאפנו להתאים את בדיקת התא החדור לשימוש בתרביות עצביות ראשוניות. למרות שנעשה בו שימוש נרחב לניתוח הובלה גרעינית בשורות תאים אימורטליות, למרות חיפוש ספרות ממצה, לא מצאנו דיווחים שפורסמו על חדירת קרום פלזמה עצבית שאימתו את שימור שלמות הממברנה הגרעינית. רוב הפרוטוקולים מסתמכים על דיגיטונין, חומר ניקוי המכוון להרכב הכולסטרול הייחודי של קרום הפלזמה, כדי לנקב את הממברנה הגרעינית תוך השארת הממברנה הגרעינית שלמה¹³. הניסיונות הראשוניים שלנו להשתמש בדיגיטונין בתאי עצב ראשוניים בקליפת המוח של העכבר הראו אובדן מיידי של שלמות הממברנה הגרעינית, כפי שמעיד דיפוזיה של דקסטרן פלואורסצנטי של 70 קילו-קילומטר לתוך הגרעין. שיערנו שקרע במעטפת הגרעינית עשוי להיגרם על ידי הפרעה מכנית מאובדן תמיכה ציטופלזמית, ובדקנו מספר שיטות אופטימיזציה, כולל צפיפות מולקולרית, ייצוב שלד ציטו ושיטות חלופיות של ליזה תאית. כאן, אנו מפרטים שיטה של חדירה היפוטונית מהירה באמצעות כרית אלבומין מרוכזת בסרום בקר (BSA) כדי להגן על גרעיני עצב ולהקל על ניתוח במורד הזרם של יבוא גרעיני עצבי. לאחרונה השתמשנו בשיטה זו כדי להעריך את המנגנון של שיבוש חלבון חוזר של דיפפטיד ב-C9orf72-ALS/FTD¹⁴ וצופים שהיא תהיה ישימה באופן נרחב למחקרים עתידיים של הובלה גרעינית פסיבית ואקטיבית בתאי עצב ראשוניים.

ראשית, הפרוטוקול מתאר יצירת תרביות עצביות ראשוניות (שלב 1) והכנת חומרים לבדיקת ההובלה (שלב 2), ולאחר מכן בדיקת ההובלה עצמה (שלבים 3-4) ורכישת תמונה וניתוח (שלב 5). כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (ACUC) של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

1. תרביות נוירונים ראשוניות בקליפת המוח של העכבר

1. הכן את פתרונות המלאי.
   1. מאגר דיסקציה: שלב 50 מ"ל של 10x HBSS, 15 מ"ל של 1 M גלוקוז (ב-dH₂O), 5 מ"ל של 1 M HEPES, 5 מ"ל של 100 מ"מ נתרן פירובט ו-5 מ"ל של 100x פניצילין-סטרפטומיצין. הביאו נפח ל-500 מ"ל עם dH₂O. מסנן סטרילי ואחסנו ב-4 מעלות צלזיוס.
   2. פפאין: יש לדלל את הפפאין ל-30 מ"ג/מ"ל עם מאגר דיסקציה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. DNase: מדלל DNase I ל-10 מ"ג/מ"ל עם מאגר דיסקציה. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
   4. מדיום ציפוי: הוסף 5% סרום בקר עוברי (FBS), 2% B-27, 1% גלוטמקס ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין למדיום הנוירו-בסיסי. מסננים סטריליים ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   5. אמצעי האכלה: יש להוסיף 2% B-27, 1% גלוטמקס ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין למדיום הנוירו-בסיסי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. מצפים את הצלחות.
   1. מצפים את צלחות 96 הבארות עם תחתית הזכוכית האופטית בפולי-D-ליזין (20 מיקרוגרם/מ"ל) ולמינין (1:100) ב-dH_{סטרילי 2}O. מניחים את הצלחת באינקובטור למשך הלילה.
   2. ביום הדיסקציה יש לשטוף את הבארות שלוש פעמים ב-dH₂O סטרילי ולהחליף במדיום נוירו-בזאלי. שיווי משקל בחממה למשך 30 דקות לפחות.
3. לנתח ולעכל את קליפת המוח.
   הערה: בצע דיסקציה על ספסל נקי באמצעות כלים חיטוי למניעת זיהום תרבית.
   1. המתת חסד של נקבה בהריון E15-16 C57BL/6J על ידי פריקת צוואר הרחם. רססו את הבטן עם 70% אתנול. עבוד במהירות. השתמש במספריים ובמלקחיים עם שיניים כדי לבצע חתך בטן בקו האמצע, לכרות את הרחם ולאחר מכן להעביר את העוברים משק מי השפיר לצלחת פטרי. ערפו את ראשי העוברים במספריים ואספו ראשים בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ המכילה מאגר דיסקציה.
   2. תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר את הגולגולת ולקלף את קרומי המוח. העבירו מוחות שלמים לצלחת פטרי טרייה בגודל 10 ס"מ המכילה מאגר דיסקציה. הפרד את חצאי הכדור והסר את המבנים התת-קורטיקליים.
   3. קוצצים את קליפת המוח בעזרת סכין גילוח סטרילי ומעבירים אותם לצינור חרוטי המכיל 5 מ"ל של מאגר דיסקציה. הוסף 100 מיקרוליטר פפאין (מלאי 30 מ"ג/מ"ל, ריכוז סופי 0.6 מ"ג/מ"ל) ו-50 מיקרוליטר DNase (מלאי 10 מ"ג/מ"ל, ריכוז סופי 0.1 מ"ג/מ"ל). עיכול באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      הערה: עיכול מעבר ל-10 דקות מזיק להישרדות התאים.
   4. הסר את הסופרנטנט ושטוף פעמיים עם 10 מ"ל של חומר ציפוי כדי לעצור את העיכול. אפשר לרקמה להתיישב בכוח הכבידה בין כל שטיפה.
   5. יש לשלש בעדינות במצע ציפוי של 2 מ"ל עם פיפטה P1000 עד שנעלמות חתיכות רקמה גדולות (בערך פי 20). הוסף עוד 8 מ"ל של אמצעי ציפוי כדי להביא את הנפח לכ-10 מ"ל ולהעביר את מתלה התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
4. צלחת ותחזק נוירונים.
   1. צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את התאים במדיום ציפוי שחומם מראש. ספרו את התאים ודללו ל-500,000 תאים/מ"ל במדיום הציפוי. הפוך בעדינות כדי לערבב ולהעביר למאגר רב ערוצי סטרילי.
   2. שאפו את המדיה הנוירו-בזאלית מהבארות והוסיפו מיד 100 מיקרוליטר תאים לבאר עם פיפטה רב-ערוצית (50,000 תאים לבאר). אל תאפשר לבארות המצופות להתייבש.
   3. לאחר 24 שעות של דיסקציה, החלף 50% מהמדיום עם מדיום ההזנה. המשך בשינוי בינוני של 50% כל יומיים עד יום 5-7 כדי לבצע את מבחני המבחנה .

2. הכנת רכיבי בדיקת ההובלה הגרעינית

1. מאגר תחבורה (TRB, מותאם^מ-15)
   1. להכנת 5x TRB, ממיסים 100 מ"מ HEPES, 550 מ"מ KOAc, 10 מ"מ Mg(OAc)₂, 25 מ"מ NaOAc, 2.5 מ"מ EGTA ו-1.25 מ' סוכרוז ב-dH₂O. כוונן את ה-pH ל-7.3 ואחסן את המאגר ב-4 מעלות צלזיוס.
   2. ביום ניסוי ההובלה, הכינו 1x TRB-BSA. יש לדלל 5x TRB ב-dH₂O, להוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA, 2 מ"מ של DTT ו-50 מ"ג/מ"ל של BSA.
2. תמהיל התחדשות אנרגיה (ERM, מותאם^מ-9,16)
   1. להכנת 20x ERM, ממיסים מלח ליתיום 2mM ATP, מלח ליתיום 2 מ"מ GTP, 80 מ"מ קריאטין פוספט ו-400 U/mL קריאטין קינאז ב-1x TRB.
   2. הקפיאו כמויות חד פעמיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3. הכנת תמצית תאים שלמים (WCE, מקור קולטני הובלה וחלבוני מחזור Ran).
   הערה: ניתן להשתמש בתמצית ציטופלזמית או תאים שלמים (WCE), בהתאם למטרות הניסוי. כאן, הכנת WCE מתוארת כמשמשת במבחני הובלת הנוירונים הראשוניים¹⁰.
   1. גדל תאים HEK293T למפגש בחמש עשרה צלחות תרבית של 150 מ"מ. יש לנתק עם טריפסין-EDTA, להשעות מחדש במדיה המכילה 10% סרום בקר עוברי כדי לעכב טריפסין, ותאי גלולה ב-200 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את התאים ב-10 מ"ל של 1x TRB קר כקרח עם קוקטייל מעכב פרוטאז טרי שנוסף.
   2. סוניקט על קרח, 3 x 10 פולסים, באמצעות סוניקטור בדיקה ידני. הבהירו על ידי צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   3. מדוד את ריכוז החלבון (יעד 8-10 מ"ג/מ"ל) והקפיא במהירות את הכמות החד פעמית בחנקן נוזלי לפני האחסון ב-80 מעלות צלזיוס.
4. מטען יבוא גרעיני רקומביננטי
   הערה: פרוטוקול ההובלה בשלבים 3-5 עשוי להיות מותאם לכל מטען הובלה גרעינית פלואורסצנטית, כדי לחקור את נתיב ההובלה הגרעינית האקטיבי או הפסיבי המעניין. כאן, הפרוטוקול מתאר את הביטוי והייבוא הגרעיני של Rango (מטען β של יבוא מוסדר על ידי Ran), המורכב מתחום קשירת β של importin α1 המוקף בחלבונים הפלואורסצנטיים CyPet ו-YPet^14,17. רנגו הוא חיישן רב-תכליתי שיכול לשמש לבדיקות FRET כמו גם יבוא גרעיני, שם הוא מתפקד כמטען β יבוא ישיר.
   1. הפוך תאי E. coli BL21 (DE3) עם הפלסמיד של Rango (המכיל תג N-terminal 6-His ) על ידי הלם חום כדלקמן. להפשיר 50 מיקרוליטר של תאי BL21(DE3) על קרח. שלב עם 100-200 ננוגרם פלסמיד. יש לערבב על ידי הקשה על השפופרת 4-5 פעמים ולאחר מכן לדגור על קרח למשך 30 דקות לפני הנחתם על צלחת של 42 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות. מעבירים מיד חזרה לקרח למשך 2-5 דקות נוספות.
   2. הוסף 900 מיקרוליטר של מדיה SOC בטמפרטורת החדר ודגירה על שייקר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני פיזור התאים על צלחת אגר מחוממת מראש (1.5% אגר, מדיה LB, 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין). דוגרים את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. אחסן את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבוע או השתמש בה מיד לייצור חלבון.
   3. התחל את ייצור החלבון על ידי חיסון שלוש תרביות התחלה של 25 מ"ל בצינורות של 50 מ"ל עם מספר הולך וגדל של מושבות (~3-10) מצלחת BL21(DE3). לאחר הדגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר, בחר את התרביות עם OD_{600 ננומטר} <-1.0 כדי לחסן תרבית של 1 ליטר במדיה LB באמצעות בקבוק פרנבך נטול בלבול בנפח 2.8 ליטר. גדל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להגעה ל-OD_{600 ננומטר} = 0.1-0.3.
      הערה: השימוש בצלחות אגר BL21 (DE3) LB ישנות יותר או בצפיפות גבוהה של תרביות התחלה (OD_{600 ננומטר} >1.0) עלול להפחית את התשואה והטוהר של הכנת החלבון.
   4. מצננים לטמפרטורת החדר (22-25 מעלות צלזיוס) על ידי הנחת קרח. לגרום לביטוי חלבון עם 0.3 מ"מ IPTG (ריכוז סופי) ולדגור על שייקר (80-120 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 12-14 שעות.
   5. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה (6,000 x גרם, 15 דקות, 4 מעלות צלזיוס) והשהה מחדש ב-30 מ"ל של 10 מ"מ אימידזול קר כקרח ב-PBS (pH 7.4), בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA. ליז בשניים עובר דרך תא לחץ צרפתי קר כקרח ומבהיר את הליזאט על ידי צנטריפוגה (16,000 x גרם, 40 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
   6. דגרו את הליזאט עם שרף אגרוז זיקה ניקל בזרימה גבוהה (30-60 דקות, 4 מעלות צלזיוס), באמצעות 1 מ"ל שרף לכל 1 ליטר של תרבית E. coli . מניחים את השרף בעמודות הכרומטוגרפיה, שוטפים עם 10-20 נפחים של 10 מ"מ אימידזול/PBS קרים כקרח (pH 7.4). Elute Rango עם מרווחים של 25 מ"מ אימידזול/PBS (25-200 מ"מ, pH 7.4), תוך שימוש בנפח מיטה פי 5 בכל שלב.
   7. השתמש ב-SDS-PAGE כדי לבחור ולאגד את האצוות עם הטוהר הגבוה ביותר.
   8. הכן מאגר XB על ידי המסת 10 מ"מ HEPES, 100 מ"מ KCl, 10 מ"מ CaCl₂, 1 מ"מ MgCl₂ ו-50 מ"מ סוכרוז ב-dH₂O. התאם את ה-pH ל-7.7.
   9. דיאליזה של החלבון במאגר XB ותרכז על ידי צנטריפוגה (7500 x גרם, 4 מעלות צלזיוס) במכשיר אולטרה-סינון עם חתך משקל מולקולרי של 30 kD.
   10. מדוד את ריכוז החלבון בשיטה ברדפורד או בשיטה מועדפת אחרת, והקפיא במהירות חנקן נוזלי חד פעמי לפני האחסון ב-80 מעלות צלזיוס.

3. קביעת תנאי החדירה האופטימליים של קרום הפלזמה

הערה: עקב הבדלים בין כל אצווה של נוירונים, מטב את תנאי החדירות עבור כל אצווה של נוירונים. בצע זאת באותו יום לפני ביצוע בדיקות הובלה גרעינית.

1. בצלחת בימוי מפלסטיק של 96 בארות, הכינו דילול סדרתי של Tris-HCl pH 7.5 (כדי לגרום לנפיחות אוסמוטית), ב-0 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, 20 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר בכל אחד משלושת ריכוזי ה-BSA: 50 מ"ג/מ"ל, 100 מ"ג/מ"ל ו-150 מ"ג/מ"ל (לצפיפות מולקולרית/תמיכה מכנית). מחממים את התמיסות ל -37 מעלות צלזיוס.
2. שטפו את הנוירונים פעם אחת ב-PBS שחומם מראש. הסר את ה-PBS והעבר את Tris/BSA מלוחית ההיערכות. מחזירים לחממה למשך 4 דקות.
3. מוציאים מהחממה ומניחים את צלחת התרבות על קרח. שטפו 2 x 5 דקות ב-1x TRB-BSA (כפי שהוכן בשלב 2.1.2).
4. לאחר השטיפה האחרונה, הוסף 70 kD של דקסטרן עם תווית אדומה של טקסס (0.6 מ"ג/מ"ל) והוכסט (1:10,000) ב-1x TRB-BSA. השאירו את הצלחת על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, מוגנת מפני אור.
5. תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לזיהוי המאגר וריכוז ה-BSA שבו אחוז החדירות של קרום הפלזמה הוא הגבוה ביותר, אך הממברנה הגרעינית עדיין מגבילה את כניסת הדקסטרן 70 kD (יעד ≥ 80%). השתמש בתנאים אלה לניסויים הבאים.

4. בדיקת יבוא גרעיני

1. הכן את תגובות ההובלה
   הערה: כדי לאפשר להתחיל את כל התגובות בצלחת בו זמנית, הכינו תערובת תגובה בצלחת בימוי מפלסטיק של 96 בארות על קרח, לפני חדירת הנוירונים. בצע לפחות שני שכפולים טכניים לכל תנאי. כלול פקדים בכל צלחת.
   1. הכן את תערובת התגובה הבסיסית המורכבת מ-2.5 מ"ג/מ"ל של WCE, 1x ERM, מטען פלואורסצנטי (200 ננומטר רנגו) ו-Hoechst 33342 (10 מ"ג/מ"ל, 1:10,000) ב-1x TRB-BSA, מספיק ל-50 מיקרוליטר לבאר. אפשרות: כלול דקסטרן טקסס עם תווית אדומה של 70 קילו-קילוגרם כדי לאפשר ניטור של שלמות הנקבוביות הגרעיניות לאורך תגובת ההובלה, תוך התחשבות בכך שיש צורך במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לצלם הדרה של דקסטרן גרעיני.
      הערה: ריכוז ה-WCE המסופק הוא נקודת התחלה סבירה לאופטימיזציה של הבדיקה. לבצע בדיקות אמפיריות של כל אצווה של WCE כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי הנדרש לייבוא גרעיני יעיל של המטען הרצוי. הימנע משילוב נתונים משכפולים שהוכנו עם קבוצות שונות של WCE מכיוון שיעילות הייבוא עשויה להשתנות.
   2. הכן את הבקרות הכוללות (1) מטען בלבד: רנגו, אך ללא WCE או ERM ו-(2) מעכב: מטען פלואורסצנטי, ERM, WCE, ו-100 מיקרומטר importazole (IPZ, מעכב מולקולה קטנה של importin β¹⁸). כמעכב חלופי, השתמש ב-0.8 מ"ג/מ"ל של נבט חיטה אגלוטינין (WGA)¹⁹.
      הערה: אזנו את המעכבים בתערובת הבדיקה המכילה WCE למשך 30 דקות לפחות לפני תחילת ההובלה. לעיכוב מקסימלי, שלבי שטיפה לאחר חדירה בבארות מתאימות צריכים לכלול גם את המעכב.
2. לחלחל ולשטוף את הנוירונים
   1. לחדור את הנוירונים על פי הפרוטוקול האופטימלי הספציפי לאצווה שזוהה בשלב 3.
   2. הסר את צלחת התרבות מהחממה והניח אותה מיד על קרח. יש לשטוף פעמיים למשך 5 דקות ב-1x TRB-BSA. כלול מעכב בשטיפות לבארות ייעודיות.
3. הפעל את תגובת ההובלה.
   1. לאחר השטיפה האחרונה, יש להסיר 1x TRB-BSA. בעבודה מהירה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית (50 מיקרוליטר לבאר) כדי להעביר את תגובות ההובלה המעורבות מראש לתאים החדירים.
   2. טען מיד את הצלחת במיקרוסקופ בעל תכולה גבוהה בטמפרטורת החדר כדי ליזום הדמיית זמן-lapse (ראה שלב 4.4) או הנח את הצלחת על הספסל, מוגנת מפני אור, ואפשר לתגובה להמשיך לפרק הזמן הרצוי (למשל, 30-120 דקות) לפני הקיבוע וההדמיה.
   3. אם רוצים, יש לקבע 4% פרפורמלדהיד/PBS למשך 15 דקות, לשטוף פעמיים למשך 5 דקות ב-PBS ולהעביר ל-50% גליצרול/PBS להדמיה מאוחרת יותר. שמור על הלוחות הקבועים מוגנים מפני אור ב-4 מעלות צלזיוס (יציב עד שבוע או יותר).
4. הדמיה חיה
   הערה: החל כל שיטת רכישה וניתוח תמונה מועדפת בשלב זה.
   1. טען את הצלחת במיקרוסקופ בעל תכולה גבוהה. הפעל לוחית בדיקה ראשונית כדי לייעל ולשמור פרמטרי הדמיה, כולל הגדלה, מיקוד, זמני חשיפה (Hoechst ו-FITC) ומרווחים לפני הפעלת דגימות ניסיוניות. שמור את הפרמטרים לטעינה מחדש עם כל צלחת שלאחר מכן.
      הערה: לניתוח כמותני, הגדר את זמן החשיפה למטען היבוא הפלואורסצנטי (FITC) הרבה מתחת לרוויה במצב יציב או לנקודת הזמן העדכנית ביותר לשימוש. קבע זאת באמצעות לוחית הבדיקה, תוך התמקדות ברוויה חצי מקסימלית כדי לאפשר שינויים בעוצמה על פני תנאי הניסוי. אסוף את תמונות Hoechst עבור כל מסגרת ונקודת זמן כדי לאפשר זיהוי גרעיני במהלך ניתוח אוטומטי לאחר מכן.
   2. כוונן את היסט המיקוד, במידת הצורך, באמצעות Hoechst כאורך גל המיקוד והפעל את פרוטוקול ההדמיה. אסוף את התמונות כל 5 דקות למשך 30 דקות. התאם את המרווח וזמן התגובה לפי הצורך על סמך מהירות ההדמיה והקינטיקה של תגובת הייבוא המעניינת.

5. ניתוח תמונות

1. בתיבת הדו-שיח של לוחית סקירת המיקרוסקופ, פתח תמונות Hoechst ו-FITC ממסגרת מייצגת. תחת הכרטיסיה הפעל ניתוח , בחר מודול Translocation-Enhanced וקבע את תצורת ההגדרות. הגדר את Hoechst כתמונת התא ואת FITC כתמונת בדיקת הטרנסלוקציה.
2. מתחת לתאים, התאם את רוחב הגרעין המשוער, העוצמה מעל הרקע המקומי והשטח המינימלי/מקסימלי. הפעל תאי מגע נפרדים אוטומטיים מכיוון שהנוירונים נוטים להתקבץ. הצג תוצאות על-ידי בחירה באפשרות הפעלת בדיקה. התאם את ההגדרות כדי למקסם את הדיוק של זיהוי גרעיני עצב תוך הגבלת הכללה שגויה של גרעינים או פסולת שאינם עצביים.
   הערה: זיהום גליה, אם קיים, בדרך כלל ניתן לשלול בשלב זה על סמך גודל הגרעין. קביעת הגדרות זיהוי תא אופטימליות היא פשרה בין דיוק למספר התא ויש להגדיר אותה באופן אמפירי בהתאם לבדיקה, סוג התא וצפיפות התרבית. פרמטרים מחמירים ישמיטו תאים רבים אך יכללו פחות שגיאות, בעוד שפרמטרים ליברליים יהיו כוללניים יותר אך יכילו יותר שגיאות. אם נכללות אוכלוסיות תאים שונות (כלומר מוטציות מחלה) או טיפולים שעשויים להשפיע על גודל הגרעין, אנו ממליצים להגדיר פרמטרים של גודל/עוצמה רחבים מספיק כדי להתאים לכל התנאים כדי למנוע את הצורך בקבוצות פרמטרים מרובות בניסוי.
3. כדי להימנע מחפצים מהקצה הגרעיני, הגדר אזורי מדידה מספר פיקסלים בתוך ומחוץ לקצה התא המוגדרים על ידי צביעת הוכסט. בהתאם להגדלה ולשילוב, קבעו 2-4 פיקסלים למרחק האזור הפנימי, ו-1-2 פיקסלים למרחק האזור החיצוני. התאם את רוחב האזור החיצוני (1-2 פיקסלים).
4. בחר את שיטת הערכת הרקע הרצויה (ברירת המחדל של קבוע אוטומטי מומלצת). בהגדרת יומן נתונים, בחר את פרמטרי הפלט הרצויים, כולל עוצמה פנימית ממוצעת, עוצמה חיצונית ממוצעת ועוצמה ממוצעת פנימית/חיצונית (יחס גרעיני לציטופלזמי (N/C). שמור את פרמטרי הניתוח.
   הערה: מומלץ מאוד לכלול בקרות חיוביות ושליליות פנימיות בכל ניסוי כדי להבטיח שהפרמטרים ימקסמו את הרגישות לזיהוי האירוע הביולוגי המעניין.
5. השתמש בתיבת הדו-שיח Plate Utilities כדי להפעיל ניתוח על הלוחות הרצויים באמצעות הפרמטרים השמורים ולייצא את המדידות.
6. סקור וסכם את הנתונים לפי מצב הטיפול. אפשרות: החל מסננים כדי להסיר נתונים לא פיזיולוגיים, כגון עוצמת בדיקה = 0 וקיצוניות של יחס N/C (כלומר, <0.1 ו->100). החל באותה מידה את כל המסננים בכל התנאים והניסויים.
7. כתיקון נוסף לפלואורסצנטיות הבסיסית, נרמל את הנתונים לבארות הבקרה בהן הושמטו ליזאט ו-ER. כדי להקל על השוואות בין שכפולים ביולוגיים (כלומר, תכשירים עצמאיים של תרבית עצבית), בטא את נתוני הייבוא הגרעיני הסופיים כאחוז מהזמן 0.

חדירות סלקטיבית של קרום הפלזמה (איור 1A) היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול ויש לאמת אותה לפני שתמשיך בניתוח היבוא הגרעיני. בשל הבדלים בין כל תכשיר תרבית, לוחית טיטרציה ראשונית מופעלת באופן שגרתי כדי לזהות את הריכוזים האופטימליים והספציפיים לאצווה של מאגר Tri...

הפרוטוקול המפורט לעיל מספק שיטה אמינה וניתנת לשחזור לחדירה סלקטיבית של קרום הפלזמה של נוירונים ראשוניים בקליפת המוח של העכבר לניתוח יבוא גרעיני. כאן מוצג יישום של השיטה לניתוח יבוא גרעיני של מטען β יבוא ישיר (רנגו), אך ניתן להשתמש באותה גישה כדי לנתח את היבוא הפסיבי והאק?...

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי NINDS K08NS104273 (ל-L.R.H).