Saggi di trasporto nucleare in neuroni corticali di topo permeabilizzati

Abbiamo sviluppato un metodo affidabile di permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica dei neuroni corticali primari di topo per l'analisi automatizzata ad alto contenuto del trasporto nucleocitoplasmatico neuronale.

L'interruzione del trasporto nucleocitoplasmatico è sempre più implicata nella patogenesi delle malattie neurodegenerative. Inoltre, vi è un crescente riconoscimento delle differenze cellulo-specifiche nella struttura complessa dei pori nucleari, che richiede la necessità di adattare i metodi di trasporto nucleare per l'uso nei neuroni. I saggi cellulari permeabilizzati, in cui la membrana plasmatica è perforata selettivamente dalla digitonina, sono ampiamente utilizzati per studiare il trasporto nucleare passivo e attivo in linee cellulari immortalizzate, ma non sono stati applicati alle colture neuronali. Nei nostri tentativi iniziali, abbiamo osservato la rapida perdita di integrità della membrana nucleare nei neuroni corticali primari di topo esposti anche a basse concentrazioni di digitonina. Abbiamo ipotizzato che le membrane nucleari neuronali possano essere particolarmente vulnerabili alla perdita del supporto citoplasmatico. Dopo aver testato diversi approcci per migliorare la stabilità nucleare, abbiamo osservato un'integrità nucleare ottimale dopo lisi ipotonica in presenza di un cuscinetto di albumina sierica bovina concentrato. I nuclei neuronali preparati con questo approccio importano in modo affidabile carichi fluorescenti ricombinanti in modo dipendente dall'energia, facilitando l'analisi dell'importazione nucleare mediante microscopia ad alto contenuto con analisi automatizzata. Prevediamo che questo metodo sarà ampiamente applicabile agli studi sul trasporto nucleare passivo e attivo nei neuroni primari.

L'interruzione del trasporto nucleocitoplasmatico, il traffico regolato di proteine e RNA tra il nucleo e il citoplasma, è sempre più implicata nella patogenesi delle malattie neurodegenerative (recentemente rivisto¹). Noi e altri abbiamo riportato l'interruzione strutturale e funzionale dell'apparato di trasporto nucleocitoplasmatico in tessuti post mortem e modelli animali di sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e demenza frontotemporale (FTD) C9orf72, malattia di Alzheimer e malattia di Huntington 2,3,4,5 . I meccanismi e le conseguenze funzionali dell'interruzione del trasporto nucleocitoplasmatico per la neurodegenerazione e gli approcci per il salvataggio terapeutico sono aree di ricerca in corso.

I pori nucleari sono grandi complessi transmembrana di ~30 proteine nucleoporine che consentono la diffusione di piccole molecole attraverso la membrana nucleare, ma limitano sempre più il passaggio dei carichi >40 kD attraverso una barriera di permeabilità delle nucleoporine ricche di fenilalanina-glicina (FG) nel canale centrale⁶. Carichi più grandi contenenti sequenze di segnale di localizzazione nucleare (NLS) o segnale di esportazione nucleare (NES) subiscono un trasporto attivo, mediato dal recettore, attraverso il poro attraverso i recettori di trasporto nucleare (importine ed exportine) e un ripido gradiente della piccola GTPasi attraversa la membrana nucleare (recentemente rivisto⁷). È stata sviluppata un'ampia gamma di metodi per analizzare le dinamiche di trasporto nucleare nelle cellule in coltura, tra cui il traffico di carichi endogeni e costrutti reporter marcati che fungono da substrati per le principali sottoclassi di recettori di trasporto. Tali approcci sono stati prontamente adattati ai neuroni ^2,5,8 e forniscono una lettura delle perturbazioni del trasporto nucleare nel contesto di una cellula vivente intatta. Tuttavia, nei saggi su cellule vive, la capacità di manipolare direttamente le reazioni di trasporto nucleare o di studiarle isolatamente da altri processi cellulari è limitata.

Nei saggi cellulari permeabilizzati, la membrana plasmatica viene perforata selettivamente e il citoplasma viene rilasciato, lasciando intatti l'involucro nucleare e i complessi dei pori nucleari e in grado di eseguire un trasporto bidirezionale passivo o dipendente dall'energia ^9,10. Tali reazioni di trasporto possono essere facilmente ricostituite aggiungendo lisati di intere cellule, frazioni citoplasmatiche o proteine di trasporto nucleare ricombinanti purificate e i loro carichi. Pertanto, i saggi cellulari permeabilizzati consentono un'ampia gamma di indagini biochimiche o biofisiche, inclusa la somministrazione di proteine e RNA ricombinanti o sintetici rilevanti per lo studio delle malattie neurodegenerative.

Dati i rapporti di differenze cellulo-specifiche nella struttura del complesso dei pori nucleari e nelle dinamiche di trasporto^11,12, abbiamo mirato ad adattare il saggio di cellule permeabilizzate per l'uso in colture neuronali primarie. Sebbene ampiamente utilizzato per analizzare il trasporto nucleare in linee cellulari immortalizzate, nonostante l'esaustiva ricerca in letteratura, non abbiamo trovato rapporti pubblicati sulla permeabilizzazione della membrana plasmatica neuronale che verificassero la conservazione dell'integrità della membrana nucleare. La maggior parte dei protocolli si basa sulla digitonina, un detergente che agisce sulla composizione unica del colesterolo della membrana plasmatica, per perforare la membrana nucleare lasciando intatta la membrana nucleare¹³. I nostri tentativi iniziali di utilizzare la digitonina nei neuroni corticali primari di topo hanno mostrato un'immediata perdita di integrità della membrana nucleare, evidenziata dalla diffusione di un destrano fluorescente da 70 kD nel nucleo. Abbiamo ipotizzato che la rottura dell'involucro nucleare potesse essere causata da perturbazioni meccaniche dovute alla perdita del supporto citoplasmatico e abbiamo testato diversi metodi di ottimizzazione, tra cui l'affollamento molecolare, la stabilizzazione citoscheletrica e metodi alternativi di lisi cellulare. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo di rapida permeabilizzazione ipotonica utilizzando un cuscinetto concentrato di albumina sierica bovina (BSA) per proteggere i nuclei neuronali e facilitare l'analisi a valle dell'importazione nucleare neuronale. Recentemente abbiamo utilizzato questo metodo per valutare il meccanismo di distruzione della proteina ripetuta dipeptidica in C9orf72-ALS/FTD¹⁴ e prevediamo che sarà ampiamente applicabile a futuri studi sul trasporto nucleare passivo e attivo nei neuroni primari.

In primo luogo, il protocollo descrive la generazione di colture neuronali primarie (fase 1) e la preparazione dei materiali per il test di trasporto (fase 2), seguita dal test di trasporto vero e proprio (fasi 3-4) e dall'acquisizione e analisi delle immagini (fase 5). Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee (ACUC) della Johns Hopkins University.

1. Colture primarie di neuroni corticali di topo

1. Preparare le soluzioni stock.
   1. Tampone di dissezione: combinare 50 mL di 10x HBSS, 15 mL di glucosio 1 M (in dH₂O), 5 mL di 1 M HEPES, 5 mL di 100 mM di piruvato di sodio e 5 mL di 100x penicillina-streptomicina. Portare il volume a 500 mL con dH₂O. Filtro sterile e conservare a 4 °C.
   2. Papaina: diluire la papaina a 30 mg/mL con tampone di dissezione. Conservare a 4 °C.
   3. DNasi: Diluire la DNasi I a 10 mg/mL con tampone di dissezione. Aliquotare e conservare a -20 °C.
   4. Mezzo di placcatura: aggiungere il 5% di siero fetale bovino (FBS), il 2% di B-27, l'1% di glutamax e l'1% di penicillina-streptomicina al terreno neurobasale. Filtrare in modo sterile e conservare a 4 °C.
   5. Terreno di alimentazione: Aggiungere il 2% di B-27, l'1% di glutamax e l'1% di penicillina-streptomicina al terreno neurobasale. Conservare a 4 °C.
2. Rivestire i piatti.
   1. Rivestire le piastre a 96 pozzetti con fondo in vetro ottico con poli-D-lisina (20 μg/mL) e laminina (1:100) in dH₂O. Collocare la piastra in un incubatore per una notte.
   2. Il giorno della dissezione, sciacquare i pozzetti tre volte con dH₂O sterile e sostituirli con un mezzo neurobasale. Equilibrare in un'incubatrice per almeno 30 minuti.
3. Sezionare e digerire le cortecce corte.
   NOTA: Eseguire la dissezione su un banco pulito utilizzando strumenti autoclavati per prevenire la contaminazione della coltura.
   1. Eutanasia della femmina incinta E15-16 C57BL/6J mediante lussazione cervicale. Spruzzare l'addome con etanolo al 70%. Lavora velocemente. Usa forbici e pinze dentate per praticare un'incisione addominale sulla linea mediana, asportare l'utero e quindi trasferire gli embrioni dal sacco amniotico in una capsula di Petri. Decapitare gli embrioni con le forbici e raccogliere le teste in una capsula di Petri di 10 cm contenente un tampone di dissezione.
   2. Sotto un microscopio da dissezione, usa una pinza fine per rimuovere il cranio e staccare le meningi. Trasferire i cervelli interi in una capsula di Petri fresca da 10 cm contenente tampone di dissezione. Separare gli emisferi e rimuovere le strutture sottocorticali.
   3. Tritare le cortecce con una lama di rasoio sterile e trasferirle in una provetta conica contenente 5 ml di tampone di dissezione. Aggiungere 100 μL di papaina (30 mg/mL, concentrazione finale 0,6 mg/mL) e 50 μL di DNasi (10 mg/mL, concentrazione finale 0,1 mg/mL). Digerire a bagnomaria a 37 °C per 10 min.
      NOTA: La digestione oltre i 10 minuti è dannosa per la sopravvivenza cellulare.
   4. Rimuovere il surnatante e lavare due volte con 10 ml di terreno di placcatura per arrestare la digestione. Lasciare che il tessuto si depositi per gravità tra un lavaggio e l'altro.
   5. Triturare delicatamente in 2 mL di terreno di placcatura con la pipetta P1000 fino a quando i pezzi di tessuto di grandi dimensioni scompaiono (circa 20 volte). Aggiungere altri 8 mL di terreno di placcatura per portare il volume a circa 10 mL e far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm.
4. Piastra e mantieni i neuroni.
   1. Centrifugare a 200 x g per 5 min. Risospendere le celle in un mezzo di placcatura preriscaldato. Contare le cellule e diluirle a 500.000 cellule/mL nel mezzo di placcatura. Capovolgere delicatamente per miscelare e trasferire in un serbatoio multicanale sterile.
   2. Aspirare il terreno neurobasale dai pozzetti e aggiungere immediatamente 100 μL di cellule per pozzetto con una pipetta multicanale (50.000 cellule/pozzetto). Non lasciare asciugare i pozzetti rivestiti.
   3. Dopo 24 ore di dissezione, sostituire il 50% del terreno con il mezzo di alimentazione. Continuare il 50% di variazione del terreno a giorni alterni fino al giorno 5-7 per eseguire i test in vitro .

2. Preparazione dei componenti del saggio di trasporto nucleare

1. Buffer di trasporto (TRB, adattato da¹⁵)
   1. Per preparare 5x TRB, sciogliere 100 mM HEPES, 550 mM KOAc, 10 mM Mg(OAc)₂, 25 mM NaOAc, 2,5 mM EGTA e 1,25 M saccarosio in dH₂O. Regolare il pH a 7,3 e conservare il tampone a 4 °C.
   2. Il giorno dell'esperimento di trasporto, prepara 1x TRB-BSA. Diluire 5x TRB in dH₂O, aggiungere un cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA, 2 mM di DTT e 50 mg/mL di BSA.
2. Mix di rigenerazione energetica (ERM, adattato da ^9,16)
   1. Per preparare 20x ERM, sciogliere 2 mM di sale di litio ATP, 2 mM di sale di litio GTP, 80 mM di creatina fosfato e 400 U/mL di creatina chinasi in 1x TRB.
   2. Congelare le aliquote monouso a -20 °C.
3. Preparazione di estratto di cellule intere (WCE, fonte di recettori di trasporto e proteine del ciclo di Ran).
   NOTA: A seconda degli obiettivi sperimentali, può essere utilizzato un estratto citoplasmatico o di cellule intere (WCE). Qui, la preparazione di WCE è descritta come utilizzata nei saggi iniziali di trasporto dei neuroni¹⁰.
   1. Coltiva HEK293T cellule fino alla confluenza in quindici piastre di coltura da 150 mm. Staccare con tripsina-EDTA, risospendere in un terreno contenente il 10% di siero fetale bovino per inibire la tripsina e pellettare le cellule a 200 x g per 5 minuti. Risospendere le cellule in 10 mL di 1x TRB ghiacciato con un cocktail di inibitori della proteasi appena aggiunto.
   2. Sonicare su ghiaccio, 3 x 10 impulsi, utilizzando un sonicatore a sonda portatile. Chiarificare per centrifugazione a 14.000 x g per 15 min a 4 °C.
   3. Misurare la concentrazione proteica (obiettivo 8-10 mg/mL) e congelare le aliquote monouso in azoto liquido prima della conservazione a -80 °C.
4. Carico di importazione nucleare ricombinante
   NOTA: Il protocollo di trasporto nelle fasi 3-5 può essere adattato per qualsiasi carico di trasporto nucleare fluorescente, per interrogare la via di trasporto nucleare attiva o passiva di interesse. Qui, il protocollo descrive l'espressione e l'importazione nucleare di Rango (Ran-regulated importin β cargo), che consiste nel dominio di legame dell'importina β dell'importina α1 affiancato dalle proteine fluorescenti CyPet e YPet^14,17. Rango è un sensore versatile che può essere utilizzato sia per FRET che per i saggi di importazione nucleare, dove funziona come importazione diretta β carico.
   1. Trasformare le cellule BL21(DE3) di E. coli con il plasmide Rango (contenente un tag 6-His N-terminale) mediante shock termico come segue. Scongelare un'aliquota di 50 μl di cellule BL21(DE3) su ghiaccio. Combinare con 100-200 ng di plasmide. Mescolare picchiettando la provetta 4-5 volte e poi incubare con ghiaccio per 30 minuti prima di posizionarla su una piastra a 42 °C per 40 s. Trasferire immediatamente di nuovo sul ghiaccio per altri 2-5 minuti.
   2. Aggiungere 900 μL di terreno SOC a temperatura ambiente e incubare su un agitatore a 37 °C per 1 ora prima di distribuire le cellule su una piastra di agar preriscaldata (agar 1,5%, terreno LB, 100 μg/mL di ampicillina). Incubare la piastra per una notte a 37 °C. Conservare la piastra a 4 °C per un massimo di 1 settimana o utilizzarla immediatamente per la produzione di proteine.
   3. Avviare la produzione di proteine inoculando tre 25 mL di colture starter in provette da 50 mL con un numero crescente di colonie (~3-10) dalla piastra BL21(DE3). Dopo l'incubazione notturna a 37 °C su un agitatore, selezionare le colture con OD_{600 nm} < 1,0 per inoculare una coltura da 1 litro in terreno LB utilizzando un pallone Fernbach da 2,8 L privo di deflettori. Crescere a 37 °C fino a raggiungere OD_{600 nm} = 0,1-0,3.
      NOTA: L'uso di vecchie piastre di agar BL21(DE3) LB o di colture starter ad alta densità (OD_{600 nm} >1,0) potrebbe ridurre la resa e la purezza della preparazione proteica.
   4. Raffreddare a temperatura ambiente (22-25 °C) mettendo su ghiaccio. Indurre l'espressione proteica con 0,3 mM di IPTG (concentrazione finale) e incubare su uno shaker (80-120 rpm) a temperatura ambiente per 12-14 ore.
   5. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione (6.000 x g, 15 min, 4 °C) e risospendere in 30 mL di 10 mM di imidazolo ghiacciato in PBS (pH 7,4), integrato con un cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA. Limare in due passaggi attraverso una cella a pressione francese ghiacciata e chiarificare il lisato mediante centrifugazione (16.000 x g, 40 min, 4 °C).
   6. Incubare il lisato con resina di agarosio di affinità al nichel ad alto flusso (30-60 min, 4 °C), utilizzando 1 mL di resina per 1 L di coltura di E. coli . Posizionare la resina nelle colonne cromatografiche, lavare con 10-20 volumi di 10 mM di imidazolo/PBS ghiacciato (pH 7,4). Eluire Rango con incrementi di 25 mM di imidazolo/PBS (25-200 mM, pH 7,4), utilizzando un volume del letto di 5 volte in ogni fase.
   7. Utilizzare SDS-PAGE per selezionare e raggruppare i lotti con la massima purezza.
   8. Preparare il tampone XB sciogliendo 10 mM di HEPES, 100 mM di KCl, 10 mM di CaCl₂, 1 mM di MgCl₂ e 50 mM di saccarosio in dH₂O. Regolare il pH a 7,7.
   9. Dializzare la proteina in tampone XB e concentrarla per centrifugazione (7500 x g, 4 °C) su un dispositivo di ultrafiltrazione con un cutoff di peso molecolare di 30 kD.
   10. Misurare la concentrazione proteica con il metodo Bradford o con un altro metodo preferito e congelare le aliquote monouso in azoto liquido prima di conservarle a -80 °C.

3. Determinazione delle condizioni ottimali di permeabilizzazione della membrana plasmatica

NOTA: A causa delle variazioni tra ogni lotto di neuroni, ottimizzare le condizioni di permeabilizzazione per ogni lotto di neuroni. Eseguire questa operazione lo stesso giorno prima di eseguire i saggi di trasporto nucleare.

1. In una piastra di stadiazione in plastica a 96 pozzetti, preparare una diluizione seriale di Tris-HCl pH 7,5 (per causare rigonfiamento osmotico), a 0 μM, 10 μM, 20 μM e 40 μM in ciascuna delle tre concentrazioni di BSA: 50 mg/mL, 100 mg/mL e 150 mg/mL (per affollamento molecolare/supporto meccanico). Preriscaldare le soluzioni a 37 °C.
2. Sciacquare i neuroni una volta in PBS preriscaldato. Rimuovere il PBS e trasferire Tris/BSA dalla piastra di staging. Ritorna all'incubatrice per 4 min.
3. Togliere dall'incubatrice e posizionare la piastra di coltura sul ghiaccio. Risciacquare 2 x 5 minuti in 1x TRB-BSA (come preparato al punto 2.1.2).
4. Dopo il risciacquo finale, aggiungere 70 kD di destrano marcato con Texas Red (0,6 mg/mL) e Hoechst (1:10.000) in 1x TRB-BSA. Lasciare il piatto sul banco a temperatura ambiente per 15 minuti, al riparo dalla luce.
5. Immagine utilizzando un microscopio confocale per identificare il tampone e la concentrazione di BSA in cui la percentuale di permeabilizzazione della membrana plasmatica è la più alta, ma la membrana nucleare limita ancora l'ingresso del destrano di 70 kD (obiettivo ≥ 80%). Utilizzare queste condizioni per gli esperimenti successivi.

4. Saggio di importazione nucleare

1. Preparare le reazioni di trasporto
   NOTA: Per consentire l'avvio simultaneo di tutte le reazioni nella piastra, preparare la miscela di reazione in una piastra di stadiazione di plastica a 96 pozzetti su ghiaccio, prima della permeabilizzazione dei neuroni. Eseguire un minimo di due repliche tecniche per condizione. Includi i controlli su ogni piastra.
   1. Preparare la miscela di reazione basica composta da 2,5 mg/mL di WCE, 1x ERM, carico fluorescente (200 nM Rango) e Hoechst 33342 (10 mg/mL, 1:10.000) in 1x TRB-BSA, sufficiente per 50 μL per pozzetto. OPZIONE: Includere destrano marcato in rosso Texas da 70 kD per consentire il monitoraggio dell'integrità dei pori nucleari durante la reazione di trasporto, tenendo presente che la microscopia confocale è necessaria per visualizzare l'esclusione del destrano nucleare.
      NOTA: La concentrazione di WCE fornita è un punto di partenza ragionevole per l'ottimizzazione del saggio. Eseguire test empirici di ciascun lotto di WCE per determinare la concentrazione ottimale richiesta per un'importazione nucleare efficiente del carico desiderato. Evitare di combinare i dati delle repliche preparate con diversi batch di WCE poiché l'efficienza delle importazioni può variare.
   2. Preparare i controlli, tra cui (1) solo carico: Rango, ma non WCE o ERM e (2) Inibitore: carico fluorescente, ERM, WCE e 100 μM importazolo (IPZ, una piccola molecola inibitrice dell'importina β¹⁸). Come inibitore alternativo, utilizzare 0,8 mg/mL di agglutinina del germe di grano (WGA)¹⁹.
      NOTA: Equilibrare gli inibitori nella miscela di saggio contenente WCE per almeno 30 minuti prima di iniziare il trasporto. Per la massima inibizione, le fasi di risciacquo post-permeabilizzazione nei pozzetti corrispondenti dovrebbero includere anche l'inibitore.
2. Permeabilizzare e risciacquare i neuroni
   1. Permeabilizzare i neuroni secondo il protocollo ottimale e specifico per lotto identificato nella fase 3.
   2. Rimuovere la piastra di coltura dall'incubatrice e posizionarla immediatamente sul ghiaccio. Risciacquare 2 volte per 5 minuti in 1 TRB-BSA. Includere un inibitore nei risciacqui per i pozzetti designati.
3. Eseguire la reazione di trasporto.
   1. Dopo l'ultimo risciacquo, rimuovere 1x TRB-BSA. Lavorando rapidamente, utilizzare una pipetta multicanale (50 μL/pozzetto) per trasferire le reazioni di trasporto premiscelate sulle cellule permeabilizzate.
   2. Caricare immediatamente la piastra in un microscopio ad alto contenuto a temperatura ambiente per avviare l'imaging time-lapse (vedere il passaggio 4.4) o posizionare la piastra sul banco, al riparo dalla luce, e lasciare che la reazione proceda per il periodo di tempo desiderato (ad esempio, 30-120 minuti) prima della fissazione e dell'imaging.
   3. Se lo si desidera, fissare in paraformaldeide/PBS al 4% per 15 minuti, risciacquare 2 volte per 5 minuti in PBS e trasferire al 50% di glicerolo/PBS per l'imaging successivo. Mantenere le piastre fisse al riparo dalla luce a 4 °C (stabili fino a 1 settimana o più).
4. Imaging dal vivo
   NOTA: Applicare qualsiasi metodo di acquisizione e analisi delle immagini preferito in questa fase.
   1. Caricare la piastra in un microscopio ad alto contenuto. Eseguire una piastra di prova iniziale per ottimizzare e salvare i parametri di imaging, tra cui ingrandimento, messa a fuoco, tempi di esposizione (Hoechst e FITC) e intervalli prima di eseguire i campioni sperimentali. Salva i parametri per ricaricare con ogni piastra successiva.
      NOTA: Per l'analisi quantitativa, impostare il tempo di esposizione per il carico di importazione fluorescente (FITC) ben al di sotto della saturazione allo stato stazionario o dell'ultimo punto temporale da utilizzare. Stabilirlo utilizzando la piastra di prova, mirando a una saturazione semi-massima per consentire variazioni di intensità in condizioni sperimentali. Raccogli le immagini Hoechst per ogni fotogramma e punto temporale per consentire l'identificazione nucleare durante la successiva analisi automatizzata.
   2. Regolare l'offset di messa a fuoco, se necessario, utilizzando Hoechst come lunghezza d'onda di messa a fuoco ed eseguire il protocollo di imaging. Raccogli le immagini ogni 5 minuti per 30 minuti. Regolare l'intervallo e il tempo di reazione in base alle esigenze in base alla velocità di imaging e alla cinetica della reazione di importazione di interesse.

5. Analisi delle immagini

1. Nella finestra di dialogo Piastra di revisione del microscopio, aprire le immagini Hoechst e FITC da un fotogramma rappresentativo. Nella scheda Esegui analisi , selezionare Modulo avanzato per traslocazione e configurare le impostazioni. Impostare Hoechst come immagine del compartimento e FITC come immagine della sonda di traslocazione.
2. Sotto i compartimenti, regolare la larghezza nucleare approssimativa, l'intensità sopra il fondo locale e l'area minima/massima. Attiva i compartimenti di contatto separati automaticamente poiché i neuroni tendono a raggrupparsi. Per visualizzare i risultati, selezionare Esecuzione test. Regolare le impostazioni per massimizzare l'accuratezza dell'identificazione dei nuclei neuronali, limitando al contempo l'inclusione errata di nuclei non neuronali o detriti.
   NOTA: La contaminazione gliale, se presente, può essere tipicamente esclusa in questa fase in base alle dimensioni nucleari. La determinazione delle impostazioni ottimali di identificazione del compartimento è un compromesso tra accuratezza e numero di cellule e deve essere impostata empiricamente in base al saggio, al tipo di cellula e alla densità di coltura. I parametri rigorosi ometteranno numerose celle ma includeranno meno errori, mentre i parametri liberali saranno più inclusivi ma conterranno più errori. Se sono incluse diverse popolazioni cellulari (ad es. mutanti della malattia) o trattamenti che possono influenzare le dimensioni nucleari, si consiglia di impostare parametri di dimensione/intensità sufficientemente ampi da adattarsi a tutte le condizioni per evitare la necessità di più set di parametri all'interno di un esperimento.
3. Per evitare artefatti dal bordo nucleare, definire le regioni di misura di diversi pixel all'interno e all'esterno del bordo del compartimento definito dalla colorazione di Hoechst. A seconda dell'ingrandimento e del binning, impostare 2-4 pixel per la distanza della regione interna e 1-2 pixel per la distanza della regione esterna. Regola la larghezza della regione esterna (1-2 pixel).
4. Selezionare il metodo di stima dello sfondo desiderato (si consiglia l'impostazione predefinita Costante automatica ). In Configura registro dati, selezionare i parametri di output desiderati, tra cui l'intensità interna media, l'intensità esterna media e l'intensità media interna/esterna (il rapporto nucleare/citoplasmatico (N/C)). Salvate i parametri di analisi.
   NOTA: L'inclusione di controlli interni positivi e negativi all'interno di ogni esperimento è fortemente incoraggiata per garantire che i parametri massimizzino la sensibilità per rilevare l'evento biologico di interesse.
5. Utilizzare la finestra di dialogo Utilità piastra per eseguire l'analisi sulla piastra o sulle piastre desiderate utilizzando i parametri salvati ed esportare le misurazioni.
6. Rivedere e riassumere i dati in base alla condizione di trattamento. OPZIONE: Applicare filtri per rimuovere dati non fisiologici, come l'intensità della sonda = 0 e gli estremi del rapporto N/C (ad esempio, <0,1 e >100). Applica allo stesso modo tutti i filtri in tutte le condizioni e gli esperimenti.
7. Come ulteriore correzione per la fluorescenza basale, normalizzare i dati ai pozzetti di controllo in cui il lisato e l'ER sono stati omessi. Per facilitare i confronti tra repliche biologiche (cioè preparazioni di colture neuronali indipendenti), esprimere i dati finali di importazione nucleare come percentuale del tempo 0.

La permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica (Figura 1A) è la fase più critica del protocollo e deve essere verificata prima di procedere con l'analisi dell'importazione nucleare. A causa delle variazioni tra le diverse preparazioni di coltura, viene eseguita di routine una piastra di titolazione iniziale per identificare le concentrazioni ottimali e specifiche per lotto di tampone Tris-HCl ipotonico e cuscinetto BSA, come descritto nella fase...

Il protocollo sopra descritto fornisce un metodo affidabile e riproducibile per permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica dei neuroni corticali primari di topo per l'analisi dell'importazione nucleare. Qui viene mostrata un'applicazione del metodo per l'analisi dell'importazione nucleare di un carico β importazione diretta (Rango), ma questo stesso approccio può essere utilizzato per analizzare l'importazione passiva e attiva di un'ampia gamma di carichi fluorescenti. La pe...

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto da NINDS K08NS104273 (a L.R.H.).